Отбор и обработка проб фитопланктона на определение хлорофилла

 

                      

 

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

 

«САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ»

__________________________________________________________________

 

Кафедра охраны окружающей среды и рационального использования природных ресурсов

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РЕФЕРАТ НА ТЕМУ:

 

Отбор и обработка проб фитопланктона на определение хлорофилла

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнила:  Борисова Е.А, гр.831

 

Проверил:   проф. Шишкин А.И.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Санкт-Петербург

2015 г.

 

 

 

 

 Введение………………………………………………………………………..................3

1.   Фотосинтетические пигменты. Хлорофилла…………………....…………….……4

1.1. Определение хлорофилла “а”………………………………………………..............5

1.2. Расчет содержания хлорофилла…………………………………...............................8

2.Первичная продукция и деструкция органического вещества……….........................9

2.1. Кислородный режим…………………………………………………………….…10

2.2. Кислородная модификация метода склянок ……………………………………...11

2.3.Радиоуглеродный метод определения первичной продукции (модификация метода склянок) …………………………………………………………………….......................12

2.4. Определение первичной  продукции и деструкции  органического вещества……………………………………………………………………………..…....12

2.5. Расчет первичной продукции и деструкции органического вещества……………………………………………………………………….………….13

Заключение ……………………………………………………………………………....15

Список используемой литературы…………………………………………………..…....16

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Мониторинг окружающей природной среды представляет собой систему регулярных длительных наблюдений, дающих информацию о состоянии окружающей среды с целью оценки прошлого, настоящего и прогноза в будущем параметров окружающей среды. Основными функциями мониторинга являются: контроль качества воды водных объектов, атмосферного воздуха, почвы и т.д. Так же функциями мониторинга является определение основных источников загрязнения и прогнозирование состояния качества основных компонентов.

По мере освоения гидросферы возрастала роль научных исследований состояния и развития водных экосистем. Десятки лет специалистами велось и ведется изучение видового состава всех живых обитателей различных типов водоемов, а также многообразия отношений между ними. Такие исследования ведутся специалистами-гидробиологами и относятся к задачам науки гидробиологии (от греч. hydro – вода, bios – жизнь, logos – наука). Экологическая гидробиология изучает взаимоотношения обитателей водоемов – гидробионтов и различных популяций друг с другом и с неживой природой.

Гидробиологичекий мониторинг включает в себя мониторинг по следующим основным показателям: хлорофиллу «а», первичной продукции и деструкции органического вещества.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Фотосинтетические пигменты. Хлорофилл “а”

 

Способность растений осуществлять фотосинтез связана с наличием у них пигментов. Главнейшим из них является магнийсодержащий порфириновый пигмент — хлорофилл.

В природе встречается пять разных типов хлорофилла, которые незначительно различаются по своей молекулярной структуре. Хлорофилл а присутствует у всех водорослей и высших растений; хлорофилл b — у зеленых, харовых и эвглеповых и у высших растений; хлорофилл с — у бурых водорослей, золотистых, диатомей и динофлагеллат; хлорофилл d — у красных водорослей; хлорофилл е обнаружен лишь однажды, по-видимому, это хлорофилл с; наконец, различные виды бактериохлорофилла — у фотосинтезирующих бактерий. Для синезеленых и красных водорослей характерно наличие билипротеинов: фикоцианина и фикоэритрина. Наиболее хорошо изучен хлорофилл а. Молекула его состоит из четырех пиррольных колец, с азотом которых связан атом магния, а к одному из колец присоединен одноатомный ненасыщенный спирт фитол.

Молекула хлорофилла встроена в мембрану — погружена гидрофобной фитольной цепью в ее липидную часть. Чистый раствор хлорофилла а имеет максимум поглощения при 663 нм. В интактной, неповрежденной, нормально функционирующей клетке хлорофилл характеризуется еще максимумами поглощения при 672 и 683 нм. Высокая эффективность поглощения света хлорофиллами обусловлена наличием в их молекуле большого числа сопряженных двойных связей.

 

 

 

Большинство выделяющих кислород фотосинтезирующих клеток содержат два разных хлорофилла, одним из которых всегда является хлорофилл а; другим же, как видно из таблицы, у разных растений являются разные хлорофиллы (b, с, d); в некоторых случаях вместо второго хлорофилла в клетке содержатся билипротеины. Дополнительными рецепторами световой энергии являются также входящие в состав фотосинтетических мембран желтые пигменты — каротиноиды. Они отличаются от хлорофилла по положению максимумов поглощения и используют непоглощаемую хлорофиллом часть видимого спектра. Предполагают также, что каротиноиды выполняют защитную функцию, предотвращая распад хлорофилла под действием молекулярного кислорода.

 

1. Определение хлорофилла “а”

Через количество фотосинтезируюшего пигмента - хлорофилла, способного переизлучать поглощенную энергию света, то есть флуоресцировать, можно определить численность фитопланктона. Измеряя флуоресценцию фитопланктона, можно рассчитать концентрацию хлорофилла у микроводорослей трех основных таксонов: сине-зеленых, диатомовых и зеленых, обладающих различиями пигментного аппарата и спектров возбуждения флуоресценции.

Измерения проводятся как в лаборатории, на экспериментальных культурах водорослей, так и на водоемах, в полевых условиях.

 Свойство хлорофилла “a” и его предшественников к флуоресцентной эмиссии позволяет идентифицировать эти зеленые пигменты и охарактеризовать их в комплексной среде. Флуоресцентный метод может существенно помочь в определении и быстрой характеристике флуоресцирующих пигментов (таких, как хлорофиллы) среди нефлуоресцирующих (каротиноиды) без какого-либо разделения на компоненты. Флуоресценция также испускается фикоцианинами и фикоэритринами. Очень слабая флуоресценция была приписана каротиноидам in vitro.

Молекула пигмента, для излучения максимального сигнала флуоресценции, полностью возбуждена излучением, которое поглощается в наибольшей степени: хлорофиллы, которые имеют две полосы поглощения, обычно облучались, синим светом (так как возбуждение красной областью спектра будет смешиваться со слишком близкими полосами эмиссии). Интенсивность флуоресценции определяется температурой , pH и находится под значительным влиянием процессов транспорта энергии и примесей, особенно неорганических соединений.

 

Рис.1. Спектр флуоресценции

Зеленый цвет - спектр поглощения хлорофилла, красный - спектр флуоресценции.

 

Максимумы поглощения хлорофилла находится в красной и сине-фиолетовой области спектра, а флуоресценция происходит лишь в красной. Это связано с электронными переходами. Её спектральная линия как бы зеркально перевернута и сдвинута в длинноволновую сторону (рис.1.) [6]

 Флуоресцентный метод, от большинства стандартных гидробиологических методов исследования отличается более высокой точностью и меньшей трудоемкостью, что позволяет уменьшить время обработки пробы фитопланктона. Это предоставляет возможность проводить экспресс-анализ состояния водных экосистем, создавая большие массивы данных для проведения систематических исследований в течении многих лет. Объектами исследования, кроме экстракта пигментов, служат живые клетки водорослей (in vivo), что позволяет судить о физиологическом состоянии фитопланктона, важнейшего звена в природных экосистемах.

Обычно используется погружной флуометр.

Измеряют вертикальные профили температуры, подводную освещенность, обилие (по Fo) и фотохимическую активность РЦ ФС 2 (по Fv/Fm), по которым строят пространственные разрезы указанных характеристик. Обилие фитопланктона выражают в единицах концентрации хлорофилла (Хл*), предварительно откалибровав в лабораторных условиях выход сигнала Fo по концентрации хлорофилла а, а также проводят анализы горизонтального распределения параметров флуоресценции фитопланктона в верхнем перемешиваемом слое.

Теоретически в определённом диапазоне концентраций пигментов величина интенсивности флуоресценции пропорциональна их концентрации:

                                (1)

   Где К - коэффициент пропорциональности, соответствующий флуоресценции единицы вещества (принято называть удельным выходом).

Са –концентрация компонента а.

Удельный выход флуоресценции зависит от состояния электрон-транспортной  цепи фотосинтеза и может быть заметно снижен за счет отвлечения части поглощенной энергии на фотохимические реакции. При действии симазина (1*10-5 М) выход флуоресценции достигает максимального значения, а возможность ошибки из-за различий физиологического состояния водорослей снижается.

Диапазон длин волн возбуждающего света  выбирается исходя из специфических отличий спектров действия флуоресценции у представителей отдельных  таксономических групп водорослей.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Высокая стабильность величин удельных выходов объясняется, вероятно, тем, что генетическая детерминация таксономических различий в структуре таксономического аппарата выше, чем фенотипические изменения внутри отдельной группы. Кроме того, высокая стабильность коэффициентов может быть связана с реализацией принципа поведения водорослей, как самонастраивающейся системы. Значительные изменения удельных выходов (не зависящих от физиологического состояния водорослей) могут определяться, в основном, нарушениями фотосинтетического аппарата. Однако, если какие-то факторы вызывают данные изменения, то они в конце концов приведут к эллиминации "дефектных" видов и их заменяют виды с нормальной организацией аппарата, со своим довольно устойчивым выходом. Адаптация системы заключается не в том, что накапливаются виды с деформированной организацией фотосинтетического аппарата, а в том, что за счет сукцесии доминирующими становятся другие таксоны.

 

2.    Расчёт содержания хлорофилла

 

Величины сигналов флуоресценции Фл400(чист.), Фл510(чист.), Фл540(чист.) подставляют в левую часть системы линейных уравнений:

     Фл400(чист.) = Кс-з(400) * Сс-з + Кд(400) * Сд + Кзел(400) * Сзел                          (1) 
Фл10(чист.) = Кс-з(510) * Сс-з + Кд(510) * Сд + Кзел(510) * Сзел                  (2)   
    Фл540(чист.) = Кс-з(540) * Сс-з + Кд(540) * Сд + Кзел(540) * Сзел                 (3)

где Кс-з- флуоресценции сине-зелёных водорослей.

 Кд - флуоресценции диатомовых водорослей.

Кзел - флуоресценции зелёных водорослей

При возбуждении флуоресценции светом определённой спектральной области (400, 510, 540 нм ),

С - концентрация хлорофилла “а” по каждому из отделов;

нижний индекс - длина волны максимумов спектральных областей  возбуждающего света, [мг/м3].

Решая систему относительно Са, находят количественное содержание пигмента в водорослях каждого из указанных отделов. Если в ходе решения получены отрицательные значения Са, их принимают равными 0.  Общее содержание хлорофилла “а” в пробе определяют как сумму концентраций пигмента в клетках водорослей трёх отделов.

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Первичная продукция и деструкция органического вещества

Одновременное увеличение первичной продукции и видового разнообразия фитопланктона является надежным показателем экологического прогресса. Активное антропогенное воздействие ведет к увеличению первичной продукции и сокращению видового разнообразия фитоценоза.

При оценке состояния водной среды продукционно – деструкционные параметры растительных сообществ имеют ряд преимуществ по сравнению с другими показателями. Растительные организмы быстро реагируют первичной продукцией и деструкцией на изменения условий водной среды.

Первичная продукция – это продукция органического вещества, образованного растительными клетками в процессе фотосинтеза. Органическое вещество при этом становится пищей для животных организмов разных трофических уровней. Таким образом, уровень первичной продукции определяет уровень биологической продуктивности водоема в целом. Деструкция – процесс разложения органического вещества, то есть процесс, противоположный фотосинтезу.

Первичная продукция и деструкция являются также важными характеристиками состояния водоема в плане оценки качества воды. Интенсивное продуцирование органического вещества при массовом развитии фитопланктона приводит к эвтрофированию водоемов.

Первичная продукция - результат жизнедеятельности растительных организмов - характеризует итог процесса фотосинтеза, в ходе которого органическое вещество синтезируется из минеральных компонентов окружающей среды. Таким образом, первичная продукция представляет собой массу новообразованного органического вещества за определенный период времени. Мерой первичной продукции является скорость новообразования органического вещества.

Почти с самого начала изучения первичной продукции исследователи различали «валовую первичную продукцию» (англ.: Gross Primary Production - GPP) и «чистую первичную продукцию» (англ.: Net Primary Production - NPP). Валовая продукция – это общее количество органического вещества, образованного организмом-продуцентом, а чистая продукция – это валовая продукция за вычетом трат самого продуцента на дыхание. Иными словами: NPP = GPP – R, где R – траты на дыхание. Реальный прирост массы продуцентов – это и есть чистая первичная продукция. Именно это вещество и может использоваться потребителями, именно оно и создает основу для поддержания всей трофической цепи.

В настоящее время гидробиология не располагает безупречной методикой измерения первичной продукции в водной среде и в системе допущений, принятых для расчета различных видов продукции, есть много неточностей, свидетельствующих о наличие практически непреодолимых трудностей, связанных с объективной сложностью природных экосистем. Вследствие этого, все получаемые оценки продукции следует считать приближенными и даже ориентировочными.

 

1.   Кислородный режим

 

Кислород постоянно присутствует в растворенном виде в поверхностных водах. Содержание растворенного кислорода (РК) в воде характеризует кислородный режим водоема и имеет важнейшее значение для оценки его экологического и санитарного состояния. Кислород должен содержаться в воде в достаточном количестве, обеспечивая условия для дыхания гидробионтов. Он также необходим для самоочищения водоемов, т.к. участвует в процессах окисления органических и других примесей, разложения отмерших организмов. Уменьшение количества кислорода отрицательно сказывается на ходе биохимических процессов в водоеме. Потребление кислорода обусловлено также химическими процессами окисления содержащихся в воде примесей, а также дыханием водных организмов.

Сравнительно легкое и быстрое окисление органического вещества и является причиной резких суточных колебаний в количестве растворенного в воде кислорода.

Процесс потребления кислорода на окисление органических загрязнений в водоемах сопровождается систематическим пополнением его количества, за счет растворения, через поверхность зеркала воды, т. е. путем реаэрации. Одновременно с реаэрацией пополнение запасов кислорода происходит при помощи фотосинтеза в процессе усвоения углерода из находящейся в воде водоема растворенной углекислоты зелеными водными растениями на свету с выделением свободного кислорода.

 

Растворимость его в воде более высокая из-за парциального давления, которое выше атмосферного. Процесс фотосинтеза, являясь очень сложным, находится в зависимости от ряда факторов, усиливающих или угнетающих его. Поступление кислорода в воду водоема в летний и осенний периоды бывает настолько значительным (1,26—10,04 г/м3 в сутки), что фотосинтез играет главную роль в насыщении воды водоема кислородом в эти периоды. Однако фотосинтез не является постоянным источником насыщения воды кислородом, так как действие его преимущественно в летний и осенний периоды и поэтому он не может приниматься в расчет годового баланса кислородного режима водоема.

Растворение кислорода в воде водоема характеризуется уравнением:

 (1)

где Dt — дефицит кислорода в воде водоема через t суток, мг/л;

Da — начальный дефицит кислорода  в воде, мг/л;

k2 — константа реаэрации кислорода  в воде, зависящая от условий  и скорости перемешивания воды, формы потока, скорости течения, температуры воды 

 

 

 

 

2.   Кислородная модификация метода склянок

 

Первоначально, широко распространенным и традиционным методом определения первичной продукции фитопланктона являлась кислородная модификация метода склянок. Кислородный метод определения первичной продукции (ПП) основан на измерении количества выделенного в процессе фотосинтеза кислорода, которое пропорционально образовавшемуся органическому веществу. Однако, следует учитывать, что, по-видимому, не существует строгих постоянных соотношений между образованием первичного органического вещества, потреблением углекислоты и выделением кислорода в процессе фотосинтеза. Повышение точности измерений количества поглощенной в процессе фотосинтеза углекислоты и выделенного кислорода не повышает надежности оценок ПП органического вещества, т.к. при пересчете значений регистрируемых показателей неопределенность стехиометрических соотношений в балансовом уравнении фотосинтеза не устраняется. Вместе с тем, использование одних и тех же модификаций скляночного метода для определения значений первичной продукции позволяло производить различного рода сопоставления продуктивности фитопланктона в различных районах Мирового океана и оценки состояния природных морских экосистем. В связи с вышеизложенным, значения ПП органического вещества чаще всего выражают в единицах кислорода или единицах углерода, при этом возможен перевод одних показателей в другие.

Однако следует сделать вывод, что кислородный метод измерений первичной продукции органического вещества менее чувствителен по сравнению с используемой практически повсеместно радиоуглеродной модификацией метода склянок. Тем не менее, он хорошо зарекомендовал себя для исследований проводимых мезо- и эвтрофных районах моря, однако в малопродуктивных (олиготрофных) зонах океана кислородный метод практически неприменим. К несомненным достоинствам этого метода следует также отнести возможность определения как чистой, так и валовой первичной продукции. При этом кислородная модификация метод склянок довольно проста и не требует специально оборудования.

 

 

 

 

 

3.    Радиоуглеродный метод определения первичной продукции (модификация метода склянок)

 

Принцип определения первичной продукции радиоуглеродным методом основан на допущении, согласно которому внесенный в склянки меченый углерод включается в процессы фотосинтеза органического вещества с той же скоростью , что и не меченный изотоп углерода С14. В настоящее время радиоуглеродный метод является наиболее распространенным классическим методом определения первичной продукции (ПП) как в морях, так и в пресных водоемах. Полученная радиоуглеродным методом оценка ПП не может быть безоговорочно отнесена ни к валовой, ни к чистой продукции. Однако, установлено, что при краткосрочных экспозициях склянок (2-4 часа) радиоуглеродный метод дает значения продукции, близкие к валовой, а при длительных (12-24 часа) - близкие к чистой. Следует отметить, что экспозиция склянок в течение суток приемлема только в умеренных и холодных водах при очень низких уровнях фотосинтеза, в тропических и продуктивных водах экспозиция проб не должна превышать 6-10 часов. Определения первичной продукции радиоуглеродным методом осуществляется по стандартной схеме: отбор проб, добавление изотопа, экспозиция, фильтрация и определение радиоактивности фильтров.

В последние годы разработаны и внедрены в практику работ электрохимические методы определения кислорода в воде для оценки ПП на основе погружаемых датчиков. Однако повсеместное внедрения этих приборов в практику работ еще не произошло из-за высокой стоимости систем и отсутствия серийного выпуска отечественной аппаратуры.

 

 

4.   Определение первичной  продукции и деструкции                    органического вещества

 

Отбор продукционно-деструкционных проб следует производить ежемесячно в течение вегетационного периода (с мая по октябрь). Перед работой склянки должны быть тщательно вымыты и высушены. В точке отбора проб измеряется прозрачность воды. Пробы отбираются батометром или ведром с разметочной веревкой до глубины утроенной прозрачности. Берется 1 л с каждого горизонта (горизонтов обычно 6 – через каждые 0,5 м от поверхностного слоя ). Глубина утроенной прозрачности соответствует нижней границе фотического слоя (в котором активно идет фотосинтез), где первичная продукция равна деструкции. Вода с каждого горизонта сливается в ведро по стенке для предотвращения ее насыщения кислородом из воздуха. Затем из смешанной воды заполняются три склянки. Склянки при заполнении должны быть погружены в воду, чтобы исключить попадание в них пузырьков воздуха. Две склянки оставляют на сутки в ведре, погруженном в воду в месте отбора пробы. Причем одну склянку подвешивают на поверхности ведра, чтобы она освещалась солнцем, а другую заворачивают в темный мешок и опускают на дно ведра – туда не должен проникать солнечный свет. В 3-й склянке проба сразу же фиксируется: добавляются поочередно 1 мл MnCl2 и 1 мл щелочного раствора KI. Необходимо пользоваться разными пипетками. При этом в склянке происходит взаимодействие в щелочной среде гидроокиси марганца с растворенным в воде кислородом. На дне склянки образуется осадок из йода, количество которого эквивалентно содержанию растворенного в воде кислорода и учитывается титрованием раствора тиосульфата. Осадок должен отстояться не менее 10 минут, затем в склянку добавляют 5 мл раствора HCl для его растворения. При этом часть жидкости сливается через край, что не имеет значения для определения. Склянку закрывают пробкой и содержимое тщательно перемешивают. Осадок гидроксида марганца, выпавший в щелочной среде, растворяется, окисляет йодид-ион до йода, который окрашивает раствор в желтый цвет. Затем отбирают 50 мл раствора и переносят его в коническую колбу объемом 250 мл. Затем раствор титруют тиосульфатом натрия до светло-желтого цвета, непрерывно помешивая. Далее прибавляют 1 мл 0,5% раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения синей окраски.

Объем тиосульфата, пошедшего на титрование, записывают и далее рассчитывают кислород:

                                                                                                      (1)

Где n – количество тиосульфата, пошедшего на титрование,

N – нормальность тиосульфата с учетом поправки (нормальный раствор – раствор, 1л которого содержит 1 г-экв. растворенного в-ва – 1н.;

г-экв. – количество граммов в-ва, присоединяющее 1г-атом водорода – 1.008г или 0,5г-атома кислорода – 8 г);

8 – эквивалентная масса кислорода,

1000 – пересчет на 1л пробы,

50 – объем раствора. По такой же схеме определяют содержание кислорода через сутки в светлой и темной склянках.

 

 

 

2.5    Расчёт первичной продукции и деструкции органического вещества.

 

 

 

 

(1)

 

где  Р - продукция, [мг орг. в-ва/л сутки],

0.75 - коэффициент пересчёта  из единицы измерения мг О2/л сутки в  единицу измерения мг орг. в-ва/л сутки,

 О2св. – О2т.  - [мг О2/л сутки].

                                              

 

 

Где D – деструкция.

 

(2)

 

 

 

     (3)

 

 Где Р - продукция, [мг орг. в-ва/л сутки],

                           

D – деструкция.

 

 

     (4)

 

где Р - продукция, [мг орг. в-ва/л сутки],

3 – коэффициент прозрачности.

Поскольку источником углерода для автотрофных организмов служит, как правило диоксид углерода СО2 , то первичную продукцию в настоящее время чаще всего оценивают в количестве углерода, связанного за определенное время наземной растительностью или океаническим (озёрным) фитопланктоном в расчете на единицу площади. В случае фитопланктона, характеризующегося высокой скоростью образования органического вещества в расчете на единицу биомассы, первичную продукцию оценивают для небольших промежутков времени, чаще всего для суток.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

Гидробиологические показатели характеризуют :

 

 

 

Хлорофилл a :

 

 

 

 

 

Новообразование органического вещества в водоеме :

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список используемой литературы

1. ГОСТ 17.1.4.02−90 .
2. Руководство по гидробиологическому мониторингу пресноводных экосистем. Под. ред. В.А.Абакумова. СПб.: Гидрометеоиздат, 1992. 318 с.
3. Научные основы контроля качества поверхностных вод по гидробиологическим показателям. Л.: Гидрометеоиздат, 1981. 228 с.
4. Научные основы контроля качества поверхностных вод по гидробиологическим показателям. Л.: Гидрометеоиздат, 1977. 232 с.
5. Общая гидробиология. Константинов А.С.. М.: Высшая школа, 1967. 490 с.
6. Гольд В.М., Гаевский Н.А., Григорьев Ю.С., Попельницкий В.А., Гехман А.В.. Теоретические основы и методы изучения флуоресценции хлорофилла: Учеб. пособие - Красноярск: изд-во КГУ, 1984. - 82 с.
7. А.К.Тыныбеков, Ж.Э. Куленбеков, М.С. Алиев. Экспериментальное измерение фитопланктона оз. Иссык-Куль. Международная научно-техническая конференция «Инновации в образовании, науке и технике». Известия КГТУ. №9. 2006. c. 89-93.
8. Шишкин А.И..Лекции по дисциплине экологический мониторинг.