Типы брожения

Как уже говорилось выше, получение  энергии - необходимая предпосылка  для жизнедеятельности клеток. Из трех принципиально возможных способов регенерации АТР (дыхание, брожение и фотосинтез) брожение - наиболее простой.

Брожение - это такой метаболический процесс, при котором регенерируется АТР, а продукты расщепления органического субстрата могут служить одновременно и донорами, и акцепторами водорода. Реакции, приводящие к фосфорилированию ADP, являются реакциями окисления. От окисленного углерода клетка избавляется, выделяя СО₂. От дельные этапы окисления представляют собой дегидрирование, при котором водород переносится на NAD. Акцепторами водорода, находящегося в составе NADH₂, служат промежуточные продукты расщепления субстрата. При регенерации NAD последние восстанавливаются, а продукты восстановления выводятся из клетки.

При сбраживании углеводов  и ряда других веществ образуются (по отдельности или в смеси) такие  продукты, как этанол, лактат, пропионат, формиат, бутират, сукцинат, капронат, ацетат, н-бутанол, 2,3-бутандиол, ацетон, 2-пропанол, СО₂ и Н₂. В зависимости от того, какие продукты преобладают или являются особенно характерными, различают спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, муравьинокислое, маслянокислое и уксуснокислое брожение. Молекулярный кислород в процессах брожения не участвует: «Брожение - это жизнь без воздуха» (Л. Пастер). Многие микроорганизмы, осуществляющие брожение, облигатные анаэробы, а некоторые - факультативные анаэробы, способные расти как в присутствии кислорода, так и без него; при этом кислород подавляет брожение и оно сменяется дыханием.

Регенерация АТР  при брожении. При сбраживании глюкозы микроорганизмами образуется от 1 до 4 молей АТР:

Продукты

C*DP)+  Pj                        1-4   С*Т?)

Ввиду большого числа возможных  продуктов брожения кажется удивительным, что в преобразовании энергии  путем фосфорилирования на уровне субстрата  участвуют лишь немногие реакции, из которых здесь будут представлены три наиболее важные.

У большинства микроорганизмов, осуществляющих брожение, используются только реакции, катализируемые фосфоглицераткиназой (1) или пируваткиназой (2), а необходимые акцепторы водорода образуются при этом из пирувата и ацетилкофермента А. При сбраживании одного моля глюкозы образуется лишь от двух до трех молей АТР, а продуктами оказываются лактат, этанол, ацетон, бутират, н-бутанол, 2-пропанол,  2,3-бутандиол, капронат, ацетат, СО₂ и молекулярный водород.

При использовании ацетаткиназы [реакция (3)] бактерии получают дополнительный АТР. Ацетилфосфат образуется из ацетил-СоА и неорганического фосфата с помощью фосфотрансацетилазы:

Ацетил-СоА   +   Р_;  -*  Ацетилфосфат  +   СоА

Кроме того, возможно образование  ацетилфосфата из фосфорилированных  сахаров (ксилулозо-5-фосфата, фруктозо-6-фосфата) при участии фосфокетолазы.

Способность бактерий использовать реакцию, катализируемую ацетаткиназой (3), зависит от того, могут ли они  выделять молекулярный водород (Н₂). В случае переноса восстановительных эквивалентов (электронов) на протоны они могут выделяться в виде молекулярного водорода; поэтому клетке нет надобности синтезировать акцепторы водорода. Чтобы понять это, нужно остановиться на механизмах высвобождения Н₂.

Анаэробные бактерии окисляют пируват в ацетил-СоА двумя  способами. В реакции, катализируемой пируват: ферредоксиноксидоредуктазой (эта реакция свойственна, в частности, клостридиям), восстанавливается ферредоксин (Fd). Его окислительно-восстановительный  потенциал очень низок (Е° = = - 420 мВ), поэтому с помощью специальной гидрогеназы-ферредоксин: Н₂-оксидоредуктазы - может освобождаться газообразный водород:

В реакции, катализируемой пируват: формиатлиазой (как у энтеробактерий), наряду с ацетил-СоА образуется также  формиат. Он может расщепляться гидрогеназной  системой:

Формиат---- ► Н₂ + СО₂

Оба механизма выделения  Н₂ имеют между собой то общее, что у предшественников (FdH и формиата) очень низкие окислительно-восстановительные потенциалы. Поэтому клетке нетрудно избавляться от восстановительных эквивалентов, образующихся при окислении пирувата в ацетил-СоА.

В отличие от этого водород, образующийся при дегидрировании глицеральдегид-3-фосфата  и связанный в форме NADH₂, у большинства анаэробных бактерий передается затем на органические акцепторы. Многие бактерии обладают, однако, способностью высвобождать и эти восстановительные эквиваленты в виде Н₂благодаря ферменту NADH₂ : ферредоксиноксидоредуктазе, катализирующему реакцию

NADH₂ + 2 Fd-- ► NAD + 2 FdH

С помощью гидрогеназы  от FdH может отделяться Н₂. Так как эти реакции связаны с увеличением потенциала Н (от £„' = - 320 мВ для NADH₂ до £„' = - 420 мВ для ферредоксина) и их равновесие неблагоприятно для выделения Н₂, они протекают только тогда, когда образующийся и выделяющийся молекулярный водород непрерывно удаляется. Поэтому организмы, способные к образованию Н₂ из NADH₂, могут воспользоваться этим изящным способом избавления от водорода в форме Н₂ только тогда, когда живут вместе с другими видами, непрерывно потребляющими Н₂. Именно так обычно обстоит дело в природе. Такое явление называют межвидовой передачей водорода и говорят об особой форме симбиоза в микробных сообществах.

Бактерии, способные таким  образом избавляться от связанного с NAD водорода, выделяя его в виде Н₂, естественно, могут обходиться без превращения ацетил-СоА в акцепторы для NADH₂. Поэтому они могут превращать ацетил-СоА в ацетилфосфат и регенерировать АТР путем ацетилкиназнои реакции. Выделяют они главным образом ацетат и при сбраживании одного моля глюкозы способны регенерировать до четырех молей АТР (как, например, Ruminococcus albus).

Роль процессов  брожения в балансе природы. Виды, осуществляющие брожение, играют важную роль в природном круговороте веществ. Большая часть целлюлозы, поедаемой растительноядными животными, выводится в не переваренном виде с калом. Когда этот содержащий целлюлозу детрит попадает в анаэробные слои почвы или донных осадков водоемов, целлюлозу сбраживают разлагающие ее клостридии и некоторые другие строго анаэробные бактерии. При этом образуются названные выше продукты брожения, в том числе почти всегда молекулярный водород. Водород находится в начале анаэробной пищевой цепи, главные продукты которой метан и (или) сероводород: 

В осадках пресноводных озер и в рубце жвачных Н₂ превращается метанобразующими бактериями в метан, а в морских анаэробных экосистемах сульфатредуцирующие бактерии превращают Н₂ и сульфат в сероводород.

Этиловый спирт (этанол) - один из широко распространенных продуктов сбраживания  сахаров микроорганизмами. Даже растения и многие грибы в анаэробных условиях накапливают этанол. Главные продуценты этанола - дрожжи, особенно штаммы Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи, как и большинство других грибов, осуществляют аэробное дыхание, но без доступа воздуха они сбраживают углеводы до этанола и СО₂. У ряда анаэробных и факультативно-анаэробных бактерий этиловый спирт тоже является главным или побочным продуктом сбраживания гексоз или пентоз.

В изучении описанных выше путей обмена важную роль сыграли работы, проведенные  на дрожжах. Еще Гей-Люссак (в 1815 г.) дал уравнение, описывающее превращение глюкозы в этанол в той форме, как это принято и теперь:

С₆Н₁₂0₆   ->  2СО₂   +   2С₂Н₅ОН

Нормальное сбраживание  глюкозы дрожжами. Сбраживание глюкозы до этанола и СО₂ дрожжами(Saccharomyces cerevisiae) осуществляется по фруктозодифосфатному пути. Превращение пирувата в этанол происходит в два этапа. Сначала пируват декарбоксилируется пируватдекарбоксилазой (а) при участии тиаминпирофосфата до ацетальдегида, а затем ацетальдегид восстанавливается алкогольдегидрогеназой (б) в этанол при участии NADH₂:

Переносится при этом водород, образующийся при дегидрировании триозофосфата; окислительно-восстановительный баланс, таким образом, сохраняется.

История исследования дрожжевого брожения. Нет смысла останавливаться здесь на курьезно звучащих в наше время спорах о природе брожения - о том, является ли образование спирта из сахара результатом «химического контактного действия» или же результатом деятельности живых существ. Л. Пастер окончательно разрешил вопрос о причинах брожения и установил, что дрожжи в аэробных условиях образуют из определенного количества сахара примерно в 20 раз больше клеточного вещества, чем в анаэробных. Он открыл также, что кислород подавляет брожение. Этот эффект, получивший название эффекта Пастера, приобрел с тех пор известность как один из классических примеров регуляции обмена веществ.

В 1896-1897 годах Бухнер и  Хан обнаружили, что если к соку, полученному при растирании прессованных пивных дрожжей с кварцевым песком и кизельгуром, добавить сахар, то начинается брожение с образованием пены. Так  впервые сложный биохимический  процесс удалось осуществить  вне клетки. В 1906 году Гарден и Ионг, тоже работавшие с дрожжевым соком, установили, что для сбраживания  глюкозы нужен неорганический фосфат, который включается в фруктозо-1,6-дисфосфат. Сбраживание глюкозы дрожжевым  соком происходит согласно уравнению  Гардена-Йонга:

Формы брожения, открытые Нейбергом. Открытия Карла Нейберга и разработанные им оригинальные методы имеют не только историческое значение. Этот исследователь показал, что дрожжи способны сбраживать помимо глюкозы также и пируват. В качестве промежуточного продукта при сбраживании пирувата образуется ацетальдегид; это можно доказать, связывая альдегид бисульфитом (который для дрожжей практически нетоксичен). Если к дрожжам, сбраживающим глюкозу, прибавить бисульфит, будет происходить следующая реакция:

СН₃-СНО   +   NaHS0₃   -*  СН₃-СНОН-S0₃Na

При этом появится новый продукт  брожения – глицерол - и одновременно снизится выход этанола и СО₂.

Брожение в присутствии  бисульфита стали использовать в  промышленности при производстве глицерола. Эта технология основана на том, что  ацетальдегид связывается и поэтому  не может служить акцептором водорода. Вместо ацетальдегида роль такого акцептора  принимает на себя дигидроксиацетонфосфат; он восстанавливается до глицерол-3-фос-фата и дефосфорилируется с образованием глицерола. Брожение можно представить  так:

Глюкоза   +   Бисульфит  ->

->   Глицерол   +   Ацетальдегидсульфит   +   СО₂

Это модифицированное дрожжевое  брожение известно как вторая форма брожения по Нейбергу.Принцип перехватывания одного из метаболитов - метод ловушки - стал впоследствии общим биохимическим методом.

При добавлении к бродящему  раствору NaHC0₃ или Na₂HP0₄ то же образуется глицерол, так как ацетальдегид превращается в результате реакции дисмутации в этанол и уксусную кислоту и поэтому не может быть использован в качестве акцептора водорода. Это третья форма брожения по Нейбергу:

2 Глюкоза   +   Н₂О  -»

-> Этанол  +   Ацетат  +   2 Глицерол  +   2СО₂

Нормальное дрожжевое  брожение Нейберг назвал первой формой брожения. Он считал, что образующийся при небиологическом разложении фруктозы 2-оксопропаноль (метилглиоксаль, СН₃-СО-СНО) также является промежуточным продуктом сбраживания глюкозы.

Отношение дрожжей  к кислороду. Сбраживание дрожжами глюкозы - анаэробный процесс, хотя дрожжи - аэробные организмы. В анаэробных условиях брожение идет очень интенсивно, но роста дрожжей почти не происходит. При аэрации брожение ослабевает, уступая место дыханию. У некоторых дрожжей можно почти полностью подавить брожение усиленной аэрацией (эффект Пастера). Пастер открыл этот эффект более ста лет тому назад, исследуя процессы брожения при изготовлении вина. Это явление свойственно не только дрожжам, но и всем другим факультативно-анаэробным клеткам, включая клетки тканей высших животных.

Баланс превращений глюкозы (на примере типичного опыта с  дрожжами) представлен в табл. 8.1. Аэрация уменьшает потребление  глюко зы, а также образование этанола и СО₂, но делает возможным рост дрожжей. С энергетической точки зрения эти явления понятны; они указывают на существование у дрожжей чрезвычайно полезного регуляторного механизма: в анаэробных условиях образуются только 2 моля АТР на один моль использованной глюкозы, а при дыхании - 38 молей АТР. Таким образом, клетка, регулируя превращения субстрата, может получать   максимум   энергии   как   в   тех,   так   и   в   других   условиях.

В третьем столбце табл. 8.1 приводятся результаты опыта, в котором  дрожжи инкубировали в аэробных условиях в присутствии 0,4 мМ 2,4-динитрофенола (ДНФ). ДНФ разобщает фосфорилирование и окисление в дыхательной цепи: он нарушает сопряжение между переносом электронов и фосфорилированием, после чего дыхание протекает уже без контроля со стороны фосфорилирования. Добавление ДНФ практически выключает фосфорилирование в дыхательной цепи, и водород, отщепляющийся в цикле трикарбоновых кислот, уже не может использоваться для энергетических целей. Доступным для использования оказывается только высокоэнергетический фосфат, образующийся при расщеплении сукцинил-СоА. Результаты опыта показывают, что в присутствии ДНФ потребление глюкозы возрастает до величины, наблюдаемой в анаэробных условиях, что связано с его разобщающим действием.

В реакции Пастера участвует, видимо, несколько регуляторных механизмов, действующих в одном направлении. Эффект одного из них проявляется  на уровне процессов фосфорилирования. В основе его лежит конкуренция  за аденозиндифосфат (ADP) и неорганический фосфат (Р_;). Для дегидрирования при расщеплении глицеральдегидфосфата необходимы ортофосфат и ADP:

Глицеральдегид-3-фосфат   +   NAD   +   ADP   +   Р;  --»  3-фосфоглицерат   +   NADH₂   +   ATP

Таким образом, расщепление  субстрата (глюкозы) по фруктозодифосфатному пути зависит от наличия ADP и неорганического  фосфата. В отсутствие ADP и фосфата  дегидрирование глицеральдегидфосфата  оказывается невозможным. Однако в  аэробных условиях с этой реакцией конкурирует за ADP и фосфат процесс  фосфорилирования в дыхательной  цепи, который тоже приводит к образованию  АТР. Вполне вероятно, что расщепление  глюкозы, а вместе с тем и образование  этанола тормозятся в результате снижения внутриклеточной концентрации ADP и фосфата. Если же под действием ДНФ процессы окисления в дыхательной цепи и фосфорилирование разобщаются, то ADP и фосфат снова могут использоваться для дегидрирования глицеральдегид фосфата, и аэробное потребление глюкозы повышается до уровня, соответствующего анаэробным условиям (табл. 8.1).

За реакцию Пастера  ответствен еще один регуляторный механизм, а именно аллостерический эффект торможения фермента фосфофруктокиназы аденозинтрифосфатом.

Объяснение процесса, описанного Гарденом и Ионгом. Отжатый дрожжевой сок разлагает глюкозу в соответствии с уравнением Гарде-на-Ионга. Накопление фруктозо-1,6-дисфосфата объясняется в этом случае тем, что АТР в нарушенной ферментной системе (в отличие от живой клетки) не может использоваться для энергетических целей и остается в избытке. Дрожжевой сок не содержит фосфатаз, поэтому ADP должен непрерывно регенерироваться за счет фосфорилирования лишней глюкозы или фруктозо-6-фосфата.

Применение дрожжей. Человек использует дрожжи в различных целях. Уже в древние времена из множества видов, рас и штаммов были отобраны наиболее подходящие для того или другого процесса. Для производства пива применяются слабо дышащие, преимущественно бродящие формы, относящиеся к так называемым «низовым дрожжам». Для получения спирта и вин и в хлебопечении используются главным образом «верховые дрожжи».

Пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) должны поднимать те сто в результате образования СО₂, т.е. осуществлять интенсивное брожение. Их выращивают в чанах при сильной аэрации. В качестве побочного продукта при этом всегда образуется этанол. Варьируя степень аэрации и режим добавления сахара, можно изменять относительный выход дрожжей и спирта. При проточном способе непрерывно - прибавляют сахар, но так медленно, чтобы он ограничивал рост дрожжей. Это избавляет от образования продуктов брожения - весь сахар используется для роста. Источником азота служит аммоний. Необходимые ростовые вещества дрожжи получают из добавляемого пшеничного затора.

Пивные дрожжи по большей части относятся к низовым расам (мюнхенское, пильзенское пиво), реже к верховым (светлое пиво, эль, портер). В Центральной Европе пиво варят в основном из ячменя, выбирая для этой цели ячмень с наименьшим содержанием белка и высоким содержанием крахмала. Поскольку дрожжи не образуют амилаз и могут сбраживать только сахара, но не крахмал, необходимо сначала обеспечить осахаривание крахмала. Для этого используют специфическую амилазу, образующуюся при прорастании зерен ячменя. Зернам дают набухнуть и прорасти; образовавшийся зеленый солод осторожно сушат при определенной температуре, при которой прерывается только процесс прорастания, а ферменты сохраняются. Просушенный солод размалывают и погружают в чаны с водой. При умеренной температуре крахмал через некоторое время осахаривается, превращаясь в мальтозу. Полученное сусло освобождается от дробины, к нему добавляют хмель, варят, охлаждают и подвергают брожению в бродильных чанах, прибавляя предварительно выращенные дрожжи.

Для получения спирта (этанола) путем брожения используют отходы производства сахара (мелассу) или картофель. Большие количества дешевого спирта получают также из гидролизатов древесины лиственных пород или из сульфитных щелоков - отходов бумажных фабрик. В гидролизатах древесины сбраживаются до этанола только гексозы. Остающиеся после этого пентозы используют для выращивания кормовых дрожжей (Endomyces lactis и видов Torula), для которых они служат источником углерода; эти дрожжи, богатые белками, добавляют в корм скоту.

Многие немецкие вина получают в результате спонтанного брожения виноградного сока, вызываемого дрожжами рода Kloeckera. Для подавления неконтролируемого брожения, вызываемого дикими дрожжами, неоднократно вносят чистые культуры дрожжей или смеси Kloeckera и Saccharomyces, которые подбирают в специальных винодельческих районах. Еще большее значение для букета вина имеет, однако, сорт винограда (Рислинг, Сильванер, Мюллер-Тургау, Шейребе, Кернер и др.), а также климатические и почвенные факторы, влияющие на рост виноградной лозы.

Во всех жидкостях, полученных путем дрожжевого брожения, содержатся сивушные масла: пропанол, 2-бутанол, 2-метилпропанол, амиловый (пентанол) и изоамиловый (триметилбутанол) спирты. Они представляют собой продукты нормального бродильного метаболизма дрожжей и обнаруживаются не только при их росте в сложных питательных растворах, содержащих аминокислоты. Основными компонентами сивушного масла являются побочные продукты обмена изолейцина, лейцина и валина.

Известный для дрожжей путь образования  этанола (фруктозодифосфатный путь, пируватдекарбоксилазная реакция) из всех исследованных бактерий обнаружен только у Sarcina ventriculi.

Из пульке - бродящего сока агавы (Agave mexicana) в Мексике была выделена палочковидная подвижная бактерия с полярными жгутиками, образующая этанол. Эта бактерияZymomonas mobilis разлагает глюкозу по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатному пути и расщепляет пируват с помощью пируватдекарбоксилазы на ацетальдегид и двуокись углерода. Ацетальдегид восстанавливается до этанола. Единственными продуктами этого брожения являются этанол, СО₂ и небольшие количества молочной кислоты. Интересно, что в водке, приготовленной из сока агавы, обнаруживаются углеродные атомы 2, 3, 5 и 6 глюкозы, тогда как в спирте, образуемом дрожжами, содержатся углеродные атомы 1, 2, 5 и 6 (рис. 8.1).

При брожениях, вызываемых некоторыми видами Enterobacteriaceae и клостридиями, этанол является побочным продуктом. Предшественник этанола – ацетальдегид - образуется в этом случае не прямо из пирувата (под действием пируватдекарбоксилазы), а путем восстановления ацетил-СоА.

Совершенно иным путем  образуют этиловый спирт гетероферментативные молочнокислые бактерии (например, Leuconostoc mesenteroides). Глюкоза разлагается ими по пентозофосфатному пути до пентозофосфата. На ксилулозо-5-фосфат воздействует фосфокетолаза:

Ксилулозо-5-фосфат   +   Pj   -*

-*  Ацетилфосфат   +   Глицеральдегид-3-фосфат

Образовавшийся ацетилфосфат восстанавливается ацетальдегиддегидрогеназой и алкогольдегидрогеназой в этанол. Другой продукт расщепления глюкозы - глицеральдегид-3-фосфат - восстанавливается до лактата (через пируват).

Молочнокислые бактерии объединяют в сем. Lactobacillaceae. Хотя эта группа морфологически гетерогенна (включает длинные и короткие палочки, а также кокки), в физиологическом отношении ее можно охарактеризовать достаточно хорошо. Все относящиеся к ней бактерии грамположительны, не образуют спор (за исключением Sporolactobacillus inulinus) и в подавляющем большинстве неподвижны. Все они используют в качестве источника энергии углеводы и выделяют молочную кислоту. В отличие отEnterobacteriaceae, тоже образующих лактат, молочнокислые бактерии способны только к брожению; они не содержат гемопротеинов (таких, как цитохромы и каталаза). Несмотря на это, Lactobacteriaceae могут расти в присутствии кислорода воздуха; будучи анаэробами, они все же аэротолерантны. Если какая-нибудь бактерия растет в аэробных условиях, но не образует каталазу, ее с большой вероятностью можно отнести к молочнокислым бактериям.

Потребность в  факторах роста. Еще один отличительный признак молочнокислых бактерий - это их потребность в ростовых веществах. Ни один представитель этой группы не может расти на среде с глюкозой и солями аммония. Большинство нуждается в ряде витаминов (лактофлавине, тиамине, пантотеновой, никотиновой и фолиевой кислотах, биотине) и аминокислот, а также в пуринах и пиримидинах. Культивируют эти бактерии преимущественно на сложных средах, содержащих относительно большие количества дрожжевого экстракта, томатного сока, молочной сыворотки и даже крови. Неожиданным оказалось то, что некоторые молочнокислые бактерии (и другие организмы, осуществляющие брожение) при росте на средах, содержащих кровь, образуют цитохромы и даже, возможно, способны осуществлять фосфорилирование в дыхательной цепи. Молочнокислые бактерии не могут, следовательно, синтезировать порфирины; если же порфирины добавлены в питательную среду, то некоторые из этих бактерий способны образовать соответствующие геминовые пигменты.

Таким образом, молочнокислые  бактерии - это своего рода «метаболические  инвалиды», которые, вероятно в результате своей специализации (рост в молоке и других средах, богатых питательными и ростовыми веществами), утратили способность к синтезу многих метаболитов. С другой стороны, многие из них обладают способностью, которой  нет у большинства других микроорганизмов; они могут использовать молочный сахар (лактозу). В этом они сходны с многими кишечными бактериями (например, Escherichia coli).Лактоза в растительном царстве, по-видимому, не встречается; она образуется у млекопитающих, выделяется с молоком и соответственно с ним же поглощается. Таким образом, способность использовать лактозу можно считать приспособлением к среде, характерной для кишечника млекопитающих. Лактоза - дисахарид, который, прежде чем вступить на путь катаболизма гексоз, должен быть расщеплен:

Лактоза + Н₂0       ^Галактозидаза ^   ₀-Глюкоза + D-Галактоза

Галактоза после  фосфорилирования  превращается  в  глюкозофосфат.

В связи с образованием больших количеств молочной кислоты  питательная среда для молочнокислых  бактерий должна быть хорошо забуферена. Чаще всего с этой целью добавляют  карбонат кальция. На агаризованной  среде со взвесью СаСО₃ («меловом агаре») образование кислоты   обнаруживается   по   прозрачным   ореолам   вокруг   колоний.

Распространение и места обитания. Распространение молочнокислых бактерий в природе определяется их сложными потребностями в питательных веществах и способом получения энергии (только брожение). Эти бактерии почти никогда не обнаруживаются в почве или водоемах. В естественных условиях они встречаются:

а)  в молоке, местах его переработки и молочных продуктах

(Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermentum, L. brevis; Streptococcus lactis, S. diacetilactis);

б) на растениях и на разлагающихся растительных остатках (Lactobacillus plantarum, L. delbriickii, L. fermentum, L. brevis; Streptococcus lactis; Leuconostoc mesenteroides);

в) в кишечнике и на слизистых  оболочках человека и животных

(Lactobacillus acidophilus; Bifidobacterium; Streptococcus faecalis, S. salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae).

Streptococcus faecalis - обычный обитатель кишечника человека; S. bovis распространен в пищеварительном тракте жвачных. Многие стрептококки являются безобидными обитателями слизистых рта, дыхательных и мочевых путей, половых органов; однако среди стрептококков есть и паразиты крови - весьма вирулентные возбудители болезней.

Благодаря образованию больших  количеств молочной кислоты, к которой  сами они в значительной степени  толерантны, молочно кислые бактерии при подходящих условиях могут довольно быстро размножаться, вытесняя другие микроорганизмы. По этой причине их легко культивировать на элективных средах и легко выделять. «Естественные  накопительные культуры» этих бактерий содержатся в кислом молоке и молочных продуктах, кислом тесте, кислой капусте, силосе и т.п.

Катаболизм углеводов  и продукты брожения. В зависимости  от того, какие продукты образуются при сбраживании глюкозы - только молочная кислота или также другие органические продукты и СО₂, - молочнокислые бактерии принято подразделять на гомоферментативные и гетероферментативные (табл. 8.2). Это старое деление отражает коренные различия в путях катаболизма сахаров.

Гомоферментативное  молочнокислое брожение. Гомоферментативные молочнокислые бактерии образуют практически только одну молочную кислоту (она составляет не менее 90% всех продуктов брожения). Катаболизм глюкозы происходит у них по фруктозодифосфатному пути (бактерии обладают всеми необходимыми для этого ферментами, включая альдолазу), а водород, отщепляющийся при дегидрировании глицеральдегид-3-фосфата, передается на пируват. От стереоспецифичности лактатдегидрогеназы (а) и от наличия лактатрацемазы зависит, какой продукт образуется - D (-)-, L (+)- или DL-молочная кислота. Лишь небольшая часть пирувата декарбоксилируется, превращаясь в уксусную кислоту, этанол и СО₂, а также в ацетоин. Количество образующихся побочных продуктов зависит, по-видимому, от доступа кислорода.

Гетероферментативное  молочнокислое брожение. У гетероферментативных молочнокислых бактерий нет главных ферментов фруктозодифосфатного пути - альдолазы и триозофосфатизомеразы. Начальное превращение глюкозы идет у них исключительно по пентозофосфатному пути, т.е. через глюкозо-6-фосфат, 6-фосфоглюконат и рибулозо-5-фосфат (см. рис. 7.4 и 8.2). Рибулозо-5-фосфат под действием эпимеразы превращается в ксилулозо-5-фосфат, который в результате тиаминпирофосфат-зависимой   реакции,   катализируемой   пентозофосфокетолазой, расщепляется с образованием глицеральдегидфосфата и ацетилфосфата:

Нерастущие, отмытые клетки Leuconostoc mesenteroides сбраживают глюкозу почти стехиометрически согласно уравнению

с₆н₁₂о₆ -> сн₃-снон-соон + сн₃-сн₂он + со₂

в лактат, этанол и двуокись углерода. Таким образом, у этих бактерий ацетилфосфат восстанавливается через  ацетил-СоА и ацетальдегид в этанол (рис. 8.2). Другие гетероферментативные молочнокислые бактерии переводят  ацетилфосфат частично или целиком  в уксусную кислоту, что сопровождается переносом высокоэнергетической фосфатной  связи на ADP с образованием АТР. Избыток  водорода передается в этом случае глюкозе, из которой образуется маннитол. Глицеральдегидфосфат через пируват  превращается в лактат. Рибозу Leuconostoc mesenteroides сбраживает в лактат и ацетат.

При сбраживании фруктозы гетероферментативными бактериями образуются лактат, ацетат, СО₂ и маннитол:

3 Фруктоза  -»  Лактат   +   Ацетат   +   СО₂   +   Маннитол

Фруктоза при этом служит акцептором избыточных восстановительных  эквивалентов:

Фруктоза   +   NADH₂   -»  Маннитол   +   NAD

Lactobacillus plantarum (= pentosus или arabinosus) сбраживает глюкозу по гомоферментативному пути, а пентозы расщепляет с помощью фосфокетолазы, превращая в лактат и ацетат. Следует отметить, что даже такая типичная гомоферментативная бактерия, как Lactobacillus casei, хотя и сбраживает глюкозу по гомоферментативному, пути, но рибозу превращает в ацетат и лактат гетероферментативным путем. Рибоза индуцирует у нее синтез фосфокетолазы. Если клетки, выросшие на среде с рибозой, отмыть, то после этого они и глюкозу будут сбраживать как гетероферментативные бактерии.

Брожение, осуществляемое Bifidobacterium bifidum. Гетероферментативная молочнокислая бактерия В.bifidum получила это название за свою V- или Y-образную форму (лат. bifidus-раздвоенный). Она известна тем, что преобладает в кишечнике грудных детей, особенно детей, вскармливаемых грудью. Эту зависимость ее распространения от способа кормления грудного ребенка можно было связать с потребностью бактерии в углеводах, содержащих N-ацетилглюкозамин, которые имеются только в молоке человека, но не коровы. Все представители рода Bifidobacterium - строгие анаэробы; они не переносят присутствия кислорода, и для их роста нужна атмосфера, содержащая 10% СО₂. С тех пор как стали известны эти необычные для молочнокислых бактерий особенности, бифидобактерии были обнаружены и в кишечной флоре взрослых людей, и во многих других местах, даже в гниющем иле, и теперь различают много видов этого рода. Бифидобактерии расщепляют глюкозу согласно уравнению

2С₆Н₁₂0₆   ->  2СН₃    СНОН-СООН   +   ЗСН₃-СООН

Т.е. сбраживают ее по фосфокетолазному побочному пути. Они не имеют ни альдолазы, ни глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, но содержат активные фосфокетолазы, расщепляющие фруктозо-6-фосфат и ксилулозо-5-фосфат на ацетилфосфат и эритрозо-4-фосфат или глицеральдегид-3-фосфат. Гексозы  претерпевают следующие превращения:  

Применение молочнокислых  бактерий в домашнем хозяйстве, сельском хозяйстве и для приготовления пищевых продуктов. Если нестерильный раствор, содержащий наряду с сахарами также сложные источники азота и факторы роста, оставить без доступа воздуха или просто налить в сосуд достаточно большое количество такого раствора, то вскоре в нем появятся молочнокислые бактерии. Они снижают рН до значений < 5 и тем самым подавляют рост других анаэробных бактерий, которые не могут развиваться в столь кислой среде. Какие именно молочнокислые бактерии вырастут в таких накопительных культурах, зависит от прочих условий. Благодаря своему стерилизующему и консервирующему действию, основанному на подкислении среды, молочнокислые бактерии используются в сельском и домашнем хозяйстве и в молочной промышленности.

Приготовление силоса. Молочнокислые бактерии, обитающие на растениях, играют большую роль при запасании впрок кормов для скота. Для приготовления силоса используют листья сахарной свеклы, кукурузу, картофель, травы и люцерну. Растительную массу прессуют и прибавляют к ней мелассу, чтобы повысить отношение C/N, и муравьиную или какую-либо неорганическую кислоту, чтобы заранее обеспечить преимущественный рост лактобацилл и стрептококков. В таких условиях происходит контролируемое молочнокислое брожение.

Приготовление кислой капусты. Кислая капуста тоже представляет собой продукт, в приготовлении которого участвуют молочнокислые бактерии. В мелко нарезанной, посыпанной солью (2-3%) и спрессованной белокочанной капусте при исключении доступа воздуха начинается спонтанное молочнокислое брожение, в котором принимает участие сначала Leuconostoc (с образованием СО₂), а позднее Lactobacillus plantarum.

Молочные продукты. Молочнокислые бактерии, образующие кислоту и придающие продуктам определенный вкус, находят широкое применение в молочной промышленности. Стерилизованное, или пастеризованное молоко, или же сливки сбраживают, прибавляя в качестве закваски чистые («стартовые») культуры молочнокислых бактерий. Кисломолочное масло готовят из сливок, сквашенных с помощьюStreptococcus lactis, S. cremoris и Leuconostoc cremoris. Образующийся в процессе брожения диацетил придает маслу  специфический  аромат.

Закваски, содержащие Streptococcus lactis или Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus,вызывают свертывание казеина при приготовлении творога и немецких сыров (гарцского и майнцского). При изготовлении твердых сыров (в отличие от сыров из кислого молока) для свертывания казеина пользуются сычужным ферментом. Молочнокислые бактерии (Lactobacillus casei, Streptococcus lactis) вместе с пропионовокислыми участвуют лишь на стадии созревания сыров.

Для приготовления молочнокислых  продуктов (табл. 8.3) в качестве заквасок тоже используются стартовые культуры молочнокислых бактерий, образующих кислоту и некоторые вещества, придающие продукту характерный  запах. Ароматное пахтанье получают с помощью упомянутых выше заквасок, применяемых для приготовления кисломолочного масла. Пахтанье наряду с молочной кислотой содержит также уксусную кислоту, ацетоин и диацетил. Йогурт получают из пастеризованного гомогенизированного цельного молока, инокулированного Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus (после внесения закваски молоко выдерживают 2-3 ч при 43-45°С). Под названием биогурт в продажу поступает кислое молоко, сквашенное Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus. Кефир принадлежит к молочнокислым продуктам, содержащим кислоты и этанол; его получают из молока (коровьего, овечьего или козьего). Закваску готовят на так называемых кефирных зернах, которые состоят из пока еще не полностью изученного сообщества организмов, включающего лактобациллы, стрептококки, микрококки и дрожжи. Сквашивание молока ведут при 15-22°С в течение 24-36 ч. Для приготовления кумыса используют ослиное молоко, которое инокулируют культурой, содержащей Lactobacillus bulgaricus и дрожжи рода Torula.

Чистую молочную кислоту, которая используется для различных промышленных целей и как добавка к пищевым продуктам, получают в результате брожения. Молоко или сыворотку сбраживают при помощи Lactobacillus casei или L. bulgaricus. Для сбраживания глюкозы и мальтозы применяют L. delbruckii, L.leichmannii или Sporolactobacillus inulinus. Источником необходимых  факторов  роста служат меласса  и  солод.

Образование кислоты в кислом тесте, используемой для его подъема, тоже обеспечивается молочнокислыми бактериями, в частности Lactobacillus plantarum и L. coryneformis. Стартовые культуры лактобацилл и микрококков применяются также для приготовления сырокопченых колбас (салями, сервелат). Образуя молочную кислоту и снижая рН, молочнокислые бактерии предохраняют от порчи те виды колбас, которые не подвергаются варке.  

Распространение, методы выделения и  систематика. Пропионовокислые бактерии обитают в рубце и кишечнике жвачных животных (коров, овец); они участвуют там в образовании жирных кислот, главным образом пропионовой и уксусной. Благодаря им образующаяся в рубце в результате различных видов брожения молочная кислота превращается главным образом в пропионовую. Пропионовокислые бактерии не встречаются в молоке, и их не удается выделить из почвы или при родных вод. Для получения накопительной культуры этих бактерий питательную среду с лактатом и дрожжевым экстрактом инокулируют швейцарским сыром и инкубируют в анаэробных условиях. В швейцарский сыр, в созревании которого пропионовокислые бактерии играют важную роль (определяя также его вкус), они попадают с сычужным ферментом, применяемым в процессе приготовления сыра для свертывания молока. Сычужный фермент добавляют в виде водного экстракта из телячьих желудков, содержащего множество жизнеспособных пропионовокислых бактерий. Различают несколько видов таких бактерий, из которых наиболее известны вид Propionibacterium freudenreichii и его подвид shermanii, а также P. acidi-propionici(прежнее название -Р. pentosaceum). Возбудитель угрей - воспаления волосяных фолликулов у человека - тоже относится к пропионовокислым бактериям (P. acnes). Помимо рода Propionibacterium к бактериям, образующим пропионовую кислоту,  причисляют   Veillonella  alcalescens  (= Micrococcus   lactilyticus),

Clostridium propionicum, Selenomonas и Micromonospora. Пропионат как продукт брожения выделяют и многие другие бактерии.

Рост и метаболизм представителей рода Propionibacterium. Этот род относят к коринеформным бактериям; он включает грам-положительные неподвижные палочки, не образующие спор. При неблагоприятных условиях роста часто появляются булавовидные формы. Пропионовокислые бактерии на твердых средах при доступе воздуха не растут. Так как они не переносят присутствия атмосферного О₂, способны расти в анаэробных условиях и регенерировать АТР за счет энергии брожения, их считали организмами, облигатно осуществляющими брожение. С другой стороны, давно известно, что они обладают гемсодержащими ферментами, такими как цитохромы и каталаза. Действительно, исследованные представители рода Propionibacterium оказались способными расти как в анаэробных, так и в аэробных условиях. При достаточно слабой контролируемой аэрации урожай их клеток во много раз больше, чем в строго анаэробных условиях. В случае аэробного роста, правда, скорость диффузии кислорода из газовой фазы в бактериальную взвесь не должна превышать его потребления в процессе дыхания: кислород при измеримых парциальных давлениях оказывает токсическое действие. Виды Propionibacterium, таким образом, следует относить к микроаэротолерантным формам. В анаэробных условиях представители этого рода сбраживают глюкозу, сахарозу, лактозу и пентозы, а также лактат, малат, глицерол и другие субстраты с образованием пропионовой кислоты. Расщепление гексоз идет по фруктозодифосфатному пути.

Исследуя сбраживание  глицерола клетками Propionibacterium acidi-propionici, Вуд и Веркман (1936) нашли, что при этом происходит фиксация СО ₂, поддающаяся количественному определению. Связанный углерод можно было обнаружить в выделяемом сукцинате, что указывало на карбоксилирование пирувата с образованием дикарбоновых кислот. Такое карбоксилирование получило название реакции Вуда- Веркмана. Эта реакция свойственна не только пропионовокислым бактериям - она широко распространена у животных, растений и различных гетеротрофных микроорганизмов. Соответствующие биохимические превращения описаны в разделе 7.5-там, где речь идет о глюконеогенезе.

Образование пропионовой  кислоты (метилмалонил-СоА-путь). Пропионовая кислота образуется из молочной согласно следующему уравнению:

ЗСН₃-СНОН-СООН   -*-*  2СН₃-СН₂-СООН   +   СН₃- СООН   +   С0₂   +   Н₂0

Восстановление лактата  или пирувата до пропионата идет по пути, который по характерному промежуточному продукту был назван метилмалонил-СоА-путем (рис. 8.3). Сначала пируват при участии  комплекса    биотин-СО₂    карбоксилируется   метилмалонил-СоА-карбокситрансферазой с образованием оксалоацетата, а затем восстанавливается через малат и фумарат до сукцината. Транспорт электронов на этом этапе сопряжен с фосфорилированием. Затем сукцинат с помощью СоА-трансферазы (сукцинил-СоА: пропионат-СоА-трансферазы) присоединяется к СоА и таким образом активируется. Сукцинил-СоА под действием метилмалонил-СоА-мутазы и при участии кофермента В₁₂ (цианкобаламина) превращается в метилмалонил-СоА, и только от этого промежуточного продукта, наконец, отщепляется СО₂; в результате образуется пропионил-СоА, а СО₂связывается с упомянутой выше метилмалонил-СоА-карбокситрансферазой. Из пропионил-СоА образуется пропионат, в результате того что СоА-трансфераза переносит СоА на сукцинат. Следует особо отметить, что в процессе образования пропионата две группы (СО₂ и СоА) пере носятся с последующего продукта на предшествующий, не освобождаясь. Заслуживает внимания и участие трех кофакторов (биотина, СоА и кофермента В₁₂) в этом процессе. По метилмалонил-СоА - пути пропионат образуется у большинства пропионовокислых бактерий, а также у Veillonella alcalescens и Selenomonas ruminantium.

Реакции метилмалонил-СоА-пути могут протекать и в обратном на правлении, как, например, при расщеплении валина, изолеицина и жирных кислот с длинной цепью и нечетным числом углеродных атомов. Из жирных кислот и изолеицина образуется пропионил-СоА, который карбоксилируется с образованием метилмалонил-СоА. Для пре вращения последнего в сукцинил-СоА при участии метилмалонил-СоА-мутазы необходим витамин В₁₂ (кофермент В₁₂); это относится и к корневым клубенькам бобовых, и к клеткам Rhizobium, и к животным клеткам.

Акрилоил-СоА-путь. Образование пропионовой кислоты у Clostridium propionicum, Bacteroides ruminicola и Megasphaera elsdenii происходит более простым путем. Промежуточным продуктом здесь является СоА-производное акриловой кислоты - акрилоил-СоА: 

Некоторые микроорганизмы, образующие при брожении кислоты, объединяют в  одну физиологическую группу на том  основании, что характерным, хотя и  не главным продуктом брожения является у них муравьиная кислота. Наряду с муравьиной кислотой такие бактерии выделяют и некоторые другие кислоты; такой тип метаболизма называют поэтому муравъинокислъш брожением или брожением смешанного типа. Так как некоторые типичные представители этой группы обитают в кишечнике, все семейство носит название Enterobacteriaceae. Это грам-отрицательные, активно подвижные, не образующие спор палочки с перитрихальным жгутикованием. Будучи факультативными аэробами, они обладают гемопротеинами (цитохромами и каталазой) и способны получать энергию как в процессе дыхания (в аэробных условиях), так и в процессе брожения (в анаэробных условиях). В отношении питания эти бактерии исключительно нетребовательны - растут на простых синтетических средах, содержащих минеральные соли, углеводы и аммоний. Сбраживание глюкозы у всех представителей этой группы происходит с образованием кислот. Значение Enterobacteriaceae для эпидемиологии, а также для разного рода экспериментальных исследований общеизвестно; поэтому полезно будет рассмотреть здесь некоторых представите лей этого семейства.

Наиболее важные виды. Escherichia coli- обитатель кишечника, в количественном отношении, однако, не главный (в кишечной флоре пре обладают Bacteroides и Bifidobacterium). Эта бактерия может некоторое время сохранять жизнеспособность и вне кишечника, и ее легко выявить. Этим пользуются для того, чтобы обнаружить загрязнение питье вой воды фекалиями.

Proteus vulgaris тоже принадлежит к нормальной кишечной флоре, но, кроме того, широко распространен в почве и воде. Эта бактерия известна своей склонностью к изменению формы (отсюда ее название) и большой подвижностью, а также способностью образовывать на поверхности агара сплошную пленку.

Enterobacter aerogenes можно в известном смысле считать «близнецом» Е. соli (оба вида относят к «группе кишечной палочки»). Эта бактерия широко распространена в почве; как показывает ее видовое на звание, она образует много газообразных продуктов. От Е. coli она отличается лишь немногими биохимическими признаками (см. табл. 8.4 и 8.5).

Serratia marcescens (прежнее название - Bacterium prodigiosum, или чудесная палочка) может рассматриваться как вариант Enterobacter, отличающийся образованием пигмента.

К роду Erwinia относятся некоторые фитопатогенные виды, поражающие стебли, листья и корни. В результате выделения пектиназ они вызывают мягкие гнили.

Klebsiella pneumoniae отличается от Enterobacter только более толстой слизистой капсулой и неподвижностью. Ее находят при некоторых тяжелых формах пневмонии.

Salmonella typhimurium - самая распространенная из бактерий, вызывающих гастроэнтерит, или так называемую «пищевую токсикоинфекцию»; в основе симптомов лежит раздражение слизистой желудочно-кишечного тракта выделяемыми липополисахариднымй токсинами бактерии.  В  кровяное  русло  возбудитель  не  проникает.  S.  typhi является возбудителем эпидемического брюшного тифа, a Shigelladysenteriae и родственные штаммы-возбудителями дизентерии.

Vibrio cholerae - возбудитель холеры, эпидемической болезни. Он не относится к группе Enterobacteriaceae, но близок к ней по типу метаболизма. Холерный вибрион размножается в кишечнике. Он прикрепляется к кишечному эпителию, но не проникает в клетки. Холерный энтеротоксин - белок, связываемый клетками кишечного эпителия (специфическими рецепторами). Он вызывает переход воды и ионов натрия, бикарбоната и хлорида в просвет кишечника.

Yersinia pestis-возбудитель чумы. Род Yersinia не относится к таксономической группе Enterobacteriaceae, но близок к ней по своему факультативно-анаэробному образу жизни и по типу брожения. Природным резервуаром этого возбудителя эпидемий служат дикие грызуны, главным образом крысы. Бактерии передаются человеку инфицированными блохами и другими эктопаразитами; в результате развивается бубонная или легочная чума. Быстрое размножение бактерий в организме и интенсивная выработка ими токсина могут приводить к скорой смерти.

Анализ питьевой воды. Основная цель анализа питьевой воды - обнаружение Escherichia coli. Этот анализ-простой пример бактериологической дифференциальной диагностики, поэтому на нем стоит остановиться подробнее. Е. coli-обычный и совершенно безвредный обитатель кишечника человека, и его присутствие в питьевой воде само по себе неопасно. Однако в кишечнике может находиться и ряд патогенных бактерий. Вместе с Е. coli эти бактерии выделяются с калом больных, реконвалесцентов и бациллоносителей, так что и они могут попадать в питьевую воду. Чтобы не применять специальных методов для выявления каждой из таких патогенных бактерий, пользуются общим индикатором загрязнения. Таким индикатором и служит постоянный обитатель кишечника Е. coli. Обнаружение этого вида в пробе воды показывает, что вода загрязнена содержимым кишечника и кишечными бактериями, среди которых могут быть и патогенные формы. В таком случае требуется принять соответствующие меры. Нормой для питьевой воды считается, когда общее число бактериальных клеток в 1 мл не превышает 100; при этом в 100 мл воды не должно быть ни одной клетки Е. coli.

Е. coli хорошо растет на средах, содержащих глюкозу или лактозу и пептон. Для того чтобы создать условия, при которых рост других бактерий сводился бы к минимуму, пользуются лактозой. На средах с лактозой могут расти только те бактерии, которые способны ее расщеплять с помощью р-галактозидазы. Этот фермент синтезируют бактерии группы кишечной палочки и молочно кислые бактерии, тогда как многие почвенные и водные бактерии его лишены.

Первые указания на присутствие  газообразующих бактерий дает появление  газа во время инкубации пробы  в растворе с лактозой и пептоном в бродильных трубках Эйихорна. Если в одну трубку высеять Escherichia coli,а в другую - Enterobacter aerogenes, то уже после 24-часовой инкубации при 37°С станет заметной разница в выделении газообразных продуктов. Е. aerogenes оправды вает свое название и образует примерно вдвое больше газа, чем Е. coli. Различен и состав выделяющегося газа: Е. coli выделяет Н₂ и СJ₂ примерно в соотношении 1:1, тогда как Enterobacter aerogenes образует больше СО₂, чем водорода.

Некоторые молочнокислые  бактерии тоже обладают способностью расщеплять лактозу с образованием газа, так что их присутствие может  исказить результаты анализа. Это делает необходимым применение дальнейших методов дифференциации. Если такую  культуру высеять на агар с эозином  и метиленовым синим (лактоза-пентон-эозин-метиленовый  синий), то появляются колонии Е. coli, окрашенные в темно-синий цвет с металлическим отливом (результат отражения света); Enterobacter же образует розовые слизистые колонии без металлического блеска.

Для более точной дифференциации этих двух микроорганизмов требуется  полный анализ брожения. Это, конечно, самый точный, но и самый трудоемкий способ. В повседневной практике для  заключительной дифференциации используют метод, основанный на качественных различиях  между двумя рассматриваемыми видами бактерий (табл. 8.5). Учитываются следующие  показатели: 1) образование индола из триптофана; 2) количество кислоты, образуемой из сахара (проба с метиловым красным); 3) образование ацетоина при сбраживании  глюкозы (реакция Фогес-Проскауэра) и 4) рост на среде с цитратом в качестве источника углерода.

• 1. Образование индола. Индол, образуемый из триптофана, выявляется с по мощью реактива Эрлиха (и-диметиламинобензальдегида) по вишнево-красному окрашиванию.
• 2. Проба с метиловым красным. Образование кислоты приводит к изменению цвета рН-индикатора (метилового красного): красный <рН 4,5 < желтый.
• 3. Образование ацетоина (реакции Фогес-Проскауэра). Ацетоин, образовавшийся в питательной среде с глюкозой и пептоном, в сочетании с креатином, содержащимся в пептоне, вызывает после прибавления сильной щелочи (1 мл 10%-ного КОН на 5 мл питательного раствора) появление красной окраски. Чувствительность метода повышается при добавлении креатина и а-нафтола.
• 4. Использование цитрата. В синтетическом питательном растворе с цитратом использование последнего можно обнаружить по помутнению и подщелачиванию (выявляется с помощью бромтимолового синего).

Продукты брожения и метаболические пути. При брожениях, вызываемых факультативными анаэробами, в том числе представителями Enterobacteriaceae, многими видами Bacillus и другими бактериями, образуется большое число различных соединений, среди которых пре обладают органические кислоты. Важнейшими продуктами брожения являются уксусная, муравьиная, янтарная и молочная кислоты, этанол, глицерол, ацетоин, 2,3-бутандиол, СО₂ и молекулярный водород. Гексозы расщепляются в основном по фруктозобисфосфатному пути и только в незначительной части - по пентозофосфатному. Разложение глюконата идет по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатному пути.

В зависимости от того, какие  продукты брожения выделяются в анаэробных условиях, различают два типа процессов: а) при брожении, характерном для Escherichia coli, образуются главным образом кислоты и совсем не образуется бутандиол; б) при брожении, характерном для Enterobacter, основной продукт - бутандиол, кислоты же занимают второе место. В табл. 8.6 приведены результаты типичного анализа продуктов брожения. Два указанных типа брожения различаются главным образом по реакциям, связанным с превращениями пирувата.

Особенности брожения, осуществляемого Escherichia coli. Для этой бактерии характерны следующие особенности брожения; 1) расщепление пирувата с образованием ацетил-СоА и формиата; 2) разложение формиата на СО₂ и молекулярный водород; 3) восстановление ацетил-СоА до этанола; 4) отсутствие способности образовывать из пирувата ацетоин и 2,3-бутандиол.

Превращение пирувата в ацетил-СоА  и формиат происходит только в  анаэробных условиях; его катализирует пируват: формиатлиаза. Этот фермент  чрезвычайно чувствителен к кислороду, удерживается флаводоксином в восстановленном  состоянии и для своей активации  нуждается в 8-аденозил-6-метионине.

Муравьиную кислоту большинство штаммов Е. coli и другие газообразующие виды энтеробактерий расщепляют на СО₂ и молекулярный водород.

Реакцию катализирует ферментная система, называемая формиатгидрогенлиазой. Речь идет, вероятнее всего, о комбинированном  действии формиатдегидрогеназы (НСООН + X -» С0₂ + ХН₂) и гидрогеназы (ХН₂ -» X + Н₂). У Е. coli газообразные продукты Н₂ и СО₂ образуются почти в равных количествах. Такое стехиометрическое отношение (1:1) согласуется с образованием обоих газов в результате расщепления формиата. Однако при изменении рН это отношение меняется.

Этанол, образуемый энтеробактериями, является продуктом восстановления ацетил-СоА. У этих бактерий нет пируватдекарбоксилазы, декарбоксилирующей пируват с образованием ацетальдегида. Часть образующегося ацетил-СоА выделяется в виде ацетата; высокоэнергетическая связь может при этом сохраняться благодаря реакциям, осуществляемым фосфотрансацетилазой и ацетаткиназой.

Лактат получается в результате восстановления пирувата.

Сукцинат является продуктом «фумаратного дыхания», при котором происходит фосфорилирование, сопряженное с транспортом электронов. Сначала в результате карбоксилирования фосфоенолпирувата образуется оксалоацетат, который затем через малат превращается в фумарат. Фумарат при участии мембраносвязанной фумаратредуктазы восстанавливается до сукцината, который выделяется в окружающую среду. Выделение значительных количеств сукцината (табл. 8.6), синтез которого включает фиксацию СО₂, позволяет объяснить то, что Escherichia coli может покрывать за счет СО₂ до 20% своей потребности в углероде.

Особенности брожения, осуществляемого Enterobacter aerogenes. Эта бактерия в анаэробных условиях тоже образует целый ряд кислот; в количественном отношении они, однако, существенно уступают ацетоину и 2,3-бутандиолу. Ацетоин образуется из двух молекул пирувата. Процесс включает двукратное декарбоксилирование. Образование нейтрального продукта брожения - будандиола - в известной мере конкурирует за промежуточный продукт - пируват, подавляя тем самым синтез кислот.

С другой стороны, образование  бутандиола связано с дополнительным освобождением СО₂. Количество дополнительно образуемой двуокиси углерода находится в стехиометрическом соотношении с коли чеством бутандиола. Из табл. 8.6 видно, что некоторая часть СО₂ образуется при расщеплении формиата, однако основное ее количество выделяется в процессе образования бутандиола. Своим названием Enterobacteraerogenes обязан, как уже говорилось, очень интенсивному выделению газообразных продуктов. Соответствующие отличия от брожения, осуществляемого Escherichia coli, составляют основу для применения пробы с метиловым красным и проведения реакции Фогес-Проскауэра на ацетоин.

Образование ацетоина у Enterobacter идет через 2-ацетиллактат. Активный ацетальдегид (гидроксиэтилтиаминпирофосфат) участвует в реакции с пируватом, катализируемойацетиллактатсинтазой (ферментом I), в результате чего образуется 2-ацетиллактат:

Второй фермент - 2-ацетиллактатдекарбоксилаза - отщепляет СО₂. Продуктом этой стереоспецифической реакции является ацетоин (ацетилметилкарбинол).

2,3-Бутандиол образуется  при восстановлении ацетоина бутандиолде-гидрогеназой:

СН₃- СНОН- СО-СН₃   +  NADH₂   -*-*  СН₃-СНОН^СНОН-СН₃   +   NAD

У Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, В. polymyxa, Serratia, Aeromonas hydrophila и некоторых других бактерий образование бутандиола идет через 2-ацетиллактат. Брожение с выходом бутандиола находит применение в промышленности.

При окислении ацетоина кислородом воздуха легко образуется сходное  с ацетоином соединение диацетил. Его выделяют и различные молочнокислые  бактерии (Leuconostoc cremoris, Lactobacillus plantarum), добавляемые к молоку специально для этой цели в процессе приготовления молочнокислых продуктов (масла, йогурта). Диацетил придает продукту запах масла. У названных бактерий он синтезируется не через 2-ацетиллактат, а из гидроксиэтилтиаминпирофосфата и ацетил-СоА. 

Светящиеся бактерии - в основном морские организмы. Это хемоорганотрофные  бактерии, по своим морфологическим  и физиологическим признакам  сходные с Enterobacteriaceae; поэтому их называют также «морскими энтеробактериями».

Светящиеся бактерии легко  выделить из морской и солоноватой  воды. На мясе и рыбе они образуют естественные накопительные культуры, особенно при низких температурах. Если морскую рыбу в неглубокой посуде наполовину залить соленой водой  и оставить на несколько дней в  холодильнике (при 4-6°С), то на поверхности  рыбы появятся колонии светящихся бактерий, которые можно выделить и получить в чистой культуре. Как правило, они  не вызывают гниения и не образуют токсичных веществ, но выделяют амины. Р. Бойль (1667) писал: «Иной кусок мяса вчера еще светился, а сегодня  из него уже приготовлено питательное  и вкусное блюдо».

Светящиеся бактерии. Все  выделенные до сих пор светящиеся бактерии - грам-отрицательные факультативные анаэробы, передвигающиеся с помощью 1-8 жгутиков. В зависимости от морфологии жгутиков (полярное или перитрихальное расположение, простые жгутики или жгутики в чехле) их относят к родам Photobacterium или Вепескеа. В анаэробных условиях большинство светящихся бактерий осуществляет муравьинокислое брожение или брожение смешанного типа, как это свойственно Enterobacteriaceae, и образует муравьиную, уксусную, молочную и янтарную кислоты, спирт, СО₂ и ацетоин. Как и многие другие морские бактерии, они являются галофилами; если поместить их в гипотоничную среду (дистиллированную воду), они мгновенно лизируются.

Рост и биолюминесценция в сильной степени зависят  от состава среды. Свечение наблюдается  только в присутствии кислорода, поэтому такие бактерии еще в  конце прошлого века использовались как чувствительные индикаторы для  выявления фотосинтетического образования  кислорода у зеленых и красных  водорослей в опытах со светом разной длины волны.

Процесс свечения. Свечение следует рассматривать как процесс аэробного окисления, своего рода побочный путь дыхания, приводящий не к образованию АТР, а к возбуждению какого-то промежуточного продукта, испускающего при этом свет. Дюбуа первым в 1885 г. исследовал процесс свечения, использовав водные экстракты из светящегося органа моллюска-точильщика Pholas dactylus; он выяснил, что в реакции участвуют вещество, экстрагируемое горячей водой (люциферин), и фермент, экстрагируемый холодной водой (люцифераза):

„                           Люцифераза 
Люциферин ----------- »- Свет

°2

В разных системах вещества, участвующие в биолюминесценции, различны. Лучше всего этот процесс  изучен у Photinus pyralis - американского светлячка. Люциферин его люминесцентной системы оказался производным бензтиазола. Люцифераза (Е) катализирует реакцию восстановленного люциферина (LH₂) с АТР; продукт этой реакции – аденилат - при окислении испускает свет:

LH₂ + ATP+ Е =£ E-LH₂-AMP+PPj 
E'LH₂~ AMP + 0₂ --- * Свет+ Продукты

Между количеством вступившего  в реакцию АТР и интенсивностью свечения существует прямая зависимость. Поэтому «светлячковая реакция» стала излюбленным методом количественного  определения АТР.

В бактериальном свечении тоже участвует несколько компонентов: восстановленный FMN, О₂ и альдегид с длинной цепью (тетрадеканаль). Люцифераза представляет собой монооксигеназу. Уравнение реакции можно написать следующим образом:

FMNH₂   +   0₂   +   R-СНО  -» FMN   +   Н₂0   +   R-СООН   +   hv

Окисление FMNH₂, вероятно, приводит к возбуждению FMN, т.е. к образованию [FMNH₂0], который испускает свет, возвращаясь в основное состояние:

[FMN• Н₂<Э]* -Л  FMNH₂0  -*  FMN   +   H₂0

Способность к свечению очень  распространена у грибов (Armillaria mellea, Partus stipticus и др.), у простейших (динофлагеллят) и у различных многоклеточных животных. У каракатиц и некоторых глубоководных морских рыб за свечение ответственны симбиотические бактерии, находящиеся в светящихся органах. Значение биолюминесценции для таких животных понятно, однако биологическая роль ее у одноклеточных организмов пока не ясна.

Масляная кислота (бутират), н-бутанол, ацетон, 2-пропанол и ряд других органических кислот и спиртов являются типичными  продуктами сбраживания углеводов  анаэробными спорообразующими бактериями (клостридиями). Поэтому клостридии, а также некоторые специализированные виды, сбраживающие только этанол, аминокислоты или иные вещества, рассматриваются  здесь в связи с маслянокислым  брожением, которое они вызывают.

Признаки. Род Clostridium относится к семейству Васillасеае. Как и другие представители этого семейства(Bacillus, Sporolactobacillus, De-sulfotomaculum и Sporosarcina), клостридии грам-положительны. Благодаря перитрихально расположенным жгутикам они очень подвижны. Вегетативные клетки палочковидные, однако форма их может изменяться в зависимости от условий среды. Овальные или шарообразные эндоспоры изменяют форму палочковидной материнской клетки, так как их диаметр, как правило, больше толщины этой клетки. Споры терморезистентны.

Физиологически клостридии отличаются резко выраженным бродильным типом метаболизма, а также чувствительностью к кислороду: они растут только в анаэробных условиях. Однако существуют, по-видимому, все переходные формы - от строго анаэробных видов (Clostridium pasteurianum, С. kluyveri) до почти аэротолерантных (например, С. histolyticum, С. acetobutylicum). Клостридии, как правило, не содержат гемопротеинов (цитохромов, каталазы). Некоторые виды способны, однако, образовывать цитохромы, если в питательной среде содержатся их предшественники. Из запасных веществ широко распространены крахмалоподобные полисахариды.

Температурный оптимум для  роста большинства известных  видов Clostridium лежит между 30 и 40°С Наряду с этими мезофильными представителями встречается много термофильных видов с оптимумом 60-75°С, таких как С. thermoaceticum и С. thermohydrosulfuricum. Подобно другим представителям Bacillaceae, клостридии способны расти только при нейтральной (или щелочной) реакции среды. Поэтому их рост, часто нежелательный, может быть полностью подавлен при подкислении (например, в квашеной капусте, силосе, фруктовых консервах, сырых колбасах).

Субстраты. Клостридии весьма сильно различаются в отношении субстратов, которые они могут использовать и сбраживать. Некоторые виды мало разборчивы и используют широкий круг веществ, другие узко специализированы и способны сбраживать лишь один или несколько субстратов. В целом же клостридиям доступно множество различных природных соединений. Они способны разлагать полисахариды (крах мал, гликоген, целлюлозу, гемицеллюлозы, пектины), нуклеиновые кис лоты, белки, аминокислоты, пурины и пиримидины. Одним клостри диям нужны сложные питательные среды или ростовые вещества, другие в них не нуждаются. Некоторые могут обходиться молеку лярным азотом как единственным источником этого элемента; азот они связывают с большой скоростью (Clostridium pasteurianum).

По способности использовать различные субстраты клостридии можно подразделить на ряд групп.Сахаролитические клостридии расщепляют преимущественно полисахариды или сахара. Пептолитическиеклостридии расщепляют белки, пептоны и аминокислоты. Группы в свою очередь объединяют на основе типов брожения и его продуктов (табл. 8.7 и 8.8).

Для получения накопительных  культур видов Clostridium можно воспользоваться некоторыми их особенностями. Поскольку их споры тер морезистентны, инокулят предварительно пастеризуют. Создавая строго анаэробные условия, заранее исключают рост всех аэробных бактерий. Так как некоторые бактерии, расщепляющие полисахариды, прикреплены к поверхности частиц, например к крахмальным зернам или к частицам целлюлозы в рубце жвачных или каких-то осадках, эти частицы можно сначала промыть, чтобы освободить их от других бактерий, а затем использовать как материал для инокуляции. Для поддержания способности к интенсивному брожению нужно и в последующей работе с выделенными штаммами всегда пользоваться пастеризованными инокулятами.

Биохимия брожения и его продукты. При брожении образуются в разных соотношениях кислоты (масляная, уксусная, молочная), спирты (бутанол, этанол, 2-пропанол), а также ацетон и газообразные продукты (Н₂ и С0₂). Клостридии расщепляют глюкозу по фруктозобисфосфатному пути. Водород, освобождающийся при дегидрировании глицеральдегидфосфата, переносится, как правило, на органические кислоты или кетоны, образуемые из пирувата или ацетил-СоА. Прототипом брожения, осуществляемого клостридиями, можно считать сбраживание глюкозы Clostridium butyricum и С.acetobutylicum; при этом образуются бутират, ацетат, бутанол, этанол, ацетон, 2-пропанол, С0₂ и Н₂. Выход продуктов варьирует в зависимости от условий.

Масляная кислота (бутират)-продукт конденсации двух молекул ацетил-СоА при участии тиолазы с образованием ацетоацетил-СоА и его последующим восстановлением (рис. 8.4). Ацетоацетил-СоА восстанавливается за счет NADH₂ при участии fi-гидроксибутирил-СоА-дегидро-    геназы до (3-гидроксибутирил-СоА. От последнего с помощью крото-назы отщепляется вода. Кротонил-СоА под действием флавинового фермента бутирил-СоА-дегидрогеназы восстанавливается до бутирил-СоА. От бутирил-СоА с помощью СоА-трансферазы СоА может пере носиться на ацетат; при этом освобождается масляная кислота, которая выходит в среду. Из ацетил-СоА при участии фосфотрансацетилазы иацетаткиназы может быть получен свободный ацетат, что сопрово ждается синтезом АТР из ADP.

При чистом маслянокислом  брожении образующийся при окислении  пирувата водород выделяется в газообразном виде. Когда глюкоза сбраживается согласно уравнению

Глюкоза  -у  Бутират   +   2С0₂   +   2Н₂

баланс водорода сходится; на один моль глюкозы образуются три  мо ля АТР.

Бутанол, бутират, ацетон и 2-пропанол образуются при сбраживании глюкозы  клетками Clostridiumacetobutylicum. При этом вначале выде ляется также масляная кислота; однако по мере подкисления среды (рис. 8.5) начинают синтезироваться ферменты (в том числе ацетоаце-татдекарбоксилаза), действие которых приводит к накоплению ацетона и бутанола. Процессы образования этих веществ тесно связаны между собой. В результате декарбоксилирования части ацетоацетата утрачи вается потенциальный акцептор водорода, который при восстановлении в бутират мог бы дважды присоединить 2[Н]. Этот водород так или иначе должен быть передан другим акцепторам, в том числе и только что образовавшемуся бутирату. Для восстановления до бутанола бути рат должен быть сначала активирован путем превращения в бутирил-СоА. Реакции, происходящие при образовании бутирата, ацетона и бу танола, представлены на рис. 8.4. При брожении в щелочной среде (например, в присутствии СаСО_э; табл. 8.9) С. acetobutylicum ведет себя как С. butyricum. Некоторые штаммы восстанавливают ацетон и выде ляют 2-пропанол.

Этанол образуется в результате восстановления ацетил-СоА.

Молекулярный водород может происходить из NADH₂, образующе гося как при расщеплении пирувата, так и при дегидрировании глице-ральдегидфосфата. Чем больше водорода может быть образовано при этом, тем меньше нужно синтезировать акцепторов во дорода (ацетоацетил-СоА). Таким образом, энергия связи ацетил-СоА может быть сохранена в форме АТР. Значит, если при сбраживании глюкозы С. butyricum на один моль глюкозы образуется больше двух молей Н₂ и поэтому меньше бутирата и соответственно больше ацета та, то выход АТР может превышать 3 моля (см. ниже о Ruminococcus).

Поскольку ацетон, 2-пропанол и бутанол служат важными органиче скими растворителями, брожение, осуществляемое клостридиями, имеет большое техническое значение. Именно в связи с получением этих ве ществ перед промышленносью впервые встала задача проведения ми кробиологических синтезов в условиях, исключающих возможность вся кого загрязнения.

Сбраживание этанола  и ацетата. Из накопительных культур Methanobacterium omelianskii, содержавших в качестве субстрата этанол, была выделена анаэробная спорообразующая бактерия, которая наряду с этанолом нуждается и в ацетате. Эта бактерия -Clostridium кluyveri-превращает смесь уксусной кислоты и этанола в масляную и капроновую кислоты и молекулярный водород (рис. 8.6). Ацетат слу жит дополнительным акцептором водорода, и он образуется в ходе брожения.   АТР   синтезируется   только   при   ацетаткиназной   реакции.

Сбраживание лактата  и ацетата. Из накопительных культур, содержа щих в качестве субстрата лактат, была выделена бактерия Clostridium tyrobutyricum, которой тоже необходим ацетат как дополнительный ак цептор водорода, если главным субстратом служит лактат или глицерол: СН₃

С. tyrobutyricum сбраживает глюкозу по схеме, известной для С. butyricum, не нуждаясь в экзогенном акцепторе водорода.

Сбраживание глутаминовой кислоты. Из множества процессов броже ния, при которых аминокислоты в анаэробных условиях превращаются в жирные кислоты, С0₂ и аммиак, мы рассмотрим только расщепление глутамата бактерией Clostridium tetanomorphum. Это брожение цривле-кло к себе внимание потому, что на его примере была выяснена биохи мическая функция витамина В₁₂. С. tetanomorphum обычно выделяют из накопительной культуры с гистидином в качестве субстрата. Гистидин расщепляется через глутамат. При сбраживании глутамата образуются масляная и уксусная кислоты, аммиак, С0₂ и молекулярный водород. Путь катаболизма глутамата включает ряд необычных реакций (рис. 8.7). Сначала разрываются связи между углеродными атомами 2 и 3 и образуются связи между атомами 2 и 4, и в результате получается аминокислота- с разветвленной цепью - метиласпарагиновая кислота. В этом участвует кофермент-производное витамина В₁₂. Лишь на этой стадии происходит дезаминирование. К ненасыщенной мезаконовой (метилфумаровой) кислоте присоединяется вода, а образующаяся цитра-малевая (2-метил-яблочная) кислота расщепляется затем на уксусную и пировиноградную кислоты. Уксусная кислота выделяется, а пировино-градная рассмотренным выше путем превращается в масляную кислоту и С0₂.

Сопряженное сбраживание  двух аминокислот (реакция Стикленда). Пептолитические клостридии (табл. 8.7, V) гидролизуют белки и затем используют аминокислоты. Многие аминокислоты сбраживаются толь- ко вместе с какими-нибудь другими. Как установил Стикленд (1934), Clostridium sporogenes быстро сбраживает смесь аланина и глицина, но не может использовать ни ту ни другую из этих аминокислот в отдель ности. Судя по суммарному уравнению

Алании  +  2 Глицин  +  2Н₂0 -► 3 Ацетат +  3NH₃  +  С0₂ аланин служит донором водорода, а глицин-акцептором:

СН₃-CHNH₂-СООН  +  2Н₂0 -* СН₃СООН  + NH₃  +

+ С0₂  + 4[Н] 2CH₂NH₂-СООН  + 4[Н] - 2СН₃-СООН  +  2NH₃

Источником энергии, очевидно, служит сопряженная реакция окисления-восстановления. Роль донора водорода могут выполнять, напри мер, аланин, лейцин, изолейцин, валин, серии, метионин и т.д. Акцепторами водорода могут служить глицин, пролин, аргинин, триптофан и т.д. Аминокислота-донор дезаминируется в оксокислоту, которая за тем в результате окислительного декарбоксилирования превращается в жирную кислоту. Этот этап сопряжен с фосфорилированием и, таким образом, представляет собой реакцию, доставляющую энергию. Водо род, перенесенный при этом на ферредоксин, снова связывается при вос становительном дезаминировании аминокислоты-акцептора. Однако не все аминокислоты используются всеми пептолитическими клостридия-ми. 

Маслянокислое и уксуснокислое (ацетатное) брожение, осуществляемое неспорообразующими бактериями. Некоторые роды анаэробных бактерий близки к клостридиям по продуктам брожения; они, однако, не образуют спор, и многие из них грам-отрицательны. Большинство таких бактерий, образующих масляную и уксусную кислоты, было выде лено из рубца, где они участвуют в разложении целлюлозы, крахмала и других углеводов. Они выделяют много молекулярного водорода и СО ₂ и создают метаногенным бактериям условия для образования метана. Из бактерий рубца, образующих масляную кислоту, следует особо упомянуть Bytyrivibrio fibrosolvens, а из обитающих в рубце продуцентов уксусной кислоты -Ruminococcus albus. Этот последний вид-строгий анаэроб, использующий целлюлозу и ксилан, а также многие сахара. Он способен превращать 1 моль глюкозы в 2 моля ацетата, 2 моля С0₂ и 4 моля Н₂-правда, при условии, что концентрация выделенного водорода поддерживается на низком уровне. Это возможно в смешанной культуре с какой-либо бактерией, использующей водород, например Vibriosuccinogenes (рис. 8.8). Из приведенной схемы видно, что при чистом ацетатном брожении может быть образовано 4 моля АТР на 1 моль глюкозы. Столь высокая эффективность регенерации АТР возможна, однако, лишь в том случае, если все возникающие при расщеплении глюкозы восстановительные эквиваленты будут освобождаться в виде молекулярного водорода (см. выше).

Клостридии - возбудители  болезней и продуценты токсинов. Неко торые пептолитические клостридии могут быть возбудителями болезней при раневой инфекции (газовая гангрена и столбняк), а также причиной пищевых отравлений. Споры их очень распространены в почве. Если споры Clostridium histolyticum илиС. septicum попадают в откры тую рану, к которой нет доступа воздуха или где аэробные бактерии,

потребляя кислород, создают  анаэробные условия, то эти клостридии начинают расти, расщеплять с помощью  протеиназ коллаген и другие белки, вызывать образование дурно пахнущих продуктов брожения и газа. С такого рода газовой гангреной («госпитальной  гангреной») в прежние времена  можно было бороться только путем  ампутации пораженной конечности. С  раневой инфекцией связан и до сих пор еще не редко встречающийся  столбняк. Его вызывает Clostridium tetani. Эта бактерия при своем росте выделяет очень сильный нейротоксин, вызы вающий тонические судороги мышц.

Наиболее тяжелую форму  пищевого отравления - ботулизм - вызывает Clostridium botulinum. Это широко распространенная почвенная бактерия, которая может развиваться в недостаточно простерилизованных мясных продуктах и бобовых консервах. Она получила свое название потому, что встречается в колбасе (лат. botulus - колбаса). Образуемый ею токсин в случае потребления зараженного продукта может вызвать смерть вследствие нервного паралича, в частности паралича дыхания. Токсин этот, к счастью, термолабилен и быстро (за 15 мин) инактивируется при кипячении.

Некоторые клостридии (Clostridium formicoaceticum, С. thermoaceticum, С. acidi-urici и С. cylindrosporum)способны переносить водород, отщеп ленный от субстрата в начальных реакциях окисления, только на С0₂ и образуют при этом ацетат:

8[Н]   +   2С0₂   -*  СН₃-СООН   +   2Н₂0

Термофильный вид С. thermoaceticum и мезофильный С. formicoaceticum сбраживает гексозы в основном до ацетата. Процесс идет по фруктозобисфосфатному пути, и на 1 моль гексозы образуется при этом почти 3 моля ацетата. Большая часть двуокиси углерода, ос вобождающейся при расщеплении пирувата, должна соответственно снова фиксироваться и служить акцептором водорода. Образование ацетата из С0₂ и восстановительных эквивалентов (электронов), осво бодившихся в начальных окислительных реакциях, происходит по пути, показанному на рис. 8.9.

Гексоза окисляется по обычному для клостридиев фруктозобисфос фатному пути до пирувата, а последний  с помощью пируват : ферредок-син-оксидоредуктазы (1), фосфотрансацетилазы (2) и ацетаткиназы (3) превращается в ацетат и С0₂ с образованием также ферредоксина-Н₂ и АТР. Акцептором водорода служит С0₂. Молекулы С0₂ частично восстанавливаются при участии формиатдегидрогеназы (4) в формиат, а затем в метильную группу третьей молекулы ацетата и частично при участии СО-дегидрогеназы (5) в СО, превращаясь далее в карбоксиль ную группу ацетата. Восстановление формильной группы до метильной происходит с помощью тетрагидрофолата (FH₄) как кофермента. Ме тальная группа затем переносится на комплекс белка с корриноидом

(В₁₂-коферментом) и карбоксилируется путем присоединения связанного СО. Продукт этих превращений-ацетилкофермент А; из него обычным путем образуется ацетат, что сопровождается регенерацией АТР.

Этот путь синтеза ацетил-СоА  из С0₂ и водородных эквивален тов - ацетил-СоА-путь - во многом сходен с синтезом ацетата анаэробно дышащими метанобразующими и ацетогенными бактериями (разд. 9.4 и 9.5).

У Clostridium formicoaceticum и С. thermoaceticum был найден цито-хром Ъ. Способны ли эти бактерии, а также С. aceticum и другие клостридии получать энергию путем фосфорилирования, связанного с транспортом электронов, еще не выяснено