Вирус ньюкаслской болезни

Федеральное Государственное  Образовательное Учебное Заведение  Высшего Профессионального Образования

Московская Государственная  Академия Ветеринарной Медицины и Биотехнологии  имени К.И.Скрябина

Кафедра ветеринарной вирусологии

Реферат на тему: 
«Вирус ньюкаслской болезни»

Подготовила:

студентка 9 группы 3 ФВМ

Андронова А.А.

Преподаватель:

к.б.н., доцент

Третьякова И.В.

Москва 2013 г.

Содержание

1. Введение………………………………………………………………………..3
2. Определение болезни………………………………………………………….4
3. Характеристика возбудителя………………………………………………….4
4. Эпизоотология…………………………………………………………………7
5. Течение болезни и клинические признаки…………………………………..8
6. Патогенез………………………………………………………………………9
7. Патологоанатомические признаки………………………………………..….9
8. Диагностика…………………………………………………………………..10

• Индикация вируса………………………………………………….….10
• Идентификация вируса……………………………………………..…12
• Выделение вируса…………………………………………………..…15
• Культивирование вируса…………………………………………...…20
• Определение вирулентности……………………………………….…21

9. Иммунитет и специфическая профилактика…………………………….…24

10. Лечение………………………………………………………………………..25
11. Профилактика……………………………………………………………...…25
12. Меры борьбы……………………………………………………………..…..25
13. Меры охраны здоровья людей………………………………………………26
14. Список использованной литературы………………………………………..26

Введение

 
Болезнь, отличающаяся от классической чумы птиц, была впервые зарегистрирована на острове Ява Краневельдом в 1926 г. С 1927 г. заболевание стали регистрировать в различных странах Азии, Америки  и Европы. Английский исследователь  Дойль в 1927 г. обнаружил болезнь  в окрестностях г. Ньюкасла и дал  ей соответствующее название.

В США заболевание описано  в 1935 г. как пневмоэнцефалит цыплят. Во Вторую мировую войну болезнь  широко распространилась в европейских  странах и была занесена на территорию нашей страны. В настоящее время  в России заболевание относится  к контролируемым инфекциям в  промышленных птицехозяйствах.

Очень высокая эпизоотологическая опасность заболевания связана  с разносом инфекции на различные  континенты с птицеводческой продукцией. Поэтому болезнь Ньюкасла — единственная из болезней птиц, включенная МЭБ в  список А (особо опасных болезней).

Экономический ущерб от БН значительный ввиду высокой заболеваемости непривитой птицы (среди цыплят до 100 %) и летальности (60...90 %). Переболевшие цыплята плохо растут. Большие  затраты связаны с проведением  жестких карантинных мероприятий  и уничтожением больной и подозрительной в заболевании птицы.

Определение болезни

Болезнь Ньюкасла (лат. — Morbus Newcastl; англ. — Newcastle Disease; псевдочума, атипичная чума, азиатская чума, псевдоэнцефалит, болезнь Дойля, болезнь Филарета, болезнь Ранкхета, брауншвейгская чума; ньюкаслская болезнь, БН) — высококонтагиозная болезнь птиц из отряда куриных, проявляющаяся поражением органов дыхания, желудочно-кишечного тракта и центральной нервной системы.  

Характеристика  возбудителя 

Возбудитель — РНК-содержащий вирус из рода Paramixovirus семейства Paramixovmdae. Размер вириона 120...380нм. Оболочка вирионов имеет выступы нити длиной 8 нм и  содержит АГ-компоненты. Внутренний компонент - нуклеокапсид .представляет собой  длинную заостренную пуговку  диаметром 13 им. Структурные единицы - протеины этой трубки (капсомеры) расположены  по спирали вокруг центральной оси, внутри них находится РНК. Вирус  обладает гемагглютинирующими свойствами, репродуцируется в 9... 12-дневных куриных  эмбрионах, вызывая их гибель, развивается  во многих первичных и перевиваемых культурах клеток с образованием ЦПД. Различают девять серологических вариантов возбудителя.

По степени патогенности штаммов вируса болезни Ньюкасла, циркулирующих в хозяйствах, различают: велогенные — высокопатогенные, мезогенные — средней степени патогенности и лентогенные — низкой степени  патогенности, или авирулентные. Кроме  того, полевые штаммы вирусов могут  отличаться тропизмом (способностью поражать отдельные органы и системы организма). Различают висцеротропные, энтеротропные, пневмотропные и политропные  эпизоотические штаммы.

Устойчивость вируса БН к  действию физических и химических факторов зависит от наличия белка и  рН среды. Вирус устойчив при рН в  диапазоне 2,0...10,0; в высушенных органах  при температуре 17...18°С — 2 года; в  птичниках в зимнее время — 140 дней, летом — 7 дней. В гниющих  трупах инактивируется через 3 нед. В  замороженных тушках кур не погибает свыше 800 дней. При кипячении вирус в тушках птиц погибает лишь через 40...60 мин. Биотермические процессы, развивающиеся при хранении помета, инактивируют вирус через 20 дней. Вирус нестоек к действию дезинфицирующих средств в общепринятых концентрациях (растворы формалина 1...2%-ные, хлорной извести 3%-ный, гидроксида натрия 2%-ный, ксилонафта-5 4...5%-ные).

Вирус локализуется в паренхиматозных  органах, костном и головном мозге, мышцах, трахеальной слизи, толстом  и тонком кишечниках, содержится в  различных выделениях. В период выраженной клинической картины болезни  в изобилии выделяется во внешнюю  среду с фекалиями, трахеальной  слизью и выдыхаемым воздухом. Вирус, как правило, можно выделить только в начале болезни. Переболевшие птицы  мотуг долго быть вирусоносителями.

В организме неиммунных птиц велогенный вирус НБ обнаруживался  через 24-48 ч и далее в течение 10 дн во всех органах и тканях. У  иммунных или частично иммунных птиц наиболее продолжительное время (19 дн) вирус выделяли из железистого  желудка, лимфоидных образований слепой кишки, фабрициевой сумки и мозга. Поскольку ни один из указанных органов  не отличался в отношении тропизма вируса, то в полевой диагностике  рекомендуется исследовать все  четыре органа. Не отмечено гибели среди  групп птиц с высоким и низким уровнем иммунитета, на основании  чего сделан вывод, что в странах, где проводится поголовная вакцинация или, где распространены лентогенные  штаммы вируса, появление велогенного  штамма может пройти не замеченным.

При наличии циркулирующих  АТ вирус иногда удается выделить из мозга переболевших птиц. Показано, что вирулентные штаммы могут  бессимптомно персистировать в организме  иммунных птиц в течение 70 дн. Нет  зависимости между титрами анти-ГА и степенью выделения вируса во внешнюю  среду. С увеличением продолжительности  вирусоносительства (выше 70 дн) вирулентность  исходных штаммов вируса снижается  независимо от первоначального титра  анти-ГА, однако латентная форма  инфекции может свободно переходить в клинически выраженную. Было показано, что после заражения иммунизированной птицы велогенным вирусом возможно носительство и выделение последнего в течение 14-17 дн, т.е. поствакцинальный иммунитет не исключает циркуляции дикого вело- или мезогенного вируса. Возможность длительной персистенции вирулентного вируса в организме  вакцинированной птицы может  обусловливать возникновение вирусоносительства.

Гемагглютинирующие  свойства. Вирус агглютинирует эритроциты амфибий, рептилий, птиц, человека, мышей и морских свинок. Эритроциты КРС, овец, коз, свиней и лошадей агглютинируются не всеми штаммами вируса. Разнообразие в аггяютинабельности эритроцитов КРС зависит от ионной силы, концентрации солей и pH р-ра. Инагглютинабельность эритроцитов опре-, деленных видов объясняется, вероятно, быстрой элюцией с них вируса. Приблизительно 105 инфекционных единиц (ИД50) вируса равны 1 ГА. Некоторые штаммы вируса теряют ГА-активность при 56°С за 5 мин, сохраняя инфекционные свойства, другие, наоборот, сохраняют ГА-способность после прогревания при 56°С в течение 180-240 мин, а инфекционная активность их утрачивается через 90 мин. Для отдельных штаммов НБ характерна определенная температура, при которой они утрачивают Г A-активность. Эго свойство можно использовать для дифференциации штаммов.

Гемолитические  свойства. Все штаммы вируса обладают гемолитической активностью по отношению к эритроцитам морских свинок, лошадей и кур, которая не связана с вирулентными свойствами и находится в прямой зависимости от Г А-титра вируса. Однако имеется и противоположное мнение. По гемолитической активности штаммы вируса НБ можно разделить на слабоактивные (S и М) и высокоактивные (Т, Ни В). На гемолитические свойства вируса влияют концентрация солей, pH и температура среды, вид эритроцитов. При 4°С она резко снижается. Гемолитические свойства вируса можно инактивировать специфической антисывороткой и формалином.

Токсические свойства. Токсичность вируса зависит от метода введения вируса: интра-церебрально, интраназально, внутривенно. У кроликов, зараженных в мозг, в первые 2 дн развиваются параличи, и к исходу 3 сут животные гибнут. При внутривенном заражении кроликов вирус вызывает пирогенную реакцию, могут появиться лимфоцитопения и лихорадка. У мышей при интраназальном введении развивается летальная пневмония, а после нескольких повторных интраназальных введений - гепатизация легких. После 1-кратного замораживания-оттаивания вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости или обработки ее in vitro гомологичной иммуносывороткой токсические свойства вируса исчезают. Интерфероногенные свойства. Многие штаммы, особенно шт. Н, - хорошие индукторы интерферона. Выделены ts-муганты этого вируса и изучена их способность индуцировать интерферон в первичных клетках КЭ. Показано, что 5% вирусного генома, связанного с инфекционностью, необходимо для индукции интерферона. Существенную роль в индукции интерферона играет ранняя транскрипция (2-3 ч после заражения) генома вируса.

Эпизоотология 

В естественных условиях болезнь Ньюкасла чаще регистрируют у птиц из отряда куриных (куры, индейки, цесарки, фазаны, павлины). Описаны случаи заражения синантропных птиц (голуби, воробьи, сороки, попугаи, ястребы). Степень восприимчивости к заболеванию птицы разных пород и возраста неодинакова. Иногда наблюдают случаи вспышек БН у цыплят при отсутствии заболевания взрослой птицы.

Источники возбудителя инфекции — больная и находящаяся в  инкубационном периоде птица. Из организма вирус выделяется с  секретами, пометом, яйцами. Факторами  передачи возбудителя могут быть инвентарь, подстилка, корм, перо и пух, полученные от больных птиц, тушки  вынужденно убитой птицы. Вирус также  может находиться внутри и на скорлупе яиц, собранных от больной птицы. В птичниках, в которых содержатся больные, вирус циркулирует в  воздухе при работе вентиляторов, а также выбрасывается в окружающую среду и разносится на расстояние до 1600 м, а при ветреной погоде —  до 3...5 км. Заражение птицы происходит алиментарным и аэрогенным путями, через корм, воду, воздух, при тесном контакте здоровых и больных особей. Вирус способен выделяться в инкубационном  периоде через 24 ч после заражения  птицы, обнаружить его в организме  переболевшей птицы удается в  течение 2...4мес после клинического выздоровления.

Резервуаром возбудителя  могут быть перелетные дикие птицы, а также домашние утки, гуси.

В настоящее время болезнь  Ньюкасла чаще проявляется в виде энзоотических вспышек, а в недалеком  прошлом — в виде эпизоотии. Болезнь  имеет некоторую периодичность  и относительную сезонность в  летне-осенний период, связанную  как с увеличением поголовья  в это время года, так и с  усилением хозяйственной деятельности, контакта птицы. В птицеводческих хозяйствах с поточной системой содержания птицы  инфекция может носить стационарный характер. Это объясняется длительным сохранением вируса во внешней среде в зимнее время года, переносом вируса свободно живущей птицей, вирусоносительством у переболевших кур. В активном состоянии вирус может сохраняться в организме клещей, обитающих в птичниках.

Заболеваемость у непривитого  поголовья птицы составляет 90... 100 %, летальность в зависимости от условий содержания колеблется от 40 до 80%.

Течение и клинические  признаки 

В зависимости от восприимчивости  организма птиц и циркуляции полевых  штаммов вируса болезни Ньюкасла в хозяйствах различают четыре формы  заболевания:

1) велогенную (острую), которая  сопровождается коротким инкубационным  периодом, угнетением, слабостью, тремором, опистотонусом, расстройством кишечника  и быстрой гибелью птицы. Эту  форму заболевания вызывают высокопатогенные  азиатские штаммы вируса;

2) мезогенную (под-острую) форму,  связанную с поражением органов  дыхания и потому получившую  название «пневмоэнцефалит». Болезнь  сопровождается кашлем, удушьем,  поражением нервной системы; вызывают  эту форму болезни мезогенные  штаммы вируса;

3) лентогенную (хроническую), проявляющуюся незначительными  поражениями кишечника, органов  размножения (энтериты и овариосальпингиты); ее вызывают лентогенные штаммы; 4) асимптоматическую (атипичную)  без выраженных клинических признаков  и значительного отхода птицы,  но сопровождающуюся формированием  антител в организме птицы;  она также вызывается лентогенными  штаммами и получила название  иммунизирующей субинфекции, т.  е. скрыто протекающей инфекции  с формированием антител в  сыворотке крови.

Патогенез

 Вирус, проникая в  организм, размножается в клетках  эндотелия, в результате чего  клетки кровеносных сосудов разрыхляются, нарушается их порозность и  в них развиваются воспалительно-некротические  процессы. Через 24-36 ч вирус локализуется  в паренхиматозных органах, костном  и головном мозге, кишечнике  и мышцах, вызывая наряду с  резким расстройством гемодинамики  тяжелые некрозо-дистрофические  изменения. 

Патологоанатомические признаки 

Изменения зависят от тяжести  течения процесса и поражения  отдельных систем организма и  варьируются в широких границах.

При остром течении болезни преобладают изменения, характерные для геморрагической септицемии. В органах пищеварения отмечают кровоизлияния в выводные протоки желез железистого желудка, а также на границе железистого и мышечного желудков, в двенадцатиперстную кишку, тонкий отдел кишечника, прямую кишку. Кровоизлияния в основания слепых отростков кишок обнаружены у 100 % больных, в переднюю часть прямой кишки— у 98,2%, по выводным протокам желез желудка —у 60 %. Отмечают кровоизлияния и в фолликулы яичника.

При хроническом течении труп истощен, оперение вокруг клоаки запачкано пометом. В кишечнике находят плоские дифтероидные язвы с многочисленными петехиями. В результате воспаления стенки двенадцатиперстной кишки и других участков тонкого отдела кишечника истончены. Отмечают также катаральный фарингит, трахеит, фибринозные и некротические очаги в легких, печени.

При осложненной форме  находят воспаление воздухоносных  мешков, некротический гепатит, серозно-фибринозный  перитонит, овариосальпингит.

Гистологические изменения  проявляются в виде негнойного энцефалита, пролиферативных процессов вокруг ретикулоэндотелиальной ткани.

Диагностика  

При характерном течении  болезни постановка диагноза не представляет сложности. При вспышке болезни  на фоне пассивного или поствакцинального  иммунитета, а тем более в стационарно  неблагополучном хозяйстве поставить  диагноз бывает чрезвычайно трудно. В этих случаях тщательно изучают  эпизоотическую ситуацию, клиническую  и патологоанатомическую картину. Решающее значение имеют лабораторные исследования - выделение вируса на КЭ, его индикация и идентификация  в РГА - РТГ А, определение вирулентности  вируса на КЭ и цыплятах, а также  выявление АТ в сыворотке переболевших или вакцинированных птиц в РТГ  А (10,11).

Индикация вируса

Экспресс-методы выявления антигена вируса НБ. Через 24 ч в инфицированных культурах клеток (шт. Н) наблюдают появление многоядерных симпластов и цитоплазматических эозинофильных включений неправильной глыбчатой формы. Через 48 ч после заражения цитоплазма бывает нафарширована тельцами-включениями. В ядрах изменений не отмечалось. Разработан высокочувствительный авидин-биотиновый ИФА. В данном тесте применяют монАТ к вирусу НБ, очищенные и меченые биотином. Тест характеризуется простотой выполнения и короткими сроками (3-4 ч) получения результатов (41). Непрямой точечный вариант ИФА является быстрым, легким, специфическим методом обнаружения вируса в смывах с различных органов (42).

В организме птицы, зараженной вирусом НБ, в процессе продолжительного контакта с вирусом эритроциты теряют способность Г А (становятся инаглютинабельными). Чтобы косвенно доказать присутствие  вируса в организме, от исследуемой  птицы берут 0,04 мл крови в формалинизированую (0,1%-ную) вируссодержащую аллантоисную жидкость, вирус должен обладать высокой  агглютинирующей активностью. Если на стекле наступает гемагглютинация, это свидетельствует об отсутствии в исследуемой капле крови  вируса НБ. Учет реакции ведут через  несколько секунд. Метод применим для выявления патогенного вируса в вакцинированном стаде, так  как вакцинные штаммы лентогенной  группы инагглютинабельности эритроцитов  не вызывают.

РГА. Используют с целью ориентировочного определения присутствия вируса в исследуемом материале и для его титрования. ГА вируса входят в состав вирусной частицы (вириона) и могут содержаться в инфицированных аллантоисной и амниотической жидкостях, оболочках и органах КЭ, легких, печени, почках и селезенке погибшей птицы, в жидкой и клеточной фракциях тканевых культур. Можно брать эритроциты крови кур, морской свинки, лошади, человека и др. Разные виды вирусов и даже шт. одного и того же вируса могут отличаться друг от друга способностью агглютинировать эритроциты указанных животных. Спектр Г А служит характеристикой биологической активности вируса и штаммов. Например, большинство шт. вируса НБ не вызывает ГА эритроцитов лошади, чем отличается от вируса классической чумы птиц, который способен ГА их в высоких разведениях.

Реакция гемагглютинации (РГА) метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на наличии у некоторых вирусов способности избирательно агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

Техника постановки РГА

      На плексигласовой  доске готовят двукратные возрастающие  разведения в объёме 0,5 мл исследуемого  вируссодержащего материала , начиная  с 1:10 и до 1:1280. в луночки с  разведениями добавляют равные  объёмы 1% взвеси эритроцитов кур.  Доску осторожно встряхивают  и оставляют на 30-45 мин при комнатной  температуре. Учёт результатов  проводят по трёхкрестовой системе  в зависимости от внешнего  вида осадка эритроцитов. При  гемагглютинации на «+++» осадок  имеет форму зонтика и занимает  всё дно лунки. При отсутствии  агглютинации эритроциты оседают  в центре лунки в виде компактного  диска.

   Титром вируса  называется то наибольшее его  разведение, при котором ещё наблюдается  выраженная гемагглютинация («+++»  или «++»).Количественное содержание  вируса в разведении, равном титру,  называется гемагглютинирующей  единицей (содержится в 0,5 мл соответствующего  разведения). Определение этой величины  необходимо для постановки РТГА, в которой в качестве рабочей  дозы вируса берут 4 гемагглютинирующие  единицы.   

Серологическая  идентификация

Вирусы НБ можно идентифицировать в РТГА, PH, РСК, РИФ и др.

РТГА. Основной, высокоспецифичный и простой в выполнении метод идентификации вируса НБ. Для постановки необходимо иметь эталонные специфические сыворотки к вирусу и выделенный на КЭ вирус (аллантоисная жидкость). РТГА ставят общепринятым методом в макро- и микровариантах. Идентификацию вируса считают завершенной, если эталонная специфическая сыворотка тормозит ГА-активность вируса в пределах целого илн 1/2-1/8 титра с гомологичным эталонным АГ.

Для быстрой идентификации  выделенного вируса рекомендуют  следующий метод: на предметное стекло наносят капли аллантоисной жидкости и 1%-ную суспензию куриных эритроцитов. Затем ставят пробу на нейтрализацию  ГА-активности. Для этого на предметное стекло наносят каплю той же аллантоисной жидкости, каплю эталонной специфической  сыворотки и хорошенько перемешивают. Если агглютинации эритроцитов нет, значит выделенный вирус является вирусом  НБ.

Реакция торможения гемагглютинации - метод идентификации вируса или  выявления противовирусных антител  в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к  нему сыворотки крови.

Принцип титрования антител в РТГА 

Принцип титрования антител  в РТГА состоит в следующем: 
- готовят ряд последовательных (обычно 2-кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаше по 0,25 или 0,2 мл); 
- к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; 
- смеси выдерживают определенное время при определенной температуре (для вируса Ньюкаслской болезни 40-60 мин при комнатной температуре); 
- ко всем смесям добавляют равные объемы 1 % суспензии отмытых эритроцитов; 
- после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах. 
В реакции предусматриваются контроли сыворотки, вируса и эритроцитов. 
То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинаиию. принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

РСК. В диагностической практике при НБ используют редко. Предложена РСК как быстрый и дешевый метод дифференциации штаммов вируса НБ по вирулентности.

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

РИФ. Метод основан на применении родаминсульфохлорида для конъюгации иммунной сыворотки к вирусу с целью идентификации вирусного АГ в пораженных клетках павших и убитых птиц. Применение этого красителя наиболее приемлемо и удобно благодаря яркому оранжево-красному свечению АГ. ФИТЦ-конъюгаты (флюоресцеинизотиоцианат) менее пригодны. Для обнаружения специфического АГ применяют гомологичные РСХ-конъюгаты общепринятым методом. В большинстве случаев АГ выявляется в ядрах клеток белой крови (лимфоцитах, моноцитах, псевдоэозинофилах и эозинофилах) или пораженных клеток указанных органов в виде яркой флюоресценции оранжево-красного цвета. В контрольных препаратах, обработанных теми же гомологичными конъюгатами, подобного свечения не наблюдается, лишь в некоторых случаях выявляется точечное желто-оранжевое свечение в цитоплазме юных эозинофилов.

Реакция иммунофлюоресценции. Прямой метод иммунофлуоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченных флуорохромом с антигеном, который нахо-дится на клетке, в клетке или тканях. В качестве флуорохрома часто используют флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ). Этот краситель дает зеленое свечение в ультрафеолетовых лучах, а тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) - оранжево-красное свечение. Прямой метод одноэтапный: на фиксированный мазок клеток с антигеном наносят диагностическую сыворотку с мечеными антителами, инкубируют, отмывают и учитывают свечение в люминесцентном микроскопе. Непрямой метод иммунофлуоресценции заключается в том, что антиген обрабатывают обычной диагностической сывороткой, а для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют антисыворотку, меченную флуорохромом. Непрямой метод позволяет обнаруживать различные комплексы антиген-антитело с помощью одной меченной антиглобулиновой сыворотки.

Установлено, что вирусный АГ в зараженных культурах клеток выявляется, начиная с 4 ч (для велогенных штаммов) и с 6 ч (для лентогенных  штаммов), до 10-12 ч свечение АГ отмечали только в цитоплазме, а через 20 ч - в цитоплазме и ядрах клеток.

РНГА. Во ВНИВИП разработана методика получения высушенных стандартных высокочувствительных и специфических эритроцитарных тест-препаратов с АТ к вирусу НБ для экспресс-диагностики. Указанный эритроцитарный диагностикум позволяет выявить вирус в экскретах органов и тканей

Реакция непрямой (пассивной) агглютинации. Для получения феномена агглютинации антиген предварительно адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, целлюлоза, полистирол и др.) или клетки (эритроциты барана, 1(0)-группы крови человека). В реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Если нагрузить эритроциты антителами, то их можно применять для выявления антигенов.

ИФА. Методом ИФА вирусный АГ выявляют в ранние сроки после заражения до появления ЦП Д. Через 12 ч после заражения видны единичные АГ-содержащие клетки.

Иммуноферментный  анализ (ИФА). В методах иммуноферментного анализа используют иммунореагенты, меченные ферментами. Наиболее широко используется твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы используют полистироловые или поливиниловые планшеты или шарики, на которых адсорбированы антигены или антитела. Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках полистироловой пластины. Затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченые ферментом. После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат и хромоген для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. О наличии и количестве антител судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора. 

Выделение вируса

Вирус, в зависимости от его тропизма можно выделить из головного  и костного мозга, трахеи, кишечника, селезенки, легких, печени. Для исследования рекомендуется брать голову, легкие, трахею и селезенку от только что  павших или вынужденно убитых птиц. Вирус удается выделить только в  период вспышки болезни. Через 15 дн выделить его обычными методами, как  правило, не удается. Поэтому патологический материал необходимо брать в начале вспышки (в первые 3-5 дн) и направлять в лабораторию в термосе со льдом. Внутренние органы можно помещать в стерильный 50%-ный р-р глицерина  на дистиллированной воде. Смывы из трахеи и клоаки лучше консервировать на холоде или при температуре  не выше 4°С

Заражение КЭ. Эмбрионы 9-11-дн возраста заражают по 0,2 мл, не менее 10 КЭ на ка-ждый материал, в аллантоисную полость общепринятым методом и инкубируют 72 ч при 37,5°С (погибших в первые 24 ч эмбрионов не учитывают). Если через 72 ч нет погибших КЭ, то 5 из партии зараженных убивают, оставляя их при 4°С на ночь. Остальные 5 КЭ инкубируют до 120 ч и затем убивают. Аллантоисную жидкость от погибших и живых КЭ проверяют на ГА в РГА с куриными эритроцитами (1-5%-ная взвесь). Обычно велогенные штаммы вируса вызывают гибель КЭ уже через 32-60 ч после заражения, мезогенные - через 60-90, а лентогенные - через 100 ч и более. Иногда при первом пассаже не удается выделить вирус, поэтому необходимо провести не менее 3-х “слепых” пассажей. Учитывая, что в вакцинируемых стадах можно выделить и вакцинный вирус, вторым этапом исследования должно быть определение патогенности выделенного изолята. Первым ориентиром могут служить данные РГА. Обычно полевые изоляты обладают низкой ГА-активностью, проявляя ее в разведениях 1:16- 1:128, тогда как вакцинные штаммы, наоборот, проявляют высокий ГА-титр - 1:256 - 1:2048.