Возбудитель лептоспироза

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Кафедра микробиологии

 

 

Реферат

 

по дисциплине «Микробиология»

на тему:

 

«Возбудитель лептоспироза»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Москва, 2014

Оглавление.

Введение…………………………………………………………...………………3

Классификация возбудителя………………………………………...……………4

Эпизоотические особенности…………………………………………..………4-6

Отбор патологического материала………………………………………..……7-8

Факторы патогенности……………………………………………………………8

Лабораторная диагностика…………………………………………………….....8

Тикториальные свойства……………………………………………………….8-9

Культуральные свойства……………………………………………….…….10-11

Биохимические свойства………………………………………………………...11

Серолигические свойства ………………………………………………...….11-13

Биопроба……………………………………………………………………...14-15

Биопрепараты……………………………………………………...…………15-17

Список использованной литературы……………………………………..……18

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение.

        Лептоспироз — инфекционная природно-очаговая болезнь животных и человека, характеризующаяся кратковременной лихорадкой, анемией, желтухой, гемоглобинурией, геморрагическим диатезом, некрозом слизистых оболочек и кожи, атонией органов пищеварения, абортами. Болезнь может протекать бессимптомно. Птицы к лептоспирозу невосприимчивы.

       Для лептоспироза наиболее типичны контактный, водный и кормовой пути заражения. Кроме того, возможен трансмиссивный путь заражения (через укусы клещей и насекомых). Возбудитель проникает в организм в основном через слизистые оболочки пищеварительной, дыхательной и мочеполовой систем при употреблении зараженных кормов и воды, поедании трупов больных животных, а также при купании животных в инфицированных водоемах, через поврежденную кожу, а также при спаривании (вязке) животных-лептоспироносителей.

           Инкубационный период при лептоспирозе колеблется от 2 до 12 дней.

Симптомы:

• у крупного рогатого скота при сверхостром течении — потеря аппетита, угнетение, анемия, учащенное мочеиспускание, повышение температуры, понос, клонические судороги; при остром течении — повышение температуры, угнетение, понос, слабость, атония преджелудков, желтуха, кровавая моча, конъюнктивит;
• у овец — гнойные истечения из носа, некроз слизистой оболочки рта, кожи. При хроническом течении — приступы лихорадки, гемогло-бинурия, желтуха, атония, запоры, снижение удоев, аборты, лейкоцитоз, истощение;
• у лисиц, песцов — отказ от корма, рвота, понос, хромота, желтуха слабо выражена, стоматит;
• у поросят рецидивирующая лихорадка, исхудание, анемия, понос, желтуха, некрозы кожи.

Классификация возбудителя.

 

 Царство: Bacteria

Отдел: Spirochaetae

Класс: Spirochaetes

Порядок: Spirochaetales

Семейство: Leptospiraceae

Род: Leptospira

Вид: Bijlexa (не патогенный), Interrogans

 

       Патогенный вид представлен 183 сероварами, которые по степени антигенного родства объединены в 25 серологических групп. Основными вобудителями лептоспироа у сельскохозяйственных животных считают лептоспиры серогрупп Canicola, Grippotyphosa, Hebdomadis, Pomona, Tarassowi, Icterohaemorrhagiae.

 

Эпизоотологические особенности.

     Лептоспироз относится к широко распространенным инфекционным болезням животных. Инфицированность в России среди обследованных животных в среднем составляет:

• у собак - 19,59%
• крупного рогатого скота - 16,55%,
• лошадей - 12,47%,
• свиней - 8,36%,
• овец - 2,2%.

     В 1997 г. инфицированность собак достигала 32,64%.

     Источником и резервуаром возбудителя инфекции являются больные и переболевшие животные, выделяющие лептоспиры из организма во внешнюю среду вместе с мочой, фекалиями, молоком, а также с выделениями из легких и половых органов. Срок лептоспироносительства у собак составляет от нескольких месяцев до 3-4 лет, у кошек - до 4 месяцев, у лисиц - до 17 месяцев. Грызуны являются пожизненными резервуарными носителями лептоспир

                 

     Заболеваемость носит профессиональный характер, чаще болеют рабочие пищевых предприятий, рабочие канализационной сети, углекопы в сырых шахтах.

      В формировании очагов лептоспирозов принимают участие полевки-экономки, водяные крысы, лесные мыши, рыжие полевки, домашние мыши. Они предпочтительно обитают у берегов водоемов, богатых болотной растительностью. Купание и водопой скота в таких водоемах приводит к инфицированию их лептоспирами. В то же время при наличии в водоемах соленой воды природные очаги лептоспироза в них не формируются. 
     Антисанитарные условия, незащищенность источников воды от грызунов приводят к распространению лептоспироза. Осушение болот, правильная эксплуатация прудов, водохранилищ способствуют ликвидации природных очагов. 
     Лептоспиры больных животных, выделяясь с мочой, попадают в воду, почву, пищу. Контакт с зараженной водой (питье, купанье), употребление в пищу инфицированных продуктов питания приводят к возникновению лептоспироза у людей. В тропиках и субтропиках заболеваемость лептоспирозами отмечается круглый год. Восприимчивость к лептоспирозам находится в определенной зависимости от пола и возраста, что обусловливается социально-бытовыми факторами, определяющими возможность заражения в очагах инфекции.. 
     Выделяют три типа очагов лептоспироза: природные, хозяйственные и смешанные. Основными источниками лептоспир в природе являются грызуны.

                    

Рис. Собака, пораженная лептоспирами

 

 

 

Отбор патологического материала.

•       Для прижизненной диагностики, для исследования берут кровь из вены (в первые 7 суток при повышении температуры тела больного животного, 5 мл для бактериологического и 5–10 мл для серологического исследований). Для серологической диагностики кровь отбирают не ранее 5–7 суток после начала заболевания. Обязательно нужно брать пробу крови от абортировшего животного. В крови можно обнаружить живые лептоспиры. Можно брать мочу, которую собирают в стерильные емкости во время естественного мочеиспускания утром (во время кормления). Абортированный плод посылают целиком или его желудок с содержимым (перевязывая его с двух сторон), паренхиматозные органы плода (отдельно от желудка).
•         Для посмертной диагностики – трупы мелких животных целиком, от крупных животных – сердце с перевязанными сосудами, кусочки органов, почку, селезенку, перевязанный мочевой пузырь, транссудаты из грудной и брюшной полостей. Материал должен быть исследован не позднее 6 часов летом, 10–12 часов – зимой, мочу – в течение 3 часов (то есть сроки выживания лептоспир в данных условиях).

 

 

 

Рис. Кровоизлияния в легких морских свинок вводили L. interrogans . А - Через 24 часа после инфицирования; B 48 часа после заражения; C через 72 часа после инфицирования; D через 96 часов после инфекции.

 

          Помимо материала от больных (павших) животных, в лабораторию могут быть направлены для исследования пробы воды (редко корм, навоз).

 

 

 

 

Факторы патогенности.

         Некоторые серовары характеризуются гемолитической и липазной активностью, продуцируют плазмокоагулазу, фибринолизин, цитотоксины.

 

 

 

Лабораторная диагностика

      Для постановки диагноза проводят ряд исследований (изучают свойства возбудителя) :

Тинкториальные свойства.

      Лептоспирозы- спиралевидные тонкие серебристые нити, концы которых – один или оба – загнуты в виде крючков.

• Факультативные анаэробы;
• Грамотрицательные бактерии;
• Спиралевидные тонкие нити, концы которых – один или оба – загнуты в виде крючков;

                       

 

• Подвижны, формы движения: вращательное, прямолинейное, поступательное с одновременным вращением вокруг собственной оси;

      Лептоспирозы плохо воспринимают окраску, их обычно исследуют в неокрашенном состоянии.

      Готовят препарат «раздавленная капля» и изучают методом темнопольной микроскопии при увеличении 40х7…10 или 20х1,5х10,а для более детального изучения- при увеличении 40х10…15 или 40х1,5х10. В каждой капле просматривают не менее 50 полей зрения. 

Рис. Световая микроскопия. Предметные стекла оценивали в различные моменты времени. А : 5 дней, В: 15 дней, С: 30 дней, а D: 40 дней биопленки. Увеличение: 1000X

 

 

 

Культуральные свойства.

      Для культивирования  лептоспир используют следующие питательные среды

•       Среда Ферворта-Вольфа ( в модификации С. И. Тарасова):

1. к 900 мл дистилированной воды добавляют 0,5г хлорида натрия, 1г пептона (Дифко),
2. 100мл маточного раствора фосфатного буфера рН 7,2…7,4.
3. автоклавируют в колбе при температуре 120˚С 30 мин.
4. На следующий день дважды фильтруют через бумажный фильтр,
5. разливают в пробирки по 0,5 мл кроличьей сыворотки
6. прогревают среду на водяной бане при 56…58˚С 30 мин.

 

•       Среда Любашенко:

1. нехлорированную водопроводную (или колодезную, речную) воду, профильтрованную через бумажный фильтр,
2. стерилизуют в автоклаве при 1 атм 30 мин, охлаждают,
3. рН 7,3…7,4,
4. добавляют 5 % кроличьей или бараньей сыворотки, прогретой при 56˚С в течение 1ч.
5. среду пропускают через фильтрующие пластины СФ в фильтре Зейтца и асептически разливают в пробирки.
6. Для контроля стерильности среды пробирки помещают в термостат при 37˚С на 48ч.

             Можно применять и другие питательные  среды. На плотных средах (Кокса, ВГНКИи др.) лептоспиры образуют мелкие колонии  в виде прозрачных дисков диаметром до 1…2 см с хорошо очерченными или размытыми краями или в виде матовых точек диаметром 1…2мм.  

 

                  

 

 

Биохимические свойства.

    В диагностике лептоспир роли не играют, при дифференциации не используются.

 

Серологические свойства.

Реакция микроагглютинация (РМА).

      В реакции микроагглютинации сыворотки крови исследуют в разведениях:

• 1 :50,
• 1 :250,
• 1 :1250.

 

Учет реакции:

каплю из каждой лунки исследуют методом темнопольной микроскопии при увеличении 20x10 или 20 х 7 х 1,5. Агглютинация проявляется в образовании «паучков», содержащих от 3...5 до нескольких десятков лептоспир.

              

Рис. 1 - отрицательная реакция; 
2-5 - положительная реакция: различная степень

 

       Специфические антитела в сыворотке крови животных в титре 1 :50, 1:100 и выше свидетельствуют об инфицированности данной особи лептоспирами и возможном лептоспироносительстве.

     По результатам серологических исследований диагноз на лептоспироз считают установленным, а хозяйство неблагополучным по лептоспирозу, если специфические антитела обнаружены в сыворотке крови при однократном исследовании в РМА в титре 1:100 и выше более чем у 25 % обследованных животных, а также при нарастании титра антител в 5 раз и более при повторном исследовании через 7... 10 дней сыворотки крови в РМА или при обнаружении антител у ранее нереагировавших животных.

        Сыворотки животных, дающие положительную реакцию микроагглютинации в равных титрах с лептоспирами нескольких серологических групп или дающие наиболее высокий титр с лептоспирами, ранее неизвестными в качестве возбудителя лепто-спироза сельскохозяйственных животных, исследуют в реакции иммуноадсорбции.   Для постановки реакции иммуноадсорбции все штаммы лептоспир, с которыми данная сыворотка дала положительную реакцию микроагглютинации, выращивают в 0,5~Л”-лйтровых флаконах в течение 5...7 сут. Затем культуры лептоспир осаждакрлцент-рифугированием при 10 000мин~г 30 мин. Надосадочную жидкость сливают~а осадок суспендируют в 0,9 мл питательной среды или физиологического раствора^ 0,1 мл исследуемой сыворотки смешивают с 0,9 мл концентрированного антигена и выдерживают в теченИ^-48 ч при 1...5°С. Отделяют сыворотку центрифугированием при 10 ООО мин-1 30 мин. Адсорбированную сыворотку проверяют в реакции микроагглютинации на наличие остаточных антител к штамму-адсорбенту, а затем исследуют с лептоспирами всех групп, с которыми сыворотка дала положительную реакцию до адсорбции. В результате адсорбции лептоспиры, являющиеся возбудителем, удаляют из сыворотки антитела к лептоспирам всех других серологических групп; гетерологич-ные типы лептоспир не адсорбируют антитела к штамму-возбудителю.

      Реакцию макроагглютинации ставят на стекле, на которое наносят каплю исследуемой сыворотки крови, разведенной в соотношении 1 : 100, и равное количество антигена, компоненты перемешивают, результат учитывают в проходящем свете. Положительным результатом считают агглютинацию интенсивностью на два креста и выше, сомнительным — на один крест.

      Антитела в крови можно обнаружить также методом иммуноферментного анализа.

 

Биопроба.

       Биопробу ставят на золотистых хомячках 20...30-дневного возраста, кроль-чатах-сосунках в возрасте 10...20 дней и 3...5-недельных морских свинках.

       Исследуемый материал (кровь, моча, суспензия из паренхиматозных органов или абортированного плода и др.) вводят подкожно или внутрибрюшинно хомякам от 0,3...0,5 до 1мл, крольчатам — 2...3 мл. На каждую пробу материала берут по 2 животных, одного из которых убивают на 4...5-й день в период-лодъема температуры, другого, если животное не погибает, — на 14...16-й день после заражения. Кровь последнего исследуют в 'реакций микроагглютинации (РМА), начиная с разведения 1 : 10, с лептоспирами 13 серологических групп.

        Высевы  из органов убитых и павших  животных (сердца, печени и почек) делают в 2...3 пробирки из каждого  органа. Транссудат из грудной  и брюшной полостей, перикардиальную  жидкость, содержимое мочевого пузыря  исследуют методом темнопольной микроскопии.

         Вирулентность выделенной культуры  определяют на золотистых хомячках  или крольчатах, которых заражают  внутрибрюшинно 5...7-дневной культурой, содержащей 70... 100 лептоспир в поле зрения микроскопа. Высоковирулентные культуры лептоспир вызывают гибель золотистых хомячков в дозе менее 0,1 мл, средней вирулентности — 0,2...0,4 мл, слабовирулентные — 0,5... 1 мл.

 

 

 

 

 

                    

 

 

 

 

Рис. Золотистый хомячок

 

 

 

 

 

 

 

Биопрепараты.

 

•        Профилактические. Депонированная поливалентная вакцина против лептоспироза животных ВГНКИ содержит шесть штаммов лептоспир с наиболее выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, относящихся к серогруппам Pomona, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae, Canikola, Grippotyphosa, Hebdomadis. Выращенные культуры лептоспир сливают в общую емкость, инактивируют, концентрируют, добавляю адъювант. Вакцину проверяют на стерильность, безвредность и активность (на кроликах).

       Поливалентную вакцину против лептоспироз сельскохозяйственных и промысловых животных готовят из 7... 10-дневной культуры лептоспир, консервированных 5%-м раствором карболовой кислоты до конечного содержания фенола в вакцине 0,5 %. Вакцину контролируют на стерильность, безвредность и активность (на кроликах).

•      Лечебные. Поливалентную сыворотку против лептоспироза сельскохозяйственных и промысловых животных получают методом гипериммунизации волов-продуцентов. Антигены для гипериммунизации готовят из производственных штаммов шести серо-групп. Сыворотку консервируют 5%-м раствором фенола, проверяют на стерильность, безвредность (на белых мышах и морских свинках) и активность (в реакции микроагглютинации в разведениях от 1 : 1000 до 1 : 100 ООО).
•       Диагностические. Антигены для диагностики лептоспироза реакцией макроагглютинации готовят из эталонных штаммов лептоспир. Выращенные культуры инактивируют формалином, концентрируют, расфасовывают по ампулам и подвергают сублимационному высушиванию. Антигены контролируют на растворимость в физиологическом растворе, на концентрацию. Активность антигена проверяют в РА на стекле с гомологичной лептоспирозной агглютинирующей сывороткой.

       Групповые агглютинирующие лептоспирозные сыворотки предназначены для определения серогрупповой принадлежности лептоспир, выделенных из патологического материала, а также лептоспир, используемых в качестве антигенов в реакции микроагглютинации при серологической диагностике лептоспироза.

                                

Рис. Сыворотка против лептоспироза

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы.

• Ветеринарная микробиология и иммунология: Учебник /Под ред.Н. – М.Колычев.: 2003г, КолосС
• Ветеринарная микробиология Автор: Емельяненко П.А., Дунаев Г.В., Кудлай Д.Г. и др. Издательство: Колос Год: 1982
• Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. Микробиология. Дрофа, 2005.
• Т. С. Костенко, В. Б. Родионова, Д. И. Скородумов,Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии, Колос, 2001
• Воробьев А.А., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология. Медицина, 2003.