Біотехнологія ферментів

     ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД

     “ЗАПОРІЗЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ”

     МІНІСТЕРСТВО  ОСВІТИ І НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ

     КАФЕДРА ЗАГАЛЬНОЇ ТА ПРИКЛАДНОЇ ЕКОЛОГІЇ І  ЗООЛОГІЇ 
 
 
 
 

ІНДИВІДУАЛЬНЕ ЗАВДАННЯ

з курсу  “Промислова мікробіологія” 

Біотехнологія ферментів 
 

Виконав: студентка  

       групи 4118-1б

      Єгорова Ю.В.

       Перевірив:       
 
 
 
 

Запоріжжя

2011 
ЗМІСТ

ВСТУП……………………………………………………………………………….3

1. Використання ферментів у промисловості……………………………………4

2. Класифікація ферментів………………………………………………………….5

3. Глибинний метод виробництва ферментів…………………………………….11

4. Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів……12

5. Загальна характеристика іммобілізованих ферментів……………………….15

6. Методи іммобілізації ферментів………………………………………...…….17

ВИСНОВКИ………………………………………………………………………23

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ.……………………………………24 
 
 

     ВСТУП 
 

     Ферменти — це біологічні каталізатори, які дозволяють скоординувати хімічну активність в клітинах. Не дивлячись на те, що ферменти використовуються людиною все тисячі років, лише в кінці XIX ст. ми почали розуміти, як вони працюють. Зараз ми знаємо, що ферменти — це складні білкові молекули зі специфічною тривимірною конфігурацією, і що їх структура закодована в ДНК. Число можливих конфігурацій може бути безкінечно великим.

     У майбутньому відкриваються широкі можливості для конструювання нових ферментів. Одна з них - спрямована зміна окремих амінокислот шляхом зміни генів, які кодують ферменти. Ми все глибше пізнаємо закони, за якими білки беруть специфічну тривимірну конфігурацію, тому не виключена поява в найближчому майбутньому абсолютно нових сконструйованих ферментів. Цей напрямок називається білковою інженерією. Крім того, чим більше ми дізнаємося про те, як працюють ферменти, тим більш імовірно, що ми зможемо сконструювати небілкові або частково небілкові каталізатори, які набагато стабільніша, ніж звичайні ферменти. Можливо, саме цей напрям буде найпривабливішим для підприємців. Серед напрямків, які окупляться негайно, - пошук природних ферментів, що є більш досконалою альтернативою використовуваним в даний час. Все це вимагає величезних інвестицій у дослідження та розробки. 
 
 
 
 

     1. Використання ферментів у промисловості 
 

     Для промисловості ферменти цікаві з  двох основних причин. По-перше, завдяки  своїй різноманітності ферменти потенційно здатні каталізувати безліч промислово важливих хімічних реакцій. По-друге, вони набагато ефективніші і специфічніші, ніж неорганічні каталізатори, які зазвичай використовуються. При нормальних температурах і тиску в їх присутності здійснюються реакції, які зазвичай вимагають дуже високих температур і тиску. Наприклад, в одному з найбільших у світі промислових виробництв, заснованому на методі Хабера, аміак отримують із газоподібних азоту і водню при температурі 500 ° С і високому тиску. Азотфіксуючі бактерії здатні синтезувати аміак з атмосферного азоту і водню при кімнатній температурі і нормальному атмосферному тиску за допомогою ферментів та використовуючи АТФ як джерело енергії. Якби вдалося розробити технологію отримання амонію за допомогою ферментів, можна було б зберегти дуже багато енергії. Ще однією перевагою ферментів є їх специфічність, яка дозволяє отримувати дуже чисті продукти, що особливо важливо для фармакологічної, харчової та сільськогосподарської промисловості.

     Використання  ферментів має і ряд недоліків, пов'язаних головним чином з нестабільністю білків, виділених з клітин. Такі білки легко денатурують при зміні температури і рН, і при дії органічних розчинників, які використовуються у виробничих процесах. Вони також можуть бути інгібованими продуктами реакції. Недоліком є ​​також висока вартість процесів виділення самих ферментів і необхідність використання для цього «безпечних» (наприклад, непатогенних) організмів, особливо, якщо ферменти призначені для одержання продуктів, які споживаються тваринами і людиною. В даний час використовується менше 200 ферментів з 2500 виділених та описаних (які в свою чергу складають лише 10% загального числа виявлених в природі). Більшість ферментів виділено всього лише з одинадцяти видів грибів, чотирьох видів дріжджів і восьми видів бактерій. 

                                                Рис. 1.1 Просторова структура

     молекули глюкоамілази із

     Aspergillus awamori 
 
 
 
 
 

     Зараз ферменти у виробничому процесі  використовують багато фармацевтичних компаній, виробники сиру, пива і  вина, виробники детергентів, текстилю, фруктових соків і т. п. Рівень світового продажу ферментів  в даний час перевищує 1 млрд. доларів  на рік.  
 

     2. Класифікація ферментів 
 

     Класифікація ферментів заснована на механізмі їх дії і включає 6 класів:

     1) Оксиредуктази – каталізують окисно-відновні реакції:

     а) дегідрогенази – ферменти, які переносять водень із одного субстрату на інший;

     б) оксидази – ферменти, які переносять водень із субстрату, який окислився  на інший.

     2) Трансферази – ферменти, які прискорюють перенос атомів або груп атомів, радикалів з одного субстрату на інший:

     а) метилтрансферази – ферменти, які переносять метильну групу з одного субстрату на інший;

     б) ацетилтрансферази – ферменти, які переносять кислотні залишки з одного субстрату на інший;

     в) амінотрансферази – ферменти, які  переносять аміногрупи з одного субстрату  на інший;

     г)фосфотрансферази – ферменти, які переносять залишки фосфорної кислоти з одного субстрату на інший;

     д) сульфідтрансферази – ферменти, які переносять залишки сульфогрупи з одного субстрату на інший;

     е) амідинтрансферази – ферменти, які переносять залишки аміди нової групи з одного субстрату на інший.

     3) Гідролази – ферменти, які каталізують за участі води; розщеплюють складні органічні сполуки по ефірному або пептидному зв’язку:

     а) естерази – ферменти, які каталізують  гідроліз складних ефірів;

     б) гідролази фосфомоно- та диефірів – ферменти, які каталізують відщеплення фосфорної кислоти від різних сполук;

     в) глюкозидази – ферменти, які приймають участь в гідролізі глюкозидів;

     г) пептидази – ферменти, які каталізують розщеплення білків, дипептидів, що містять подвійний зв'язок;

     д) амідази – ферменти, які каталізують  відщеплення аміногрупи за допомогою  води у амідів, нуклеотидів та інших сполук;

     е) поліфосфатази – ферменти, які гідролізують фосфоангідридні зв’язки.

     4) Ліази – ферменти, які не гідролітичним шляхом відщеплюють ту чи іншу групу або розривають С-С зв'язок.

     5) Ізомерази – ферменти, які каталізують реакції внутрішньо молекулярного переміщення різних груп.

     6) Лігази (синтетази) – ферменти, які каталізують реакції біосинтезу за рахунок енергії АТФ або інших нуклеозидтрифосфатів.

     Ферменти  як біокаталізатори мають ряд  унікальних властивостей, наприклад, таких  як висока каталітична активність і  вибірковість дії. У ряді випадків ферменти мають абсолютну специфічність, каталізує перетворення тільки однієї речовини. Для кожного ферменту існує свій оптимум рН, при якому його каталітична дія максимальна. При різкій зміні рН ферменти інактивуються через незворотну денатурацію. Прискорення реакції при підвищенні температури також лімітоване певними межами, оскільки вже при температурі 40-50^оС багато ферментів денатурують. Ці властивості ферментів доводиться враховувати при розробці технології нового препарату.

     Оскільки  ферменти – речовини білкової природи, в суміші з іншими білками їх кількість  визначити практично неможливо. Наявність ферменту в препараті  може бути встановлено лише за протіканням  тієї реакції, яку каталізує фермент. При цьому кількісну оцінку вмісту ферменту можна дати, визначивши або кількість утворених продуктів реакції, або кількість витраченого субстрату. За одиницю активності ферменту приймають ту його кількість, яка каталізує перетворення одного мікромоля субстрату в 1 хвилину при заданих стандартних умовах – стандартна одиниця активності.

     За  рішенням Міжнародного біохімічного союзу активність вирішено визначати при t = 30^оС за початкової швидкості реакції, коли концентрація насичення ферменту і тимчасова залежність близька до кінетики реакції нульового порядку. Інші параметри реакції індивідуальні для кожного ферменту. Активність ферментного препарату виражається в мікромолях субстрату, прореагувавшого під дією 1 мл ферментного розчину або 1 грама препарату в оптимальних умовах за 1 хвилину. Якщо ферментний препарат не містить баласту, то його активність виражається в тих же стандартних одиницях на 1 мг ферменту. Якщо ж є баласт, то активність вважається на 1 мг білка в ферментному препараті. Активність випускаємого препарату – найважливіший нормований показник якості.

     Основну частину ферментів, одержуваних  промисловим способом, складають  гідролази. До них відносяться, в першу чергу амилолітичні ферменти: α-амілаза, β-амілаза, глюкоамілаза. Їх основна функція - гідроліз крохмалю і глікогену. Крохмаль при гідролізі розщеплюється на декстрини, а потім до глюкози. Ці ферменти застосовуються у спиртовій промисловості, хлібопеченні.

     Протеолітичні ферменти утворюють клас пептидгідролаз. Їхня дія полягає у прискоренні гідролізу пептидних зв'язків у білках і пептидах. Важлива їхня особливість - селективний характер дії на пептидні зв'язки в білковій молекулі. Наприклад, пепсин діє тільки на зв'язок з ароматичними амінокислотами, трипсин – на зв'язок між аргініном і лізином. У промисловості протеолітичні ферменти класифікують за здатністю проявляти активність у певній галузі рН:

• рН 1.5 - 3.7 - кислі протеази;
• рН 6.5 - 7.5 - протеази;
• pH > 8.0 - лужні протеази.

     Протеази находять широке застосування в різних галузях промисловості:

• м’ясна – для пом’якшення м’яса;
• шкіряна – пом'якшення шкір;
• кіновиробництво – розчинення желатинового шару при регенерації плівок;
• парфумерна – добавки в зубну пасту, креми, лосьйони;
• виробництво миючих засобів – добавки для видалення забруднень білкової природи;
• медицина – при лікуванні запалювальних процесів, тромбозов;

     Пектолітичні ферменти зменшують молекулярну масу і знижують в'язкість пектинових речовин. Пектинази діляться на дві групи - гідролази і транселімінази. Гідролази відщеплюють метильні залишки або розривають глікозидні зв'язки. Транселімінази прискорюють негідролітичні розщеплення пектинових речовин з утворенням подвійних зв'язків. Застосовуються в текстильній промисловості (вимочування льону перед переробкою), у виноробстві – освітлення вин, а також при консервуванні фруктових соків.

     Целюлолітичні ферменти дуже специфічні, їх дія виявляється в деполімеризації молекул целюлози. Зазвичай використовуються у вигляді комплексу, який доводить гідроліз целюлози до глюкози (у гідролізній промисловості). У медичній промисловості їх використовують для виділення стероїдів з рослин, у харчовій – для поліпшення якості рослинних олій, у сільському господарстві – як добавки до комбікормів для жуйних тварин.

     Існує ряд факторів, що впливають на біосинтез ферментів. У першу чергу, до них відноситься генетичний. Склад і кількість синтезованих ферментів спадково детерміновані. Застосовуючи мутагени можна змінити генетичні властивості мікроорганізмів і отримати штами з цінними для промисловості властивостями. До мутагенних факторів належать іонізуючі та неіонізуючі випромінювання, ізотопи, антибіотики, інші хімічні сполуки, що перетворюють спадкові елементи клітини. Незважаючи на визначальну роль генетичного фактора у біосинтезі ферментів, продуктивність біотехнологічних процесів залежить і від складу живильного середовища. При цьому важливо не тільки наявність джерел основних поживних речовин, але і речовин, що грають роль індукторів або репресорів біосинтезу даного конкретного ферменту або їх груп. Механізм цього явища ще не цілком вивчений, але сам факт має враховуватися при виборі технології.

     Розглянемо кілька прикладів. Фермент ліпаза майже не синтезується грибом Aspergillus awamori на середовищі без індуктора, додавання жиру кашалота підсилює біосинтез ферменту в сотні разів. При додаванні ж у середу крохмалю і при повному виключенні мінерального фосфору інтенсивно синтезується фосфатаза. Не тільки наявність індуктора здатне збільшувати вихід ферменту. Важливу роль відіграє склад живильного середовища та умови культивування. При розробці процесу біосинтезу α-амілази культурою Aspergillus oryzae заміна сахарози (як джерело вуглецю) на крохмаль збільшила активність ферменту в 3 рази, додавання солодового екстракту (з пророслого насіння злакових) ще в 10 раз, а підвищення концентрації основних елементів живильного середовища на 50% - ще в 2 рази.

     Для інтенсифікації процесу росту і  синтезу ферментів додають різні  чинники зростання, наприклад, амінокислоти, пуринові основи та їх похідні, РНК  та продукти її гідролізу. Як джерело  вуглецю використовують крохмаль, кукурудзяний екстракт, соєве борошно, гідролізати  біомаси дріжджів. Мікроорганізми можуть утилізувати і мінеральні джерела  азоту. До складу поживних середовищ  входять і іони Mg, Mn, Zn, Fe, Cu та ін металів. Механізм дії більшості з них невідомий. Деякі входять до складу ферменту. Іони Ca підвищують стійкість α-амілази, іони Fe і Mg активізують і стабілізують протеолітичні ферменти.

     Оптимальний склад живильного середовища для кожного продуцента може бути визначений двома способами: емпіричний і побудова математичної моделі з використанням комп'ютера. Останній, звичайно, краще. За характером культивування всі технологічні процеси виробництва ферментних препаратів діляться на дві великі групи: глибинний і поверхневий методи.

     3. Глибинний метод виробництва ферментів

     У цьому випадку мікроорганізми вирощуються у рідкому поживному середовищі. Технічно більш досконалий, ніж поверхневий, так як легко піддається автоматизації та механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні звичайно значно нижча, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.

     При глибинному культивуванні продуцентів ферментів виділяють, як і в будь-якому біотехнологічному процесі, 5 етапів.

     1. Приготування поживних середовищ залежить від складу компонентів. Деякі попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для приготування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня обнасінення об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації та апарати. Повітря очищається до і після аерації. До – тому, що містить частинки пилу органічної та неорганічної природи, після – тому, що несе клітини продуцента.

     2. Отримання посівного матеріалу. Для посіву живильного середовища матеріал готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів – це міцеліальна вегетативна маса, для бактерій – молода зростаюча культура на початковій стадії спороутворення. Отримання посівного матеріалу полягає у збільшенні маси продуцента в 3-4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується тільки вегетативно, він різко зростає (до 5-20%). Якщо ж відбувається рясне спороношення - скорочується до 1%.

     3. Виробниче культивування. Біосинтез ферментів у глибинній культурі протікає протягом 2-4 діб при безперервній подачі повітря і перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах може гальмувати зростання біомаси продуцента, тому часто свіже середовище або деякі його компоненти вводяться у ферментер на стадії активного зростання. Температурний оптимум знаходиться в інтервалі 22-32^оС. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості утворених метаболітів і концентрації клітин. Дані надходять у комп'ютер, який визначає стратегію корекції процесу і автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкраща якість продуктів.

     4. Виділення. У міцелії тридобової культури зазвичай залишається не більше 15% ферментів. Решта виділяються в оточуюче клітини рідке середовище. У цьому випадку препарати ферментів виділяють з фільтратів після відділення біомаси.

     5. Отримання товарної  форми.  
 

     4. Виробництво ферментів при поверхневому культивуванні продуцентів 
 

     При поверхневому методі культура росте  на поверхні твердого зволоженого живильного середовища. Міцелій повністю обволікає  і досить міцно скріплює тверді частинки субстрату, з якого отримують  поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середовище повинно бути пухким, а шар культури-продуцента невеликим.

     Вирощування виробничої культури відбувається зазвичай в асептичних умовах, але середовище та кювети необхідно простерилізувати. Перед кожним новим завантаженням  також необхідна стерилізація устаткування.

     Переваги  поверхневої культури: значно більш  висока кінцева концентрація ферменту на одиницю маси середовища (при  цукруванні крохмалю 5 кг поверхневої  культури замінюють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.

     Посівний матеріал може бути трьох видів:

     - культура, що виросла на твердому живильному середовищі;

     - споровий матеріал;

     - міцеліальна культура, вирощена глибинним способом.

     У три етапи отримують і посівну культуру. Спочатку музейну культуру продуцента пересівають на 1 – 1,5 г зволожених стерильних пшеничних висівок в пробірку і вирощують в термостаті до рясного спороутворення. Другий етап - аналогічний, але в колбах, третій - у посудинах з 500 г середовища.

     Основу живильного середовища становлять пшеничні висівки, як джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до висівок можна додавати буряковий жом, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середовище гострим паром при помішуванні (температура – 105-140⁰ С, час 60-90 хвилин). Після цього середовище засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають в розтільні камери. Культивують протягом 36-48 годин.

     Зростання ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набухання конідій і їх проростання (температура не нижче 28^оС), потім ріст міцелію у вигляді гармата сірувато-білого кольору (необхідно виводити тепло, що виділяється) і утворення конідій. Для створення сприятливих умов росту і розвитку продуцента необхідна аерація і підтримання оптимальної вологості (55-70%).

     Вирощена в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні культура представляє корж з набряклих часток середовища, щільно зв'язаних зрощеним міцелієм. Масу подрібнюють до гранул 5,5 мм. Культуру висушують до 10-12% вологості при температурі не вище 40^оС, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - в шкіряній та спиртовій промисловості. У харчовій і особливо медичній промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.

     Схема очищення зводиться до наступного:

     - звільнення від нерозчинних речовин;

     - звільнення від супутніх розчинних речовин;

     - фракціонування (як правило, хроматографічними методами).

     Для виділення ферменту з поверхневої культури необхідна екстракція. Як правило, екстраген – вода. При цьому в розчин переходять цукри, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення і очищення завершує сушка. Після сушіння препарат повинен містити не більше 6-8% вологи, тоді він може в герметичній упаковці зберігатися до одного року без втрати активності.

     Стандартизація ферментного препарату - доведення активності ферменту до стандартної, що відповідає вимогам ГОСТ. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі - крохмаль, лактоза та ін.

     Враховуючи величезні перспективи застосування ферментних препаратів в різних галузях промисловості і сільського господарства, медицини, можна зробити висновок про необхідність розширення досліджень у цій області для оптимізації технології та гарантійного отримання високоактивних і стабільних препаратів мікробних ферментів. 

     5. Загальна характеристика іммобілізованих ферментів

     Іммобілізовані ферменти (від лат. Immobilis - нерухомий) - це препарати ферментів, молекули яких пов'язані з матрицею, або носієм (як правило, полімером), зберігаючи при цьому повністю або частково свої каталітичні властивості. Іммобілізовані ферменти зазвичай не розчиняються у воді; між двома фазами можливий обмін молекулами субстрату, продуктів каталітичної реакції, інгібіторів і активаторів.

     У сучасній біотехнології одне з важливих місць належить ферментам. Ферменти та ферментні системи широко використовуються в різних галузях промисловості, медицині, сільському господарстві, хімічний аналіз та т.д.

     Ферменти – речовини білкової природи і тому нестійкі при зберіганні, а також чутливі до теплових впливів. Крім того, ферменти не можуть бути використані багаторазово через труднощі у відділенні їх від реагентів та продуктів реакції. Вирішити ці проблеми допомагає створення іммобілізованих ферментів. Початок цьому методу було покладено в 1916 році, коли Дж.Нельсон і Е.Гріффін адсорбували на вугіллі інвертазу і показали, що вона зберігає в такому вигляді каталітичну активність. Сам термін “іммобілізовані ферменти” узаконений в 1971 році, і означає будь-яке обмеження свободи пересування білкових молекул в просторі.

     Сутність іммобілізації ферментів – прикріплення їх у активній формі до нерозчинної основи або проникнення в напівпроникну мембранну систему. Прикріплення ферменту до носія здійснюється адсорбційно, хімічним зв'язком або шляхом механічного включення ферменту в органічний або неорганічний гель (в капсулу і т. п.). При цьому допускається прикріплення ферменту тільки за рахунок функціональних груп, що не входять в активний центр ферменту і не беруть участь в утворенні фермент-субстратного комплексу. Носій ферменту або матриця може мати вигляд зернистого матеріалу, волокнистої структури, пластинчастої поверхні, плівок або тканин, порожніх волокон, трубочок, капсул і т. д. Має значення розмір частинок носія. Важливо мати велику поверхню, тому рекомендуються невеликі частинки діаметром 0,1-0,2 мм. Носій ферменту може бути як природна речовина, так і синтетичний полімер.

     Переваги іммобілізованих ферментів перед нативними попередниками:

     1. Гетерогенний каталізатор легко відділяється від реакційного середовища, що дає можливість зупинити реакцію в будь-який момент, використовувати фермент повторно, а також одержувати чистий від ферменту продукт.

     2. Ферментативний процес з використанням іммобілізованих ферментів можна проводити безперервно, регулюючи швидкість каталізуємої реакції і вихід продукту.

     3. Модифікація ферменту цілеспрямовано змінює його властивості, такі як специфічність (особливо щодо макромолекулярного субстрату), залежність каталітичної активності від рН, іонного складу та інших параметрів середовища, стабільність до денатуруючих впливів.

     4. Можна регулювати каталітичну активність іммобілізованих ферментів шляхом зміни властивостей носія дією фізичних факторів, таких як світло і звук. Іммобілізувати ферменти можна як шляхом скріплення на нерозчинних носіях, так і шляхом внутрішньомолекулярного або міжмолекулярного зшивання білкових молекул низькомолекулярними біфункціональними сполуками, а також шляхом приєднання до розчинного полімеру.

     6. Методи іммобілізації ферментів

     Існує два основні методи іммобілізації ферментів: фізичний та хімічний.

     Фізична іммобілізація ферментів являє собою включення ферменту в таке середовище, в якому для нього доступним є лише обмежена частина загального обсягу. При фізичній іммобілізації фермент не пов'язаний з носієм ковалентними зв'язками. Існує чотири типи зв'язування ферментів:

     - адсорбція на нерозчинних носіях;

     - включення у пори гелю;

     - просторове відділення ферменту від решти об’єма реакційної системи за допомогою напівпроникної перегородки (мембрани);

     - включення в двофазне середовище, де фермент розчинний і може знаходитися тільки в одній з фаз.

     Перераховані підходи проілюстровані рис. 2.

     Рис. 6.1 Способи іммобілізації ферментів: а - адсорбція на нерозчинних носіях; б – включення у пори гелю; в – відділення ферменту за допомогою напівпроникної мембрани; г – використання двохфазного реакційного середовища.