Лабораторная диагностика инфекционных болезней

ПЛАН

1. Основні принципи культивування патогенних мікроорганізмів….2

1.1. Особливості технології промислового культивування мікроорганізмів….2

1.2. Відбір штамів мікроорганізмів і робота з ними….3

1.3. Готування посівної мікробної культури….4

1.4. Готування й стерилізація живильних сред….4

1.5. Підготовка біореакторів до посіву й вирощування мікроорганізмів….6

1.6. Технологія культивування мікроорганізмів у спочиваючому стані без аерації….9

1.7. Технологія промислового культивування анаеробних мікроорганізмів….9

1.8. Періодичні й хемостатні системи культивування мікроорганізмів….9

1.8.1. Періодичне культивування мікроорганізмів....10

1.8.2. Хемостатна культура, або метод безперервного культивування мікроорганізмів....12

2. Принципи лабораторної діагностики інфекційних захворювань….14

2.1 Мікробіологічний метод….14

2.2 Бактеріологічний метод….17

2.3 Вірусологічний метод….20

2.4 Біологічний метод….21

2.5 Імунологічний метод….21

2.6 Серологічні реакції….22

2.7 Імунологічні методи із застосуванням хімічних міток….24

2.8 Імуноферментний аналіз (ІФА)….25

2.9 Імунний блоттінг….26

2.10 Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)….26

2.11 Гібридизація нуклеїнових кислот….27

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. ОСНОВНІ ПРИНЦИПИ КУЛЬТИВУВАННЯ ПАТОГЕННИХ МІКРООРГАНІЗМІВ.

Клітинна інженерія - один з найбільш важливих направлень у біотехнології, об'єктами якої є мікроби (бактерії, віруси, протозойні організми), а також клітини (тканини) рослин, тварин і людини.

Відтворення мікроорганізмів при використанні різних по складу й властивостям живильних ( середовищ in vitro) або в умовах перебування сприйнятливого організму називається культивуванням.

Культивування мікроорганізмів в умовах in vitro отримало назву промислового культивування, а культивування клітин і тканин рослин і тварин - культивуванням ізольованих клітин і тканин.

При промисловому культивуванні процес мікробного синтезу, як правило, є частиною многостадійного виробництва, у результаті якого одержують як цільовий товарний продукт біосинтезу (дріжджі, кормовий білок, незамінні амінокислоти й ін.), так й «сирий» продукт, що підлягає подальшій переробці (згусток казеїну й ін.).

Метод культивування ізольованих еукаріотичних клітин і тканин в умовах in vitro використають у біотехнології для збереження й розмноження коштовних генотипів, ембріогенезі, оздоровленню посадкового матеріалу, а також для одержання продуктів вторинного синтезу (алколоїди, стероїди, глікозиди, гормони, ефірні масла й ін.).

Таким чином, клітинна біотехнологія базується на здатності клітин до існування й розмноження in vitro, їх тотипотентності й регенерації. Застосування цих особливостей розкрило більші можливості в вирішенні глобальних теоретичних і практичних завдань. В області фундаментальних наук стало здійсненним дослідження таких складних проблем, як взаємодія клітин у тканинах, клітинна диференційовка, морфогенез, реалізація тотипотентності клітин, механізми появи ракових клітин й ін.

1.1. Особливості технології промислового культивування мікроорганізмів

Для здійснення будь-якого біотехнологічного процесу необхідні:

-    культура мікроорганізмів;

-    живильне ; середовище

-    апаратури для вирощування й проведення допоміжних операцій;

-    засоби контролю й керування процесом.

Культивування є основною стадією технологічного процесу й багато в чому визначає кількісні і якісні характеристики виробництва препаратів. На стадії культивування здійснюється нагромадження як самої біомаси, так і продуктів метаболізму (життєдіяльності) мікроорганізмів. Так, при виробництві бактеріальних препаратів цільовим продуктом є сама біомаса, в інших випадках продукти, синтезовані клітиною, - антибіотики, ферменти, амінокислоти й ін. При цьому синтезований продукт може накопичуватися як усередині клітин, так і виділятися в культуральну суміш.

У тому випадку, коли культура росте на поверхні рідкого або щільного живильного , середовища споживаючи субстрати, що втримуються в ній, і виділяючи в це середовище продукти метаболізму, спосіб культивування називають поверхневим.

Коли ж мікроорганізми розподіляються по всьому об'єму рідкого живильного  середовища, культивування називають глибинним (рідкофазним). У такому випадку кисень надходить до клітин у результаті інтенсивної операції перемішування.

Останній спосіб найбільше широко застосовується в цей час у виробництві більшості препаратів по наступних причинах:

1. Дозволяє одержати велику кількість бактеріальної маси за короткий час. Так, при культивуванні мікроорганізмів групи кишкової палички в умовах стану спокою кількість мікробів не перевищує 1-2 млрд/см3, а при застосуванні примусової аерації врожайність досягає 50-60 млрд/см3.

2.  Процес легко керуємий. З метою тривалої підтримки росту й розмноження мікроорганізмів у процесі їхнього
культивування додатково вводять вуглецеві й азотисті
з'єднання, а при необхідності й інші стимулятори росту.
Даний спосіб також дозволяє легко коректувати рН середовища в процесі культивування.

3.  Процес максимально технологічний.

Технологічний процес глибинного вирощування мікроорганізмів у реакторах (ферментерах) складається з наступних етапів:

-    відбір штамів мікроорганізмів і робота з ними;

-    готування посівної мікробної культури;

-    готування й стерилізація живильних ; середовищ

-    підготовка біореактора до посіву;

-    вирощування мікроорганізмів у реакторі й контроль над
процесом культивування.

Крім того, він включає ряд допоміжних операцій:

-    стерилізацію обладнання й комунікацій;

-    готування й стерилізацію піногасників, розчинів й ін.

Зупинимося на кожному з етапів культивування.

1.2. Відбір штамів мікроорганізмів і робота з ними

Еталонні штами мікроорганізмів зберігаються й підтримуються на заданому рівні у ВДНІКІ (Всесоюзний державний науково-дослідний інститут клітинної інженерії) ветеринарних препаратів. Ці штами, у свою чергу, є виробничими, оскільки на їхній основі готуються вакцини.

Поряд з виробничими й еталонними штамами у ВДНІКІ зберігаються контрольні штами, які використовують для оцінки якості вакцинних препаратів. Ці штами повинні бути генетично однорідними популяціями мікроорганізмів зі стабільними морфологічними, специфічними й біологічними властивостями. Основними вимогами до цих штамів є їх високі антигенні й імуногенні властивості.

Виробничі, еталонні штами повинні зберігати генетичну стабільність антигенних, імуногенних й інших властивих їм біологічних властивостей протягом 10-20 послідовних пересівань як in vivo, так й in vitro.

1.3. Готування посівної мікробної культури

Звичайно виробниче культивування мікроорганізмів здійснюється в більших обсягах. Тому спочатку з наявного еталонного штаму мікроорганізму, що перебуває, як правило, у ліофільно висушеному стані в ампулі, роблять посіви в невеликі ємності, наприклад, у флаконі місткістю 100-200см3, заповнені по 50-150 мл виробничим середовищем. Потім із флаконів роблять висіви в більші ємності (сулії обсягом 18-20 л).

При гарному нагромадженні мікроорганізмів таку культуру вносять у реактор і називають посівною (матковою) культурою. При цьому потрібно попередньо розрахувати необхідну кількість посівної культури для виробничого культивування мікроорганізмів виходячи з посівної дози, що звичайно становить від 1 до 10% по обсягу. Посівні мікробні культури також контролюються на збереження ними типових морфологічних, культурально-біохімічних, антигенних й імуногенних властивостей, а також на відсутність у них сторонньої мікрофлори (ПМФ).

1.4. Готування й стерилізація живильних сред

Основним принципом конструювання живильних середовищ середовищ являється їхня повноцінність, оскільки в процесі росту мікроорганізми споживають із навколишнього живильного цілого середовища ряд різноманітних хімічних речовин, що становлять основу енергетичного й конструктивного обміну в клітинах.

До основних компонентів, що формують клітинну речовину, ставляться: вуглець, азот, кисень і водень. Вміст цих елементів у різних мікроорганізмах практично постійно.

У результаті розмаїтості мікроорганізмів, що по-різному використовують вуглець й азот, однаково придатних (універсальних) живильних для середовищ росту всіх без винятку мікроорганізмів і клітин не існує. Їхня специфічність залежить від змісту в них вуглецю й азоту.

Залежно від типів використовуваних азотистих з'єднань мікроорганізми розділяються на дві групи:

1. Протеолітичні, тобто розщеплюючі високомолекулярні білкові речовини і пептиди.

2. Дезаминирующие, що вимагають присутності в середовищі готових амінокислот, розщеплення яких супроводжується виділенням аміаку.

Вважається, що живильні середовища повинні бути збалансовані по вмісту таких органічних речовин, як амінокислоти, вітаміни, жирні кислоти, пуринові й піримідинові основи, гормони й ін., додавання яких у дуже незначних кількостях стимулює ріст і розмноження мікроорганізмів.

Дуже часто мікроорганізми й клітини мають потребу в багатьох природних амінокислотах, які є універсальними компонентами харчування. Вони цілком включаються в структуру клітини. Із всіх незамінних амінокислот ключова роль належить глутаміну й аргініну, які мають принципове значення для знешкодження токсичних метаболітів незамінних амінокислот й аміаку.

Також необхідним компонентом живильних середовищ являється неорганічні солі, які обумовлюють необхідний осмотичний тиск середовища, величину рН і буферну ємність.

Другим найбільш важливим принципом конструювання живильних середовищ являється вибір сировинних джерел. Визначальну роль у даному питанні грають, насамперед, біохімічні показники складу сировини, від якого залежить вибір способу й режимів його переробки з метою найбільш повного й ефективного використання живильних речовин, що втримуються в ньому.

Для одержання живильних середовищ із особливо коштовними властивостями застосовують насамперед традиційні джерела білка тваринного походження: м'ясо великої рогатої худоби, казеїн, рибу й продукти її переробки. Їхня питома вага становить до 80%.

Найбільш широко застосовуються живильні середовища на основі м'яса великої рогатої худоби. Також широке поширення одержало рибне кісткове борошно (РКБ), що задовольняє вимогам біологічної цінності, доступності й відносній стандартності.

Живильні на середовища основі казеїну містять всі компоненти, наявні в молоці: жир, лактозу, вітаміни, ферменти й солі. Однак у результаті подорожчання продуктів переробки молока застосування таких середовищ носить обмежений характер.

З нехарчових джерел білка тваринного походження як сировина використовуються кров забійних тварин, селезінка, плацента, ембріони свійських тварин, сирна сироватка, м'які тканини молюсків і ластоногих й ін. Питома вага нехарчової сировини в технології конструювання живильних середовищ складає всього 15%.

У цілому живильні середовища приготовлені із сировини тварини походження, мають високий зміст основних живильних компонентів, є повноцінними й збалансованими по амінокислотному складу й досить добре вивчені.

Варто враховувати, що рибне й кісткове борошно, а також відходи тваринного походження, в усі більшому обсязі направляються на одержання харчових білків, тому потрібні повноцінні їхні замінники, здатні збалансувати нестачу білків і незамінних амінокислот.

У результаті вивчення різних мікроорганізмів було виявлено, що високою інтенсивністю синтезу білків відрізняються мікробні клітини, такі як дріжджі, бактерії й ін. Амінокислотний склад мікроорганізмів, слугуючих субстратом для готування живильних середовищ добре вивчений, а біомаса використовуваних мікроорганізмів є повноцінною по складу живильних речовин (до 60% сухої маси білків) і характеризується підвищеним вмістом лізину й треоніну.

Із продуктів рослинного походження як білковий субстрат можна використовувати кукурудзу, сою, горох, картоплю, люпин й ін. Однак рослинна сільськогосподарська сировина містить білок, незбалансований склад якого залежить від умов вирощування культур, а також липи-ды в більших кількостях, ніж продукти тваринного походження.

В теперішній час нашою біологічною промисловістю на основі гідролізу рослинної сировини виробляється значний обсяг кормового білка для сільського господарства.

Як вихідна сировина для виробництва кормового білка можуть використовуватися найдешевші джерела, такі як відходи целюлозної й деревообробної промисловості, солома, бавовняна лушпайка, кошики соняшника, стрижні кукурудзяних качанів, бурячна меласа, картопляна мезга, пивна дробина, барда спиртових виробництв, відходи кондитерської і молочної промисловості.

Крім того, у Росії (в 1971 р.) і деяких інших нафтовидобувних країнах розробляються технології одержання кормових дріжджів з н-парафінів нафти. Дріжджові клітини можуть використовувати як джерела вуглецю для їхнього росту нерозгалужені вуглеводні із числом вуглецевих атомів від 10 до 30.

Поряд з одержанням кормових дріжджів важливе значення для кормовиробництва мають також бактеріальні білкові концентрати зі змістом сирого білка 60-80% від сухої маси. Тут як сировина використовуються газоподібні продукти, що містять метан.

1.5. Підготовка біореакторів до посіву й вирощування мікроорганізмів

При культивуванні мікроорганізмів найчастіше застосовується спосіб глибинного вирощування в спеціальних апаратах - ферментерах.

В простерилізований термічним способом ферментер подається заздалегідь здрібнена, охолоджена й вистояні сировина, що у даному ферментерному цеху піддасться кислотному гідролізу при підвищеному тиску й температурі, у результаті чого 60-65% містких в них полісахаридів гідролізуються до моносахаридів.

Ферментер для вирощування дріжджів і бактеріальних клітин у рідкому живильному середовищі представлене на рис 1.

Рис. 1. Ферментер для вирощування мікроорганізмів у рідкому живильному середовищі.

/ — корпус ферментера; 2 — охолоджувальна сорочка; 3 — теплообмінник; 4 — подача холодної води в теплообмінник; 5 — висновок теплої води з теплообмінника; 6 — подача посівної культури; 7 — подача рідкого живильного середовища 8 — подача повітря для аерації й перемішування живильного середовища 9 — кювету для напрямку потоку повітря у внутрішню порожнину теплообмінника; 10 — вихід мікробної суспензії по закінченні ферментації; 11 — вихід повітря в атмосферу через очисний фільт.

Представлений вище ферментер забезпечує режим постійного перемішування суспензії мікробних клітин у рідкому живильному середовище й оптимальні умови аерації. З метою підтримки заданого температурного режиму в конструкції ферментера передбачається система відводу надлишкового тепла.

Робочий цикл вирощування культури мікроорганізмів триває близько 20 годин. Наприклад, при оптимальних умовах з 1 т відходів хвойної деревини можна одержати 200 кг кормових дріжджів. По закінченні робочого циклу культуральна рідина разом із суспендированими в ній клітинами мікроорганізмів виводиться з ферментера, а в нього знову подається живильний субстрат і культура дріжджових або бактеріальних клітин для вирощування.

Виведена з ферментера суспензія далі подається на флотаційну установку, за допомогою якої виробляється відділення біомаси від культуральної рідини. Після відстоювання мікробна маса концентрується за допомогою сепаратора.

Для досягнення кращої перетравлення дріжджів і бактеріальних клітин в організмі тварин проводиться спеціальна обробка мікробних клітин (механічна, ультразвукова, термічна, ферментативна), що забезпечує руйнування їхніх клітинних оболонок. Потім мікробна маса упарюється до необхідної концентрації й висушується до вологості 8-10%.

В отриманій сухій дріжджовій масі втримується 40-60% сирого білка, 25-30% засвоюваних вуглеводів, 3-5% сирого жиру, 6-7% клітковини й зольних речовин, а також велика кількість вітамінів (до 50 мг%). За допомогою обробки дріжджів ультрафіолетовими променями проводиться їхнє збагачення вітаміном D2, що утвориться із вмісного в них эргостерину.

Бактеріальні білкові концентрати містять у середньому 60-80% сирого білка від сухої маси. Комерційна назва препарату, отриманого на основі метанолу - «Меприн», він містить у своєму складі до 70-74% від сухої маси білків, до 5% ліпідів, близько 10% мінеральних речовин, 10-13% нуклеїнових кислот. При цьому найбільш ефективні бактерії пологів Methylomonas, Pseudomonas й ін.

Для поліпшення фізичних властивостей готового продукту кормові білкові речовини випускають у гранульованому виді.

Культивування бактеріальних клітин на газоподібних живильних середовищах відрізняється наступними особливостями. Процес ферментації при вирощуванні мікроорганізмів на газоподібних вуглеводнях представлений на рис. 2.

Рис. 2. Процес ферментації при вирощкванні мікроорганізмів

на газоподібних вуглеводнях:

/ - корпус ферментера; 2 - охолоджувальна сорочка; 3 - мішалка; 4 - привід мішалки; 5 - подача газоподібних вуглеводнів; 6 - подача кисневмісного газу; 7 - подача рідкої живильної суміші; 8 — подача посівної культури; 9 — вихід мікробної суспензії по закінченні ферментації; 10 — випуск газу з ферментера; 11 — вихід газової суміші на рециркуляцію; 12 — газоаналізатор, що подає сигнал на регулюючий пристрій клапана; 13 - регулятор тиску усередині ферментера; 14-улавливатель вуглекислого газу

З метою кращої утилізації сировини мікроорганізмами в такому ферментері передбачається рециркуляція газової суміші. Для забезпечення необхідної аерації культури бактерій виробляється продувка ферментера повітрям або киснем. Найчастіше на газових живильних вирощувати середовищах бактерії роду Methylococcus, здатні при оптимальних умовах утилізувати до 85-90% подаваного у ферментер метану. Всі технологічні лінії, пов'язані з культивуванням бактерій у газовому середовищі, вимагають точного контролю за складом цього середовища й оснащення виробничих установок герметизированим, вибухобезпечним устаткуванням.

По закінченні ферментації клітини бактерій піддаються такої ж технології обробки, як і дріжджові клітини.

У зв'язку з тим, що газове середовище з метану й повітря вибухонебезпечні й для кращої утилізації метану бактеріями потрібна постійна рециркуляція, виробництво кормового білка з газоподібних продуктів є досить складним і дорогим.

1.6. Технологія культивування мікроорганізмів у спочиваючому стані без аерації

Деякі організми належать до групи мікроаерофільних (збудники бруцельозу, лептоспірозу, кампілобактеріозу й ін.), не потребуючої примусової аерації живильного середовища в якому вони вирощуються.

Застосовують балонний і реакторний способи культивування.

Балонний спосіб, зокрема для культивування лептоспір, полягає в тому, що мікробні культури лептоспір кожного серологічного варіанта вирощуються в 16-літрових скляних балонах з 10-12 л сироватковою або альбуміно-сивороточною (виробничою) середовищами при температурі 27-28°С протягом 5-7 діб.

1.7. Технологія промислового культивування анаеробних мікроорганізмів

До анаеробних мікроорганізмів відносяться такі, які здатні жити й розмножуватися при відсутності атмосферного кисню.

У силу біологічних особливостей анаеробів методи культивування їх у промисловості мають свої особливості.

1. При культивуванні анаеробних мікроорганізмів потрібно в реакторах створити умови повного витиснення з живильного середовища вільного кисню. Це досягається шляхом заповнення анаеробостатів газовою сумішшю водню й двоокису вуглецю, а залишковий кисень може бути вилучений шляхом каталітичного зв'язування з повітрям.

Анаеробні умови можуть бути досягнуті також додаванням у середовище відновлюючих агентів, таких як цистеїн й сульфід натрію, аскорбінової кислоти.

2.  Ступінь анаеробіозу визначається окислювально-відновним потенціалом (Eh). Для цих цілей у середовище вводять
окислювально-відновні індикатори, найчастіше використають резазурин (діазорезоурин), що міняє колір від синьо-рожевого до безбарвного. Безбарвний стан досягається при Eh близько  100 мв і вказує на наявність
анаеробних умов.

3.  При культивуванні анаеробів необхідно постійно
коректувати рН середовища, підтримуючи його в межах 7,2-7,8. У
процесі росту анаеробів рН середовища дуже швидко знижується в
кислу сторону, що приводить до інгібіровання їхнього росту.

1.8. Періодичні й хемостатні системи культивування мікроорганізмів

При глибинному вирощуванні мікроорганізмів їхні культури можуть перебувати в періодичних, або «закритих», і хемостатних (безперервних), або «відкритих», системах.

Закритою називають таку систему (культуру), коли хоча б один з компонентів живильного або середовища вона вся може не проступати в систему, не залишати її. У такій системі швидкість росту мікроорганізмів повинна після прискорення прагнути до нуля через недолік субстрату або через загибель мікробних клітин внаслідок нагромадження продуктів метаболізму. Отже, періодичні культури мікроорганізмів перебувають у нестійкому стані.

Відкрита (хемостатна) система - це система, коли всі живильні компоненти можуть надходити в реактор, у якому вирощується той або інший мікроорганізм, і віддалятися з реактора у вигляді продуктів синтезу мікроорганізмів (антибіотики, вітаміни, ферменти й т.д.) або біомаси самих мікроорганізмів. При цьому швидкість надходження живильного середовища в реактор і видалення з нього продуктів синтезу або біомаси можна регулювати в потрібному нам середовище розмноження мікроорганізмів.

1.8.1. Періодичне культивування мікроорганізмів

У періодичному стані динаміка росту й розмноження мікроорганізмів у рідкому живильному середовищі має ряд особливостей, загальних для бактерій, актиноміцетів, мікроскопічних грибів, мікоплазм й інших про- і еукаріот. При індивідуальному розвитку їм властива висока швидкість розмноження. Розвиток відбувається у вигляді послідовних фаз, характер і тривалість яких залежать від фізіологічного стану клітин, обумовленого, у свою чергу, умовами різноманітних факторів середовища, у якій розвивається популяція того або іншого організму.

Інакше кажучи, фази росту мікроорганізму відбивають кількісні і якісні зміни в їхній біомасі й навколишнім середовищі.

У простій гомогенній періодичній культурі мікроорганізмів виділяють від 4 до 8 і навіть до 16 фаз.

Ріст мікробної популяції зображують звичайно графіками, відкладаючи на осі абсцис час росту, а на осі ординат - число мікробних клітин (рис. 3).

Рис. 3. Ріст мікробної популяції при періодичному культивуванні

Кожна фаза наведеного графіка є підсумованим вираженням розмноження й відмирання клітин у мікробній популяції. Оскільки мікробні клітини діляться в різному темпі, те представлена на графіку крива наростання їхнього числа на початку й зменшення числа живих клітин наприкінці росту має вигляд пологої лінії. Форма цієї кривої (S-образна) є універсальною й не залежать від виду мікроорганізмів й умов культивування.

Кожна із зазначених на графіку (рис. 3) фаз росту й розмноження характеризується в такий спосіб:

а)               вихідна фаза (лаг-фаза або інукційний період) є фазою затримки росту, коли розмноження мікробних клітин не відбувається. Дана фаза характеризується відсутністю росту клітин. У цей період посівна культура пристосовується до зовнішніх умов, що змінилися, і виробляє ферменти, необхідні для росту на даному живильному середовище. У лаг-фазі в клітинах культури відбуваються значні якісні зміни: зростає кількість нуклеїнових кислот, у першу чергу РНК, активізуються одні ферменти й
синтезуються інші.

Тривалість лаг-фази залежить від наступних факторів:

-    від складу живильного середовища, якщо живильне середовище
по складу мало відрізняється від середовища, на якій росла посівна культура, лаг-фаза може бути практично відсутньою ;

-    від якості посівного матеріалу, а саме, кількості в
ньому життєздатних клітин, їхнього віку, способу зберігання;

-    від посівної дози;

б)               період позитивного прискорення росту. Тривалість
цього періоду для більшості мікроорганізмів становить 2
години й залежить від температури, складу живильного , середовища якості посівного матеріалу. Багато авторів ці дві фази розглядають разом. Число клітин залишається постійним через відсутність у цей період клітинного розподілу. Загальний стан мікробних клітин характеризується як стан пристосування   до живильного середовища . У цей період підсилюється синтез речовини, клітин, вони збільшуються в розмірі, у них утвориться велика кількість індуцибельних ферментів;

в)              фаза логарифмічного (лог-фаза), або експоненци­ального (показового), росту. Вона характеризується постійною й максимальною швидкістю росту клітин. Ріст мікробів у цю фазу відбувається в геометричній прогресії. Тривалість цієї фази залежить:

-    від запасів живильних речовин у середовищі;

-    від умов аерації;

-    від перемішування й ін. факторів.

Для опису процесів росту мікроорганізмів використають такі характеристики, як загальна й питома швидкості росту біомаси (або числа клітин). Іншою важливою характеристикою росту культури є час генерації, за яке біомаса культури подвоюється. Час генерації з різних культур мікроорганізмів сильно розрізняється. Найбільше бистрорастучі бактерії при сприятливих умовах мають період генерації -              20-25 хв.

Тривалість генерації в лог-фазі в різних мікроорганізмів неоднакова. Так, для сальмонел вона дорівнює 20-30 хв., для стрептококів і стафілококів - 25-35 хв., для ешеріхій - 15-17 хв.

На тривалість генерації впливають температура, рН середовища, склад середовища й т.д.

Висока швидкість розвитку мікроорганізмів зберігається на всій експонентній стадії. Однак ця залежність спостерігається протягом обмеженого часу. У міру росту культури в середовищі поступово споживаються живильні речовини, накопичуються продукти обміну, утрудняється транспорт живильних речовин (у першу чергу кисню) і метаболітів внаслідок збільшення щільності популяції;

г)              фаза негативного прискорення. У цю фазу швидкість
розмноження сповільнюється, а час генерації збільшується.
Настання даної фази обумовлено виснаженням живильного середовища й нагромадженням у культуральній рідині токсичних речовин, які починають інгібіровати розвиток культури. Крім того, у цю фазу відбувається найвище нагромадження мікробної маси в одиниці об'єму;