Выделение и клонирование генов

Содержание:

1.Выделение  и клонирование генов……………………………………..……1-14

2.Криоконсервация  эмбрионов………………………………………………..15-27

3.Список  литературы………………………………………………………………….….28

1. Выделение и клонирование генов.

1. Получение  генов.

а) Выделение генов из ДНК: изолированную ДНК подвергают фрагментации. Для этого используют ферменты - рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), катализирующие расщепление ДНК на участках, имеющих определенные последовательности нуклеотидов (обычно длиной в 4-7 нуклеотидных пар). Расщепление может происходить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар, и тогда обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты имеют двунитевые (тупые) концы. Другие рестриктазы расщепляют нити ДНК со сдвигом, образуется ступенька – одна из нитей ДНК выступает на несколько нуклеотидов. Образуются однонитевые (липкие) концы. Если встречаются два липких фрагмента ДНК, полученных действием одной и той же рестриктазы, то они легко вступают во взаимодействие (по принципу комплементарности):

При необходимости тупые концы могут быть превращены в липкие. Нуклеотидная последовательность с липкими концами может быть присоединена к вектору, предварительно обработанному той же рестриктазой или превращена из линейной молекулы в кольцевую путем сшивания взаимно комплементарных концов.

Однако данный метод выделения генов из ДНК имеет недостатки:

1) Достаточно  трудно подобрать рестриктазы, позволяющие  вырезать из ДНК именно тот  участок, который соответствует  нужному гену. Наряду с интересующим  геном фрагменты ДНК, как правило, включают лишние нуклеотидные  последовательности, мешающие использованию  гена. Рестриктаза может отщепить  часть нуклеотидной последовательности  гена, в результате ген теряет  функциональную полноценность.

2) Гены эукариот  имеют сложное строение: включают  экзоны и интроны. Первичная РНК, синтезированная на такой ДНК-матрице, подвергается модификации (сплайсингу), в результате участки, соответствующие  интронам, удаляются, а участки, соответствующие  экзонам, соединяясь, образуют зрелую  матричную РНК. Наличие интронов  является препятствием для нормального  функционирования трансплантированных  генов.

3) При обработке  ДНК рестриктазами образуется  смесь фрагментов. Выделить из  нее фрагменты, несущие нужный  ген – сложная задача. Бактериальная  клетка содержит около 5 тыс. генов, а эукариотная клетка – от 10 до 200 тыс. генов.

б) Химико-ферментативный синтез генов. Данный метод является альтернативой «вырезанию» генов с помощью рестриктаз из нативной ДНК. Метод включает химический синтез коротких (8-16-звенных) одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшивку олигонуклеотидов между собой посредством ДНК-лигазы с образованием двухцепочечных полинуклеотидов.

Химико-ферментативный синтез позволяет точно воссоздать минимально необходимую последовательность нуклеотидов.

Кроме того, существует возможность введения в гены участков узнавания различных рестриктаз, регуляторных последовательностей.

Применимость данного метода ограничена возможностями получения информации о нуклеотидной последовательности гена. Эта последовательность может быть воссоздана на основе первичной структуры соответствующего белка.

Методом химико-ферментативного синтеза получены гены соматостатина, А- и В-цепей инсулина, проинсулина и др.

в) Ферментативный синтез генов на основе выделенной из клетки м-РНК. Это наиболее широко распространенный метод синтеза генов. Обратная транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной мРНК. Полученную одноцепочечную ДНК (комплементарная ДНК, кДНК) используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы.

Достоинством данного метода является то, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Кроме того, легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК.

С помощью этого метода в 1979 г. был получен ген соматотропина (гормона роста человека).

2. Введение  гена в вектор.

Ген, полученный одним из выше описанных способов, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. Для этого нужны дополнительные механизмы, управляющие действием, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов.

Векторы – это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Полученная линейная молекула ДНК должна содержать липкие концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы (рис. 1).

Рис.1 Встраивание изолированного гена в генетический вектор

Различают два основных класса векторов: вирусы и плазмиды. При использовании в качестве генетических векторов вирусов возникает проблема – ослабление их патогенности для хозяина.

Большое значение для биотехнологии имеет способность вирусов быстро транспортироваться из клетки в клетку, распространяясь по растительной или животной ткани так, что в короткие сроки развивается генерализованная инфекция по всему организму. Такое свойство вирусов дает возможность генетической модификации соматических клеток взрослого организма, что является перспективным при лечении наследственных заболеваний человека путем введения вирусов, разносящих недостающие гены по всем ~ 1011 клеткам человеческого тела.

Однако наибольшее применение в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды E. coli. Бактериальные плазмиды подразделяются на конъюгативные, т.е. способные к переносу генетической информации от клетки к клетке путем конъюгации бактерий, и неконъюгативные, передающиеся от одной клетки к другой посредством механизма бактериальной трансформации. Некоторые плазмиды способны к амплификации, т.е. образуют в клетке большое число копий, что резко повышает уровень фенотипического выражения генов.

При конструировании векторов в них вводят участки узнавания рестриктаз, а также гены-маркеры, кодирующие легко распознаваемые признаки. По этим признакам отбирают клетки, являющиеся носителями вектора.

В генетической инженерии растений чаще всего используют бактерии родов Rhizobium и Agrobacterium.

3. Перенос  генов в клетки организма-реципиента.

Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансформации или конъюгации. Если гены встраиваются в геном вируса, то наиболее распространенным способом передачи информации является трансформация.

Чтобы клетку легко можно было трансформировать она должна быть компетентной. Компетентность бактериальных клеток достигают обработкой СаСl2, полиэтиленгликолем, воздействием теплового удара. ДНК легко проникают в клетку через цитоплазматическую мембрану протопластов. Протопласты бактерий получают при обработке лизоцимом, который гидролизирует мукопептиды клеточной стенки. Протопласты клеток растений и дрожжей получают, разрушая ферментами полисахариды оболочки.

Эффективность трансформации протопластов эукариот увеличивает диэтиламиноэтилдекстран и полиэтиленгликоль. ДНК в клетки высших организмов вводят микроинъекцией.

Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь передачи генетической информации, она имеет наибольшее значение для генетической инженерии. Однако существуют еще два способа передачи генетической информации – конъюгация и трансфекция, которые можно рассматривать как варианты трансформации.

При конъюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид (конъюгативных). Неконъюгативные плазмиды также могут передаваться путем конъюгации при участии плазмид-помощников.

Трансфекция – передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию вирусных частиц в клетке. Трансфекция бактерий включает следующие этапы: получение сферопластов, очистка среды инкубации от внеклеточных нуклеаз и добавление очищенной ДНК фага (с добавлением протаминсульфата, повышающим эффективность трансфекции). Трансфекцию клеток растений и животных осуществляют двумя способами: использованием очищенной ДНК и протопластов, а так же заражением целых многоклеточных организмов (в этом случае говорят об инфекции) вирусными частицами или ДНК. Кроме того, сконструированы многочисленные челночные векторы, способные к репликации в животной и бактериальной клетке и поддерживающие эффективный синтез клонируемого гена в животной клетке.

4. Идентификация  клеток-реципиентов, которые приобрели  желаемый ген (гены).

После трансформации, конъюгации или трансфекции необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. Успех генноинженерного проекта зависит от эффективности использованного метода отбора, т.к. после трансплантации генов только небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.

Первая стадия: отбор клеток, несущих соответствующий вектор. Отбор проводится по генетическим маркерам, которыми помечен вектор.

Например, детерминанты устойчивости к антибиотикам на векторе позволяют обогатить бактериальную популяцию клетками, содержащими этот вектор, при их высеве на среду с антибиотиком.

Вторая стадия: поиск клеток, несущих не только вектор, но и ген-мишень. Для этого используют две группы методов.

1. Методы, основанные на непосредственном  анализе ДНК клеток-реципиентов:

- определение  нуклеотидной последовательности  ДНК: из клеток, предположительно  содержащих искомый ген, выделяют  ДНК вектора, в которой проводится  поиск участков, несущих этот  ген; затем проводят секвенирование  части нуклеотидной последовательности  гена;

- гибридизация  выделенной из клеток ДНК с  зондом, который может быть или  интересующим геном, или соответствующей  ему мРНК. Предварительно изолированную  ДНК переводят в одноцепочечное  состояние и вводят ее во  взаимодействие с одноцепочечным ДНК- (или РНК-) зондом. Далее определяют присутствие двуцепочечных гибридных молекул ДНК.

2. Методы, основанные  на идентификации признака, кодируемого  геном:

- непосредственный  отбор клеток, синтезирующих белок  – продукт транскрипции и трансляции  гена-мишени, или клеток, образующих  соединение, в синтезе которого  участвуют ферменты, кодируемые  геном;

- использование  селективных сред, поддерживающих  рост только тех клеток, которые  получили ген-мишень;

- иммунологическая  детекция применяется, если искомый  ген в составе рекомбинантной  ДНК транскрибируется и транслируется, но никак не влияет на фенотип  организма.

Клонирование генов.

В обычном понимании клоном считается идентичная копия высшего организма, например всемирно известная и ныне покойная овечка Долли. Молекулярные биологи, однако, клоном считают популяцию генетически идентичных (за исключением мутаций, происходящих во время клонирования) организмов, клеток, вирусов или молекул ДНК.

Для получения клона вируса необходимо заразить одну клетку одним вирионом. Все образующиеся вирионы, произведенные зараженной клеткой, будут клонами исходного вириона. Поскольку эти клоны могут заражать новые клетки, то очень быстро можно получить множество копий исходного вириона. Они выглядят как отдельные ясные пятна (бляшки), вызванные гибелью зараженных клеток, на слое (газоне) незараженных клеток в чашке Петри.

Вы можете клонировать клетку, просто выращивая ее на слое ростовой среды (обычно агара — вещества, приготовленного из морских водорослей). Бактериальные клетки, как и клетки млекопитающих, легко клонируются таким образом.

Однако целью клонирования, с точки зрения изучения ДНК, является не получение идентичных копий нормальной клетки, а получение большого количества определенного фрагмента ДНК.

В генетической инженерии цель клонирования, как правило, — получение значительного количества копий специфического гена. Этот ген сообщает клетке функцию, которую вы хотите получить в генетически модифицированном организме.

Прежде чем получить множество копий гена, его нужно сначала отделить от остального генома. Первый шаг на этом пути — создание библиотеки, в которой ДНК генома разбита на куски. Если удача сопутствует вам, то ген, который вы ищете, будет расположен на одном из таких кусков.

Библиотека в данном случае ничего общего с книгами не имеет. Скорее, это коллекция фрагментов ДНК, выделенных из одного источника, коллекция клонов.

Для создания библиотеки понадобится вектор. Какая-нибудь молекула ДНК, в которую вы сможете встроить новую ДНК и внести ее в хозяйскую клетку, чтобы она могла реплицировать ее. Самыми распространенными векторами являются плазмиды. Также векторами могут служить фаги .

Выбор вектора для клонирования

Не только вирус или плазмида могут использоваться как векторы. Идеальный вектор для генетической инженерии должен иметь три характеристики.

1. Хороший  потенциал клонирования. То есть  должен давать большое количество  реплик в хозяйской клетке.

2. Его геном  должен иметь один сайт узнавания  для каждого из многих ферментов  рестрикции. Таким образом, чужой  ген сможет встраиваться только  в одну точку вектора.

3. Он должен  иметь полезную функцию в клетке, например нести ген устойчивости  к антибиотику, чтобы можно было  легко отличить клетки, несущие  вектор, и выделить встроенный  в него ген.

ДНК генома из донорского организма разрезается на множество фрагментов ферментами рестрикции, которые также разрезают ДНК-плазмиды в одном месте. Фрагменты геномной ДНК и разрезанной ДНК-плазмиды смешивают. Их липкие концы соединяются друг с другом, в основном, случайно. В результате образуется множество различных плазмид, каждая из которых несет фрагмент донорской ДНК, все они вместе содержат совокупную ДНК генома донора.

Эти плазмиды вводятся в клетки бактерий-реципиентов (клетки становятся проницаемыми для чистой плазмидной ДНК при обработке их холодным раствором хлорида кальция). Трансформированные бактериальные клетки распределяют тонким слоем по агару, так что каждая клетка может размножаться отдельно от остальных.

Плазмида, используемая в качестве вектора, обычно несет гены устойчивости к двум антибиотикам. Исследователи пользуются ферментом рестрикции, чтобы разрезать ДНК плазмиды в одном из этих генов. Любая бактерия, не несущая плазмид, гибнет от каждого из двух антибиотиков. Бактерии, получившие плазмиды без клонированного в них чужого фрагмента ДНК, выживают на агаре с каждым из двух антибиотиков. А вот клетки, несущие плазмиды, в которые встроена чужеродная ДНК, будут расти на агаре только с антибиотиком, ген устойчивости к которому не был разрушен ферментом рестрикции (рис. 2). Эти клетки, у которых чужой ген встроен в ген устойчивости ко второму антибиотику, сформируют колонии, или клоны. Все клетки в каждой колонии будут нести множество копий исходной ДНК, но каждая из них будет также содержать копию нового, чужеродного фрагмента ДНК.

Рис. 2. Использование плазмидного вектора с двумя генами устойчивости к антибиотикам облегчает создание библиотеки

Такая же методика применяется для вирусных или фаговых векторов.

Однажды созданные библиотеки хранятся как постоянный источник ДНК для клонирования (почему, собственно, их и называют библиотеками ).

Библиотеками часто пользуются, чтобы выделить определенные гены. Есть два пути поиска специфических клонов в библиотеке, которые несут фрагменты ДНК с последовательностями нужного гена. Один путь заключается в поиске специфической последовательности оснований этого гена (если она известна).

Другой путь состоит в поиске специфического белка, кодируемого геном. В любом случае, поиск называется скринингом. Есть много методов скрининга, зависящих от используемого вектора и гена, который предстоит найти.

Пример поиска гена, для которого известна последовательность оснований ДНК, приведен на рис. 3.

Рис. 3. Один из методов поиска (скрининга) клонов с определенной последовательностью ДНК

Колонии бактерий или бляшки фага с агара на чашках Петри переносят на твердый диск, обычно из целлюлозы, очень простой методикой. Диск кладут на агар, потом поднимают. Колонии и бляшки остаются на месте, но достаточное для анализа количество материала переносится с них на нитроцеллюлозу диска.

Затем ДНК на диске расплетается за счет помещения его в химический раствор, содержащий однонитевую ДНК или РНК, комплементарные одной из нитей клона и меченные радиоактивными атомами. Меченая нить называется пробой.

В местах соединения пробы с одной из рекомбинантных нитей она оставляет меченые атомы, которые могут регистрироваться на фотографической пленке. Эти места полностью соответствуют местам расположения клонов на агаре в чашке Петри.

Если последовательность ДНК разыскиваемого гена неизвестна, можно использовать другой метод скрининга. Он основан на создании клонов с использованием векторов, позволяющих выражаться генам, которые на них распложены, в новых хозяйских клетках. Клетки начинают продуцировать белок, кодируемый геном, а исследователям остается искать в библиотеке белок нужного гена.

Как только место расположения клона найдено, клон можно снять с агара микробиологической петлей и размножить. Рекомбинантная ДНК легко выделяется из клона и очищается, а клетки клона, продуцирующие ее, длительное время размножаются и хранятся в лаборатории. Все это обеспечивает генным инженерам неограниченное поступление материала нужного гена для его встройки в другие организмы.

Криоконсервация эмбрионов.

Существует два основных способа глубокого замораживания эмбрионов: 
1. Контролируемая медленная (постепенная) криоконсервация; 
2. Несбалансированная криоконсервация с а)ультрабыстрым замораживанием и б)витрификацией. 
Контролируемая медленная криоконсервация является в настоящее время обычным методом консервации эмбрионов. Их охлаждают медленно, чтобы: а) произошло обезвоживание зародыша и уменьшилось образование больших внутриклеточных кристаллов льда; б) жидкость вышла за пределы клеток и более крупные кристаллы льда образовывались только в межклеточном пространстве; в) зародыши оставались в равновесии с замерзающим раствором. При этом если клетки охлаждаются слишком быстро, существует опасность повреждения эмбриона из-за межклеточной и внутриклеточной кристаллизации. Кроме того, растущая концентрация солей в межклеточном растворе может вызвать токсическое повреждение эмбриона. Для такой медленной криоконсервации необходим дорогостоящий импортный замораживатель (стоимостью около 12 тысяч евро), а сам процесс длится два с половиной часа. 
При ультрабыстрых методах замораживания эмбрионы, находящиеся в растворе 3,5-4,5 М ДМСО (диметилсульфоксид) и 0,25-0,5 М сахарозы, помещают в жидкий азот. При этом образующиеся мелкие кристаллы льда, менее стабильные, чем острые крупнокристаллические и тающие при очень низких температурах, не оказывают разрушительного воздействия на тканевую структуру зародыша. 
Под витрификацией понимают переход жидкости в твердое состояние, который вызван не кристаллизацией, а повышением вязкости во время охлаждения.

Витрификационная жидкость состоит из смеси высококонцентрированного (10-25%) проникающего криопротектора (ДМСО, ацетамид, пропиленгликоль, глицерин, этиленгликоль) и непроникающего криопротектора (полиэтиленгликоль, фиколл, сахароза) в буферном солевом растворе. При витрификациизначительно упрощается не только процесс охлаждения, поскольку эмбрионы после кратковременной выдержки в витрификационном растворе сразу погружаются в жидкий азот, но и исключается опасность физических и химических повреждений, вызванных межклеточной и внутриклеточной кристаллизацией воды, к тому же здесь не нужно дорогое компьютеризированное оборудование. Единственным недостатком витрификации является химическая токсичность витрификационных растворов, которая находится в прямой зависимости с концентрацией криопротектора, временем и температурой экспозиции эмбриона в этом растворе. 
Технологические этапы процесса криоконсервации эмбрионов. Использование технологии криоконсервации зародышей позволяет сохранить генетически ценный эмбриоматериал при отсутствии реципиентов, а также проводить трансплантацию эмбрионов в строго определенные сроки с максимальной эффективностью. 
Технология глубокого замораживания и оттаивания эмбрионов предусматривает следующие этапы: 
1. Оценка качества полученных эмбрионов. 
2. Насыщение зародышей криопротектором. 
3. Постепенное охлаждение эмбрионов с помощью программных замораживателей. 
4. Перенос их в жидкий азот на хранение. 
5. Оттаивание эмбрионов при определенной температуре. 
6. Выведение криопротектора из зародышей. 
7. Морфологическая оценка эмбрионов под микроскопом на пригодность к трансплантации. 
8. Заправка эмбриона в пайету и далее в катетер. 
9. Пересадка эмбрионов реципиентам. 
Методика приготовления криопротектора глицерина. В качестве криопротектора для замораживания эмбрионов на стадии развития поздней морулы или ранней бластоцисты и получивших оценку не ниже «хорошо», может использоваться 1,4М раствор глицерина. Методика его приготовления приведена в таблице 5.3. 
 

Таблица 5.3. Методика приготовления раствора глицерина  

 
Насыщение эмбрионов криопротектором осуществляется либо поэтапно в возрастающих концентрациях растворов, либо одноступенчато, как это показано в таблице 5.4. 
Все работы с эмбрионами проводят с использованием стерильной посуды, инструментов и оборудования. После выдержки зародышей в растворе с конечной концентрацией криопротектора соблюдают следующие правила подготовки:  

Таблица 5.4. Схема насыщения эмбрионов криопротекторами

а) эмбрионы с помощью шприца объемом 1 см3 помещают в пайеты, при заправке которых соблюдают следующую последовательность их заполнения (рис. 5.2);

Рис. 5.2. Схема заправки пайеты с эмбрионом

1 - пыж, 2 - защитный  раствор, 3 - пузырек воздуха, 4 - эмбрион, 5 - пайета, 6 - маркировочная пробка 
 
– вначале набирают раствор криопротектора в количестве 2/5 объема; 
– затем пузырек воздуха; 
– снова раствор с эмбрионом (1/5 объема); 
– пузырек воздуха; 
– раствор криопротектора (2/5 объема). 
б) заправка проводится таким образом, чтобы введенный первым объем раствора, постепенно продвигаясь дальше, смочил пыж пайеты; 
в) в одну пайету заправляют не более 2-х эмбрионов; 
г) нижний конец пайеты закрывают пластиковой маркировочной пробкой, на которой указывают дату извлечения эмбриона, номер коровы-донора,

 номер  быка производителя, номер пайеты; 
д) рекомендуется использовать следующие наиболее распространенные иностранные марки программных замораживателей: Миникул АС-25; CryoCell 1200; DB1 EmbryoFreeze. 
Режимы замораживания приведены в инструкциях к замораживающим устройствам. 
Пайеты с эмбрионами переносят в камеру для замораживания и включают программу. Схема прибора для замораживания представлена на рис. 5. 3.

 
 
Рис. 5.3. Схема программного замораживателя 
1.Морозильная камера; 2.Блок автоматики с датчиком температуры 
3.Сосуд Дьюара; 4.Электронное клапанное устройство

Снижение температуры происходит автоматически до заданного программой уровня. Затем пайеты быстро переносят в жидкий азот для хранения (рис. 5.4).

Рис. 5. 4. Перенос пайеты из замораживателя DB1 EmbryoFreeze в сосуд Дьюара  

Методика размораживания эмбрионов:

1. Достают  пайеты из сосуда Дьюара, выдерживают  на воздухе 10 секунд при комнатной  температуре и погружают на 10 секунд в водяную баню (оттаиватель) при температуре 25°С. 
2. Содержимое пайет вместе с эмбрионом переносят на часовое стекло и делают последовательную проводку (перемещение) по нисходящей концентрации растворов, либо удаляют криопротектор одноступенчато (табл. 5.5). 
3. После морфологической оценки качества эмбрионов их заправляют в пайеты вышеуказанным способом. 
4. Пайету вставляют в металлический цилиндр катетера. 
5. Одевают вначале защитный чехол, затем поверх него полиэтиленовый санитарный чехол. На нем указывают номер закрепленного животного-реципиента, которому и пересаживают зародыш. 
6. Для пересадки эмбрионов используют животных-реципиентов не имеющих генетической ценности.

Таблица 5.5. Методика удаления криопротекторов из эмбрионов  

Методика охлаждения эмбрионов в замораживателе.

1. Подача  жидкого азота обеспечивается  действием электронного клапанного  устройства 4 (рис. 5.3) и производится  в направлении из сосуда Дьюара (3) в морозильную камеру снизу (1). 
2. Сигналы с датчика температуры (2), размещенном внутри электронного блока автоматики, обуславливают подачу ответного сигнала на клапан (4), регулируя тем самым скорость охлаждения. 
3. После окончания программы замораживания пайеты, фиксируя пинцетом за пластиковые пробки, быстро переносят из морозильной камеры программного замораживателя в стандартную канистру с жидким азотом сосуда Дьюара (рис. 5. 4). 
Микроскопическая оценка качества. В технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота оценке биологической полноценности зародышей придается большое значение. Оценивают их качество на основании определения стадии развития, состояния оболочек и внутренних структур. 

Биологически полноценнымипринято считать эмбрионы, которые имеют: 

1. Правильную шарообразную форму; 
2. Гомогенную светлую цитоплазму; 
3. Неповрежденную прозрачную оболочку; 
4. Одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом. 
5. Они должны соответствовать по уровню дробления возрасту от момента оплодотворения до их извлечения. 
При оценке эмбрионов соблюдают следующую последовательность: 
1. После процедуры промывания рогов матки коровы-донора мерные бутыли с полученной жидкостью передают через окно-шлюз в стерильный бокс. 
2. Осаждение эмбрионов производят в течение 20 минут в термостате при 37°С. 
3. Верхнюю часть жидкости из каждой емкости удаляют с помощью сифона, оставляя 50-100 мл. 
4. Отстой переносят в 2-3 пластмассовые чашки Петри, дно которых для удобства подсчета эмбрионов расчерчено на квадраты 0,8х0,8 см. 
5. Под микроскопом при 15-20-и кратном увеличении находят эмбрионы и шприцем емкостью на 1 см3 (через присоединенную к нему укороченную пайету) переносят на малое часовое стекло в 1 мл солевого раствора Дюльбекко для кратковременного хранения и морфологической оценки при увеличении в 100 раз. 
Выявляют неоплодотворенные яйцеклетки, без признаков развития и с дегенеративными изменениями оболочки или цитоплазмы (рис. 5. 5; 1). Дегенерированные яйцеклетки имеют: сморщенную, неправильной формы цитоплазму. Нередко наблюдается разрушение цитоплазмы; растягивание, разрыв или расслоение прозрачной оболочки (рис. 5.5;2).