Биотехнология в молочном скотоводстве

Министерство сельского  хозяйства Российской Федерации

ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный аграрный университет»

Кафедра скотоводства и коневодства

Курсовая работа

Выполнила:

Магистрантка первого курса

Проверил:

доктор с.-х. наук, профессор

Ли С.С

Барнаул 2012

Содержание:

1. Введение                                                                                                        3

2.Биотехнология в молочном скотоводстве                                                    4

3.Отбор коров-доноров и реципиентов для трансплантации                        5

4.Вызывание суперовуляции у коров-доноров                                             10

5.Синхронизация половых циклов доноров и реципиентов                       14

6.Искусственное осеменение коров-доноров                                               16

 7.Контроль реакции яичников                                                                       19

8.Оценка качества эмбрионов, их кратковременное культивирование     21

9.Криоконсервирование эмбрионов                                                              30

10.Получение телят-двоен у крупного рогатого скота                                34

Заключение                                                                                                       40

1.Введение

Трансплантация эмбрионов  женским особям сравнима по возможностям с техникой искусственного осеменения, позволяющей полнее использовать генотип  выдающихся самцов. Однако широкое  внедрение этой перспективной технологии сдерживается несовершенством методов  получения большого числа зрелых, полноценных, способных к оплодотворению ооцитов.

В странах СНГ работы по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота начаты в 1975 г. Первые телята были получены в начале 1977 г. во Всесоюзном НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, а первый теленок от пересадки замороженного эмбриона во Всесоюзном институте животноводства в 1980 г. С 1983 года организованы четыре центра трансплантации эмбрионов: ВИЖ, ВНИИРГЖ, НИИЖ Лесостепи и Полесья. УССР, Украинский НИИ разведения и искусственного, осеменения крупного рогатого скота. Мировая практика пересадки эмбрионов успешно развивается. Применение метода трансплантации эмбрионов непрерывно растет. При этом технология технически совершенствуется, а эффективность метода возрастает.

В настоящее время наиболее эффективен нехирургический метод  трансплантации эмбрионов. В среднем  на современном уровне биотехнологии получают с применением пересадки эмбрионов около 10 телят, а в отдельных случаях до 50 телят от одного донора в год, тогда как при обычном способе размножения (искусственном осеменении) корова за всю жизнь могла бы воспроизвести 7–8 телят. Поэтому идея получения максимального числа потомков от лучших по продуктивности самок издавна привлекала внимание исследователей. Решение этой проблемы стало возможным на основе применения метода трансплантации эмбрионов.

Современные технологии способны совершить истинное чудо, ибо, на сегодняшний  день, стало реальностью то, что  некогда считалось фантастикой - осуществить трансплантацию эмбрионов  в такой отрасли хозяйства, как  животноводство.

2.Биотехнология в молочном скотоводстве.

Одним из основных методов  совершенствования пород молочного  скота является искусственное осеменение с использованием высококлассных быков-производителей. На современном этапе имеющееся  поголовье высокопродуктивных коров  не обеспечивает полную потребность  госплемпредприятий в быках-производителях. Ускорить процесс тиражирования коров с высокими параметрами продуктивности в сжатые сроки при традиционных методах размножения трудно. Используя метод трансплантации эмбрионов в селекционно-племенной работе открывается возможность ускоренного размножения генетически ценных животных по материнской линии.

В настоящее время технология трансплантации эмбрионов включена в долгосрочные племенные программы  многих развитых стран мира по разведению, улучшению и сохранению существующих пород молочного скота.

Углубленные исследования репродуктивной функции животных, ее возможная регуляция, микрохирургические манипуляции с  зародышами показали, что метод трансплантации может является основой ускоренного воспроизводства высокопродуктивных коров и целых популяций. Практическое применение этого метода в молочном скотоводстве обеспечивает интенсивное размножение животных с высокой генетической ценностью, ускоренное получение высокоценных племенных быков, матерями которых являются выдающиеся родоначальницы, способствует повышению эффективности племенной работы, оздоровлению стад от ряда заболеваний.

Мировой опыт свидетельствует, что трансплантация эмбрионов может  ускорить селекционный прогресс в молочном скотоводстве в 6-7 раз по сравнению  с обычными методами разведения. Метод  трансплантации позволяет получать зародыши от одной самки 4-5 раз в  год, вследствие чего очевидна реальная возможность ежегодного получения  от коровы рекордистки до 10-30 и более  телят. Это позволяет значительно  ускорить ежегодный генетический прогресс в стаде путем интенсивного отбора, точности оценки матерей быков и племенного использования животных с высоким генетическим потенциалом.

Трансплантация эмбрионов  позволяет быстро размножить импортируемые  группы животных. Кроме того, ввозить  зародыши гораздо дешевле, чем животных. Разработанная технология криоконсервирования эмбрионов обеспечивает длительное их хранение и создание криобанка зародышей выдающихся животных. В товарных стадах трансплантация эмбрионов дает возможность увеличения выхода телят за счет получения двоен от пересадки эмбрионов, а также производства телят мясных пород, используя молочных коров.

Технология трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота  включает следующие этапы работы: отбор коров-доноров и реципиентов; вызывание суперовуляции у доноров; синхронизацию половых циклов доноров  и реципиентов; искусственное осеменение доноров; извлечение эмбрионов; оценку жизнеспособности зародышей; криоконсервирование эмбрионов; пересадку эмбрионов.

3.Отбор коров-доноров и реципиентов для трансплантации.

Эффективность применения метода трансплантации эмбрионов во многом зависит от клинического и физиологического состояния коров, их способности  реагировать на экзогенные гонадотропины  и выделять достаточное число  качественных зародышей. Следовательно, одним из наиболее существенных моментов в технологии трансплантации эмбрионов, способных повысить эффективность  метода является отбор доноров и  реципиентов.

Исходя из того, что донор  – животное высокой племенной  ценности, то первое, на что обращают внимание при их отборе - это молочная продуктивность, которая за ряд лактаций должна быть на 50-60% выше стандарта данной породы, а содержание жира в молоке – на 20% и более. Число учитываемых признаков может быть расширено в зависимости от поставленных селекционных целей. Например, содержание белка в молоке, пригодность к машинному доению (форма вымени, скорость молокоотдачи), крепость конституции, экстерьер и т.д. Племенная ценность донора, наряду с оценкой собственного генотипа, должна подтверждаться продуктивностью родителей. Коровы-доноры должны иметь известное происхождение, подтвержденное документально по системам групп крови. В большинстве случаев в качестве доноров используют лактирующих или выбракованных коров (не связанных с гинекологической патологией), в возрасте от 4 до 8 лет, живой массой 500-650 кг, с удоем по наивысшей лактации не ниже 7 тыс. кг молока, жирностью 3,7% и более.

Не менее важным, а может  и определяющим фактором при отборе доноров является состояние репродуктивных органов. Поэтому для гормональной обработки следует отбирать животных не ранее, чем через 2,5-3 месяца после  отела. При этом уменьшение размеров матки до физиологически необходимых  размеров не может служить гарантией  готовности давать эмбрионы высокого качества. Такой гарантией может  быть только проведение клинического обследования предполагаемого донора, которое при необходимости дает возможность определить направление восстановления функций размножения на основе экзогенной гормонотерапии.

Целесообразно проводить  разовую индукцию полиовуляции потенциальных доноров с целью выяснения ответной реакции яичников на введение гонадотропина, после чего делается окончательное заключение о пригодности животного к использованию в технологии трансплантации. Коровы и телки с положительной ответной суперовулирующей реакцией (10 и более овуляций) и давшие не менее 4-х жизнеспособных эмбриона за первую обработку переводятся в группу постоянных доноров.

Оптимальный интервал между  повторными обработками животных - 60-70 дней, в этом случае от донора можно  извлекать эмбрионы до 5 раз в  год. В технологии трансплантации эмбрионов  коров-доноров с уровнем реакции  полиовуляции до 6 желтых тел можно использовать повторно через 35-45 дней.

В качестве реципиентов используются телки случного возраста (16-18 месяцев) не представляющие племенной ценности, живой массой 380-400 кг. Не рекомендуется  использовать телок с низкой живой  массой.

Реципиенты должны быть клинически здоровы, внутренние и наружные половые  органы хорошо развиты, половой цикл должен соответствовать физиологическим  параметрам. При ректальном исследовании матка и яичники реципиента должны находиться в тазовой полости. Шейка  матки должна быть четко выражена, длиной 7-12 см, диаметром 2,5-3,0 см. Длина  рогов матки от 20 до 35 см. Яичники  должны иметь округлую или овальную форму, плотную консистенцию, размер 3х2 см у коров и 2,0х1,5 см у телок.

Исследованиями выявлена зависимость приживляемости зародышей от морфофункционального состояния органов воспроизведения реципиентов. У телок-реципиентов с нормально развитой половой системой уровень стельности в среднем составляет 57%, в то время как при отклонениях в развитии половой системы - 20%.

При отборе потенциальных  реципиентов следует также учитывать  параметры половой цикличности. В качестве реципиентов следует  использовать телок с продолжительностью полового цикла 19-22 дня, поскольку у  животных с менее (16-18) или более (23-26дней) продолжительным циклом отмечено достоверное  снижение приживляемости зародышей на 15-20%.

Важным условием высокой  приживляемости эмбрионов является синхронность в проявлении эструса у донора и реципиента, а также своевременное и квалифицированное выявление животных в охоте. Наиболее результативным (по приживляемости эмбрионов - 58%) является синхронное проявление охоты у донора и реципиента по времени с разностью 12 часов. При этом наблюдение за поведением животных следует проводить 3 раза в сутки: утром, днем и вечером по 1 часу. Это позволяет выявить до 90-95% реципиентов в охоте.

При отборе потенциальных  реципиентов для трансплантации существенное значение имеет определение  качества желтого тела животного. Если на яичнике реципиента пальпируется желтое тело отличного качества (размер 1,0-1,5 см, выступает над поверхностью яичника, имеет грибовидную форму) или хорошего качества (размер 0,7-1,0 см, округлая или грибовидная форма), то уровень приживляемости зародышей составляет 53-57%. При удовлетворительном желтом теле (размер 0,5 см, округлая форма) уровень стельности находится в пределах 28-30%. Не рекомендуется использовать для пересадки эмбриона реципиента, на яичниках которого имеется одновременно желтое тело и фолликул до 1,0 см.

Для более объективной  оценки функциональной активности яичников и снижения эмбриональной смертности при трансплантации, наряду с диагностированием  качества желтых тел, следует проводить  определение концентрации стероидных гормонов и биохимических показателей  крови реципиентов на 6-7 день естественного  или индуцированного полового цикла.

Пересадку эмбрионов следует  проводить реципиентам, независимо от качества желтого тела, с уровнем  прогестерона в крови от 2,0 до 4,9 нг/мл. Соотношение прогестерона к эстрадиолу должно быть 1:10. В случае использования телок в качестве реципиентов с уровнем прогестерона свыше 5 нг/мл приживляемость снижается на 10-17%, а с уровнем ниже 2,0 нг/мл - на 25-30%. Содержание холестерина должно быть в пределах от 2,60-3,90 мкмоль/л, β-каротина – 12,2-17,3 мкмоль/л.

Для получения двойневых отелов в качестве реципиентов необходимо использовать полновозрастных коров после 2-4 отелов, живой массой 550-650 кг. При проявлении признаков половой охоты параллельно проводится искусственное осеменение и коров-доноров, и реципиентов. На 7-8 день после осеменения коров ректально исследуют на пригодность к использованию в качестве реципиента и, в случае наличия в яичнике желтого тела, животным пересаживают один эмбрион в контрлатеральный рог матки (т.е. в противоположный рогу, смежному с яичником, имеющему желтое тело).

После ветеринарных обработок  коров и телок для трансплантации эмбрионов их можно использовать только через 3 недели. На каждого донора следует готовить 5-6 реципиентов.

Диагностика стельности реципиентов  проводится ректальным методом спустя 2-3 месяца после эмбриопересадок.

Кормление доноров и реципиентов  должно быть биологически полноценным. Недостаточный уровень кормления, несбалансированность рациона по общей  питательности и другим жизненно важным элементам, использование кормов низкого качества ведут к нарушению обмена веществ, что оказывает отрицательное влияние на эффективность гормонального вызывания суперовуляции, качество полученных эмбрионов и их приживляемость.

4.Вызывание суперовуляции у коров-доноров.

Для вызывания суперовуляции  у крупного рогатого скота используются гонадотропные препараты (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл - ГСЖК и  фолликулостимулирующий гормон - ФСГ - гипофиза животных), для синхронизации  половых циклов - аналоги простагландина Ф2-альфа (эстрофан, магэстрофан, клопростенол, суперфан, ремофан, клатрапростин, эстуфалан и др.). Препараты ГСЖК обладают комплексной фолликулостимулирующей и лютеинизирующей активностью. Период полураспада экзогенного ГСЖК у коров составляет около 6 дней. Соотношение ФСГ и ЛГ в различных партиях неодинаковое, что сказывается на результативности суперовуляции. Стимуляция роста фолликулов препаратами ГСЖК сопровождается, как правило, увеличением массы яичников, образованием после овуляции разного числа и величины желтых тел. Из-за длительного распада ГСЖК в крови животных накапливаются повышенные концентрации гормонов. Изменение эндокринного статуса при индукции суперовуляции может оказывать неблагоприятное действие на оплодотворяемость яйцеклеток, развитие зародышей, а также на физиологическое состояние половых органов (в частности, наблюдается кистозное перерождение яичников). Для исключения длительной стимуляции роста фолликулов применяется анти-СЖК. Обработка антисывороткой в день проявления охоты нейтрализует циркулирующую в крови животных ГСЖК и тем самым прекращает дальнейшую стимуляцию роста фолликулов в яичниках. Это создает более благоприятный фон для овуляции, оплодотворяемости яйцеклеток и последующего развития зародышей. В практике используются стандартные гонадотропные препараты высокой степени очистки: сергон (Чехия), фоллигон (Голландия), прегмагон (Германия). Эти препараты инъецируют донорам на 11-12-ый день полового цикла, однократно, в дозе 50 И.Е. на 100 кг живой массы животного. Применение этих гонадотропинов обеспечивает вызывание множественной овуляции у 75-78% животных и получение в среднем 3,5-4,0 жизнеспособных эмбриона на донора.

Для вызывания суперовуляции  у коров используются также гипофизарные препараты. Основное физиологическое  действие фолликулостимулирующих гормонов заключается в стимуляции роста  и созревания фолликулов яичника, образования  фолликулярных гормонов (эстрагенов), регулирующих процесс течки. Лютеинизирующий гормон совместно с фолликулостимулирующим вызывает овуляцию и стимулирует образование желтого тела. Желтое тело само выполняет функцию гормональной железы и вырабатывает гормон прогестерон, который обеспечивает сохранение беременности. В практике используются гипофизарные препараты производства США (ФСГ-п), России (ФСГ-супер), Чехии (фолликотропин), Литвы (фоллитропин) и др.

В отличие от ГСЖК, препараты  ФСГ вводятся многократно, так как  период полураспада ФСГ очень  короткий (5-6 ч). Применение ФСГ в  сочетании с простагландинами обеспечивает получение 5-6 жизнеспособных эмбрионов  и 10-12 овуляций на донора.

Оптимальными параметрами  использования гипофизарных гонадотропинов являются: доза ФСГ-п – 40-50 мг, ФСГ-супер  – 50А.Е., фолликотропина – 480 М.Е., фоллитропина – 1200 ЕД; начало экзогенного введения 10-12-ый день полового цикла; инъекция аналога простагландина F2-α на 3-й день от начала обработки в дозе 750 мкг.

Опыт работы по вызыванию  суперовуляции у коров-доноров  сывороточными и гипофизарными  препаратами показал, что при  использовании гипофизарных гормонов (ФСГ-п, ФСГ-супер, фолликотропин, фоллитропин) получаются более стабильные и высокие результаты суперовуляции и эмбриопродукции (табл. 1). Так, процент коров-доноров, реагирующих на обработку сывороточными гонадотропинами, составил 75,0-78,3%, гипофизарными препаратами – 85,3-88,8%, число овуляций на донора – соответственно 8,3-9,7 и 10,2-12,0, количество пригодных эмбрионов – 3,5-4,0 и 5,5-6,1.

Залогом эффективного применения метода трансплантации эмбрионов в  практике племенной работы являются высокие показатели овулирующей реакции яичников коров-доноров на гонадотропные обработки и выход достаточного числа качественных эмбрионов. Высокая вариабельность и непредсказуемость как по числу вызванных овуляций, так и по количественному и качественному составу извлеченных зародышей создают трудности в планировании программы пересадок эмбрионов реципиентам и ведут к повышению затрат на трансплантацию.

В связи с этим, для  совершенствования схем индукции полиовуляции у коров-доноров требуется изыскания новых подходов к решению этой проблемы, разработки эффективных препаратов, позволяющих получать хорошие результаты по выходу эмбрионов.

В то же время использование  вышеперечисленных гонадотропинов при индукции полиовуляции не исключают образования на яичниках неовулировавших фолликулов, наличие которых может привести к нарушениям гормонального статуса доноров. С целью исключения длительной стимуляции роста фолликулов и наступления равномерной овуляции рекомендуется использовать синтетические аналоги гонадотропин рилизинг-гормона (Гн-РГ). Инъекция донору Гн-РГ (сурфагон, диригистран и др.) в день охоты способствует выделению лютеинизирующего гормона и овуляции фолликулов в фиксированное время.

Таблица 1

Результаты суперовуляции  и эмбриопродукции доноров при использовании разных гонадотропинов.

Здесь и далее: Р£ 0,05, Р£ 0,01, Р£ 0,001

Многолетний опыт нашей работы показал, что инъекция Гн-РГ в 2-3 раза снижает число неовулировавших фолликулов, повышает на 6-9% количество овуляций и на 11-19% число эмбрионов, пригодных к пересадке, в расчете на одного донора.

5.Синхронизация половых циклов доноров и реципиентов.

Синхронность проявления эструса между донором и реципиентом - важнейшее условие высокой приживляемости эмбрионов. Для синхронизации охоты используют простагландин ПГФ2-альфа или его синтетические аналоги (эстрофан, магэстрофан, ремофан, клопростенол, клатрапростин, суперфан, эстуфалан и др.).

По технологии трансплантации на каждого донора следует подготавливать не менее 5 реципиентов, причем день охоты  реципиента должен совпадать с днем первого осеменения суперовулирующего донора. В случае использования в технологии трансплантации постоянных доноров (проверенных на гормональную обработку и имевших стабильный выход качественных эмбрионов) число реципиентов можно увеличить до 10.

Перед гормональной обработкой животных исследуют ректально (определяют размеры и форму яичников, наличие  и выраженность желтого тела). Лютеиновая фаза цикла соответствует оптимальному времени для инъекции препаратов. Простагландины вводят внутримышечно  в дозах, указанных в наставлениях по их применению. Как правило, животные приходят в охоту через 48-72 часа после  инъекции препарата. Не пришедших в  охоту животных обрабатывают повторно через 10-11 дней с момента первого  введения ПГФ2-альфа. Двукратное введение препарата (в любую фазу полового цикла) с 10-ти дневным интервалом эффективно использовать на большом поголовье  доноров и реципиентов, так как  это способствует увеличению числа животных, проявивших признаки половой охоты, и снижает трудоемкость операций обслуживающего персонала.

Эффективен способ синхронизации  эструса у доноров и реципиентов  путем комплексного использования  в лютеиновой фазе полового цикла  инъекций гонадотропина с простагландином  Ф2 и гонадотропин рилизинг-гормоном. Животных, имеющих хорошо выраженное желтое тело, обрабатывают ФСГ-супер в общей дозе 10 Арм.ед. для телок и 15 Арм.ед. для коров двукратно по 5-7,5 Арм.ед. через 12 часов, на следующий день однократно инъецируют эстрофан по 500 мкг, а через 60 часов от момента введения эстрофана дополнительно сурфагон по 25 мкг. Половая охота у животных проявляется на 2-3 сутки после введения простагландина.

Следует учитывать, что данные обработки осуществляются не параллельно: доноров обрабатывают за 15 дней до начала стимулирования суперовуляции, а реципиентов  – на второй день после начала стимулирования суперовуляции у доноров.

Исследованиями установлено  (табл. 2), что комплексное использование гормональных препаратов ФСГ, ПГФ2альфа Гн-РГ для синхронизации эструса у самок крупного рогатого скота существенно повышает эффективность работ по трансплантации. Из 50 телок, обработанных в опыте, клинически выраженную охоту проявили 88% животных, что на 11,4% больше, чем в контроле, а число реципиентов, пригодных для эмбриотрансплантации, и приживляемость пересаженных зародышей увеличилась соответственно на 15,0 и 12,2%.

Аналогичная закономерность наблюдалась по группе коров-доноров. Количество животных, пригодных для  использования в качестве доноров, увеличилось на 15,5, а число коров, положительно реагирующих полиовуляцией, на – 14,8%. В опытной группе по сравнению с контрольной повысился выход полноценных эмбрионов от донора на 24% (Р£ 0,05), а выход зародышей, пригодных для пересадки, от общего числа извлеченных зародышей –14,7%.

Таблица 2

Эффективность способов подготовки животных для эмбриотрансплантации.

Таким образом, комплексное  использование гормональных препаратов для синхронизации эструса самок  крупного рогатого скота позволяет  повысить количество телок-реципиентов  и коров-доноров, пригодных для  эмбриотрансплантации, соответственно на 15 и 15,5%, уровень приживляемости зародышей – на 12,2%, выход полноценных эмбрионов от числа извлеченных – на 14,7%.

6.Искусственное осеменение коров-доноров.

Эффективность искусственного осеменения коров-доноров в суперовулирующую охоту во многом зависит от правильности выбора оптимального времени для осеменения коров с учетом таких особенностей эструса, как проявление течки, ее интенсивность и длительность, общая реакция возбуждения, охоты и овуляции, качество используемой спермы быков-производителей, а также строгого соблюдения ветеринарно-санитарных требований при выполнении работ.

Течка у коров характеризуется  набуханием и покраснением слизистых  преддверия влагалища и шейки  матки, выделением слизи из половых  органов. Длительность течки составляет от 2 до 6 суток. Через 24-36 часов после  начала течки наступает общее  возбуждение, животное теряет аппетит, снижает удой, становится беспокойным, прыгает на других животных. Через 6-12 часов, после того как у коровы появились признаки возбуждения, наступает  охота, которая продолжается 12-18 часов.

У мясного скота продолжительность  течки колеблется в пределах от 21 до 44 часов, охота длится от 7 до 12 часов, овуляция наступает через 20-25 часов  от начала и 10-15 часов после окончания  охоты.

Выявление животных в охоте  проводят не реже трех раз в день при активных прогулках или пастьбе. В суперовулирующий цикл 60-70% коров приходит в охоту утром, 10% - в полдень и 20-30% вечером. Продолжительность каждого наблюдения составляет 1-2 часа. Охоту считают установленной, если корова не менее двух раз подряд проявила рефлекс неподвижности.

При осеменении необходимо учитывать тот факт, что овуляция наступает через 10-15 часов после  окончания охоты, а яйцеклетки при  выходе из фолликулов в рог матки  способны сохранять жизнеспособность только в течение 5-6 часов, поэтому  осеменять коров следует перед  овуляцией, как можно ближе к  ее началу.

Сроки осеменения коров можно  определить и ректально. За 6-12 часов  до овуляции в яичнике присутствует зрелый фолликул, представляющий собой  пузырек размером 1,5-1,8 см, при осторожном надавливании на который ощущается зыбление.

Осеменение доноров осуществляют ректоцервикальным способом, позволяющим  контролировать состояние половых  органов самки, дважды в день двойной  дозой спермы в тело матки с  применением стерильных инструментов одноразового пользования. В каждой дозе должно быть не менее 30 млн. подвижных  спермиев. Первое осеменение проводят после установления охоты, второе - через 10-12 часов. При необходимости (длительная охота) осеменение повторяют 3-4 раза. Используется только сперма с  высокой оплодотворяющей способностью и хорошего качества. Иногда для  повышения результативности осеменения используется семя двух быков. Достоверно не известны причины этого. Однако существует мнение, что происходит отбор наиболее жизнеспособных мужских гамет, обладающих высокой оплодотворяющей способностью.