Раздел I. Теоретическая  часть

    1.1. Явление люминесценции. Общее описание.

    Люминесценция - излучение, которое является избытком над тепловым излучением тела и продолжается в течение времени, значительно превышающего период световых колебаний. Первая часть определения отделяет люминесценцию от теплового равновесного излучения и показывает, что понятие люминесценция применяется только к совокупности атомов (молекул), находящиеся в состоянии, близком к равновесному, так как при сильном отклонении от равновесного состояния говорить о тепловом излучении или люминесценции не имеет смысла. Тепловое излучение в видимой области спектра заметно только при температуре тела в несколько сотен или тысяч градусов, тогда как люминесцировать оно может при любой температуре. Люминесценцию поэтому часто называется холодным свечением. [1]

    Вторая  часть определения (признак длительности) была введена, чтобы отделить люминесценцию  от различных видов рассеяния  света, отражения света, параметрического преобразования света, тормозного излучения. От различных видов рассеяния люминесценция отличается тем, что при люминесценции между поглощением и испусканием происходят промежуточные процессы, длительность которых больше периода световой волны. В результате этого при люминесценции теряется корреляция между фазами колебаний поглощенного и излучаемого света.

    Первичное понятие люминесценция относилось только к излучению видимого света, в настоящее время оно применяется и к излучению в ближнем ультрафиолетовом и инфракрасном диапазонах.

    Люминесценцию можно классифицировать по типу возбуждения, механизму преобразования энергии, временным характеристикам свечения. По виду возбуждения различают фотолюминесценцию (возбуждение светом); радиолюминесценцию (возбуждение проникающей радиацией), частными случаями которой являются рентгенолюминесценция (возбуждение рентгеновскими лучами), катодолюминесценцию (возбуждение электронным пучком), ионолюминесценцию (возбуждение ускоренными ионами), альфа-люминесценцию (возбуждение альфа-частицами) и так далее; электролюминесценцию (возбуждение электрическим полем); триболюминесценцию (возбуждение механическими деформациями); хемилюминесценцию (возбуждение в результате химических реакций); кандолюминесценцию (возбуждение при рекомбинации радикалов на поверхности).

    По  длительности свечения различают флуоресценцию (быстро затухающая люминесценция) и фосфоресценцию (длительная люминесценция). Деление это условное, поскольку нельзя указать строго определенной временной границы: она зависит от временного разрешения регистрирующих приборов.

    По  механизму элементарных процессов  различают резонансную, спонтанную, вынужденную и рекомбинационную люминесценции. Элементарный акт люминесценции состоит из поглощения энергии с переходом атома (молекулы) из основного состояния (рис. 1) в возбужденное состояние, без излучаемого перехода на уровень и излучательного перехода в основное состояние.[4]

Рис.1.Схема квантовых переходов при элементарном процессе люминесценции: 1 — основной энергетический уровень; 2 — уровень излучения; 3 — уровень возбуждения. Переход 3—1,  соответствует резонансной люминесценции, переход 2—1 — спонтанной люминесценции.

      В отдельном случае излучение  люминесценция может происходить  при переходе атома (молекулы) с уровня 3 на уровень 1. В этом  случае люминесценцию называют  резонансной. Резонансная люминесценция наблюдается чаще всего в атомных парах (Hg, Cd, Na и других), в некоторых простых молекулах, примесных кристаллах.

      В большинстве случаев вероятность  перехода атома (молекулы) с уровня 3 на уровень 2 больше вероятности  прямого перехода на основной  уровень 1. Уровень 2 чаще всего  лежит ниже уровня поглощения 3, поэтому часть энергии теряется  на тепло (возбуждаются колебания  атомов) и квант света люминесценции имеет меньшую энергию (и большую длину волны), чем кванты возбуждающего света. Однако возможно наблюдение антистоксовой люминесценции. В этом случае за счет поглощения колебательной энергии молекула переходит на более высокий относительно уровня 3 излучающий уровень 2; энергия выпущенного кванта при антистоксовой люминесценции больше энергии возбуждающего кванта, ее интенсивность мала.

      Уровень излучения может принадлежать как тому же атому (молекуле), который поглотил энергию возбуждения (в таком случае атом называется центром свечения, а переход внутрицентровым), так и другим атомам. В простейшем случае, когда энергия возбуждения остается в том же атоме, люминесценция называется спонтанной. Этот вид люминесценции характерен для атомов и молекул в парах и растворах и для примесных атомов в кристаллах. В некоторых случаях атом (молекула), прежде чем перейти на уровень излучения (рис. 2), оказывается на промежуточном метастабильном уровне и для перехода на уровень излучения ему необходимо сообщить дополнительную энергию, например энергию теплового движения или инфракрасного света люминесценция, возникающую при таких процессах, называется метастабильная (стимулирующая).[1]

Рис.2. Схема квантовых переходов при метастабильной (стимулированной) люминесценции. Для перехода с метастабильного уровня 4 на излучающий уровень 2 атом должен поглотить дополнительную энергию; 1 — основной уровень; 3 — уровень возбуждения.

    Процесс люминесценции в различных веществах  отличается в основном механизмом перехода частицы с уровня поглощения  на уровень излучения. Передача энергии  других атомов (молекул) осуществляется электронами при электронно-ионных ударах и при процессах ионизации  и рекомбинации.          Из-за малой концентрации атомов в газах процессы резонансной и обменной передачи энергии играют малую роль. Они становятся существенными в конденсированных средах. В них энергия возбуждения может передаваться также с помощью колебаний ядер. И, наконец, в кристаллах определяющей становится передача энергии с помощью электронов проводимости, дырок и электронно-порученных пар. Если заключительным актом передачи энергии является рекомбинация, то сопровождающая этот процесс люминесценции, называется рекомбинационным.[2]

      Способность к люминесценции  обнаруживают различные вещества. Чтобы вещество было способно люминесцировать, его спектры должны носить дискретный характер, то есть его уровни должны быть разделены зонами запрещенных энергий. Поэтому металлы в твердой и жидкой фазе, обладающие непрерывным энергетическим спектром, не дают люминесценцию: энергия возбуждения в металлах непрерывным образом переходит в тепло.

      Вторым необходимым условием  люминесценции является превышение  вероятности излучательных переходов над вероятностью безызлучательных. Повышение вероятности безызлучательных переходов влечет тушение люминесценции. Вероятность безызлучательных переходов зависит от многих факторов, например, возрастает при повышении температуры (температурное тушение), концентрации люминесцирующих молекул (концентрационные тушения) или примесей (примесное тушения). Такое тушение люминесценции связано с передачей энергии возбуждения молекул тушителя или ее потерей при взаимодействии люминесцирующих молекул между собой и с тепловыми колебаниями среды. Следовательно, способность к люминесценции зависит как от природы люминесцирующего вещества и его фазового состояния, так и от внешних условий. При низком давлении люминесцирует пары металлов и благородные газы.

      Яркость люминесцентных кристаллов  зависит от наличия в них  примесей (так называемых активаторов), энергетические уровни которых  могут служить уровнями поглощения, промежуточными или излучающими уровнями. Роль этих уровней могут выполнять также энергетические зоны (валентная и проводимости). Кристаллы, обладающие люминесценцией, называются кристалофосфорамы.

      В кристалофосфорах возбуждения светом, электрическим током или пучком частиц создает свободные электроны, дырки и експтоны (рис. 3).

    Рис.3.Схема энергетических переходов при люминесценции кристаллофосфоров: 1 — валентная зона, 3 — зона проводимости. Переход 1—3 соответствует поглощению энергии, переходы 3—4 и 4—3 — захвату и освобождению электрона метастабильным уровнем (ловушкой 4). Переход (а) соответствует межзонной люминесценции, (б) — люминесценции центра, (в) — экситонной люминесценции (2 — уровень энергии экситона).

    Электроны могут мигрировать по решётке, оседая на ловушках. Люминесценция, происходящая при рекомбинации свободных электронов с дырками, называется межзонной. Если рекомбинирует электрон с дыркой, захваченной центром свечения, происходит люминесценция центра. Рекомбинация экситонов даёт экситонную люминесценцию. Спектр люминесценции кристаллофосфоров состоит из межзонной, экситонной и примесной полос. 

      Основные физические характеристики  люминесценции: способ возбуждения  (для фотолюминесценции — спектр  возбуждения); спектр излучения;  состояние поляризации излучения;  выход излучения, то есть отношение  поглощённой энергии к излученной (для фотолюминесценции вводится  понятие квантового выхода люминесценцию  — отношения числа излученных  квантов к числу поглощённых). Поляризация люминесценции связана  с ориентацией и мультипольностью излучающих и поглощающих атомных систем.[4]  

      Кинетика люминесценции, то есть  зависимость свечения от времени,  интенсивности излучения, от интенсивности  возбуждения, а также зависимость  люминесценции от различных факторов служит важной характеристикой люминесценции. Кинетика люминесценции в сильной степени зависит от элементарного процесса. Кинетика затухания резонансной люминесценции при малой плотности возбуждения и малой концентрации возбуждённых атомов носит экспоненциальный характер:

      I = l₀ е^-t/t, (1)

    где I- интенсивность излучения;

    l₀ – интенсивность возбуждения;

  t - характеризует время жизни на уровне возбуждения и равно обратной величине вероятности спонтанного перехода в единицу времени;

      t — длительность свечения.

      При большой плотности возбуждения  наблюдается отклонение от экспоненциального  закона затухания, вызванное процессами  вынужденного излучения. Квантовый выход резонансной люминесценции обычно близок к единице. Кинетика затухания спонтанной люминесценции также обычно носит экспоненциальный характер. Кинетика рекомбинационной люминесценции сложна и определяется вероятностями рекомбинации, захвата и освобождения электронов ловушками, зависящими от температуры. Наиболее часто встречается гиперболический закон затухания:

      I = I₀ / (1 + pt)^a , (2)

    где I- интенсивность излучения;

    р - постоянная величина;

    a - обычно принимает значение от 1 до 2.

    Время затухания люминесценции изменяется в широких пределах -                 от 10^-8 сек до нескольких часов. Если происходят процессы тушения, то сокращаются выход люминесценции и время её затухания. Исследование кинетики тушения люминесценции даёт важные сведения о процессах взаимодействия молекул и миграции энергии. 

      Изучение спектра, кинетики и  поляризации излучения люминесценции позволяет исследовать спектр энергетического состояния вещества, пространственную структуру молекул, процессы миграции энергии. Для исследования люминесценции применяются приборы, регистрирующие свечение и его распределение по спектру, — спектрофотометры. Для измерения времён затухания применяются тауметры и флуорометры. Люминесцентные методы являются одними из наиболее важных в физике твёрдого тела. Люминесценция некоторых веществ лежит в основе действия лазеров. Люминесценция ряда биологических объектов позволила получить информацию о процессах, происходящих в клетках на молекулярном уровне. Для исследования кристаллофосфоров весьма плодотворно параллельное изучение их люминесценции и проводимости. Широкое исследование люминесценции обусловлено также важностью её практических применений. Яркость люминесценции и её высокий энергетический выход позволили создать люминесцентные источники света с высоким кпд, основанные на электролюминесценции и фотолюминесценции. Яркая люминесценция ряда веществ обусловила развитие метода обнаружения малых количеств примесей, сортировки веществ по их люминесцентным признакам и изучение смесей. Катодолюминесценция лежит в основе свечения экранов электронных приборов (осциллографов, телевизоров, локаторов и так далее), в рентгеноскопии используется рентгенолюминесценция. Для ядерной физики очень важным оказалось использование радиолюминесценции.[4]

    1.2. Молоко натуральное коровье. Технические требования

      Молоко  натуральное коровье – молоко без извлечений и добавок молочных и немолочных компонентов, подвергнутое первичной обработке, очистке от механических примесей и охлаждению до температуры (42)^оС после дойки и предназначенное для дальнейшей переработки.

      Молоко, в зависимости от микробиологических, органолептических и физико-химических показателей, подразделяют на сорта: высший, первый, второй и несортовое.

Молоко  получают от здоровых животных в хозяйствах, благополучных по инфекционным болезням, и по качеству должно соответствовать                 ГОСТ Р 52054-2003 и нормативным документам, регламентирующим требования к качеству и безопасности пищевых продуктов.

        По органолептическим показателям молоко должно соответствовать требованиям, указанным в таблице 1.[6] 

Т а  б л и ц а 1

      По  физико-химическим показателям молоко должно соответствовать нормам, указанным  в таблице 2.[6] 

Т а  б л и ц а 2

      Содержание  токсичных элементов, афлатоксина М₁, антибиотиков, ингибирующих веществ, радионуклидов, пестицидов, патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонелл, количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и соматических клеток в молоке должно соответствовать действующим санитарным нормам.

      Молоко, предназначенное для изготовления продуктов детского и диетического питания, должно соответствовать требованиям  высшего сорта и по термоустойчивости должно быть не ниже II группы.

      Базисная  норма массовой доли жира молока – 3,4%,базисная норма массовой доли белка  – 3,0%. Молоко после дойки должно быть профильтровано (очищено). Охлаждение молока проводят в хозяйствах не позднее 2 ч после дойки до температуры (42)^оС. 
 
 
 
 
 
 
 

1.3. Люминисцентный анализ. Количественный и качественный анализ. Виды люминесцентного анализа.

    Люминесцентный  анализ (Л.а.) - метод исследования различных объектов, основанный на наблюдении их люминесценции. При Л.а. наблюдают либо собственное свечение исследуемых объектов или свечение специальных люминофоров, которыми обрабатывают исследуемый объект. Аппаратура, которая применяется для Л. а, содержит источник возбуждения люминесценции и регистрирующее устройство. Чаще всего нарушают фотолюминесценцию объекта, однако в некоторых случаях наблюдают катодолюминесценцию, радиолюминесценцию и хемилюминесценции. Фотовозбуждение обычно проводится кварцевыми ртутными лампами, причем с помощью светофильтров с их спектра обычно вырезается ультрафиолетовая часть. Кроме ртутных ламп, как источник света в Л.а. применяют ксеноновые лампы, искры в воздухе, лазеры. Регистрация люминесценции обычно осуществляется визуально или с помощью фотоэлектронный приборов, которые повышают точность Л.а.[3] 

    При количественном и качественном химическом Л.а. регистрируется чаще самостоятельное свечение веществ. С помощью количественного химического Л. а. по интенсивности света люминесценции определяют концентрацию люминесцирующего вещества (при малых оптических толщине его и концентрациях, меньших 10^-4-10^-5г/см³). Чувствительность количественного Л.а. очень большая и достигает нескольких единиц на             10^-10 г/см³ при выявлении ряда органических веществ. Это позволяет использовать Л. а. для контроля чистоты веществ.

    Качественный  химический Л.а. позволяет выявлять и идентифицировать некоторые вещества в смесях. В этом случае с помощью спектрофотометров изучают распределение энергии в спектре люминесценции веществ при низких температурах и в вязких растворах. Некоторые нелюминесцирующие вещества проявляются по люминесценции продуктов их взаимодействия со специально добавлеными веществами.

    Сортовой  Л.а. позволяет по характеру люминесценции выявлять различие между предметами, которые кажутся одинаковыми. Он применяется для диагностики заболеваний, для определения пораженности семян и растений болезнями, определение содержания органических веществ в почве. С помощью сортового Л.а. проводят анализ горных пород для обнаружения нефти и газов, изучают состав нефти, минералов, горных пород, сортируют алмазы и т.д. Используя свойство алмазов люминесцировать под действием мягких рентгеновских лучей, строят автоматические системы их отбора. В сортовом Л.а. часто рассматривают несобственное свечение объектов. При поиске некоторых химических элементов образцы породы обрабатывают специальными составами, которые создают с искомыми веществами люминесцирующие комплексы. Иногда исследуемый объект, не обладающий собственной люминесценцией, подвергают предварительной обработке, которая заключается в добавлении специального люминофора. При этом люминофор или растворяется в исследуемой жидкости, или адсорбируется на поверхности исследуемого объекта.[2]

    Хемилюминесцентний анализ - совокупность методов количественного (реже качественного) определения химических элементов и соединений, основанных на влиянии анализируемого вещества на интенсивность (спектр) хемилюминесценции. Регистрация последней осуществляется визуально, фотоэлектрическим или фотографическим методом. При анализе растворов используется обычно хемилюминесцентная реакция некоторых органических веществ, например окисление люминола, люцигенина или силоксена; определяющее вещество усиливает или ослабляет хемилюминесценцию. Так, например, определяют перекись водорода, спирты, производные анилина, некоторые ядовитые вещества нервно-паралитического действия, глюкоза, следовые количества Co, Cu, Fe, Cr, As. Хемилюминесцентний анализ используется также для определения в воздухе озона, окислов азота и серы.[4]

    Флуоресцентный  анализ основан на образовании люминесцирующих комплексных соединений элементов с органическими веществами. Данный метод мало селективный, большинство реагентов являются групповыми реагентами, только люмогаллион является специфичным для выявления галлия и люмомагнезона - для выявления магния для увеличения селективности используют экстракционно-флуоресцентный анализ- предварительное разделение анализируемой смеси методом экстракции а также осаждение растворов и охлаждение растворов до температур жидкого азота и гелия.[4]

    Фосфоресцирующих  анализ - это метод анализа, который обладает высокой селективностью, поскольку лишь некоторые катионы образуют с органическими реагентами фосфоресцирующий комплексы. Для регистрации спектров и интенсивности фосфоресценции используют фосфороскоп, при этом флуоресценция не регистрируется.

    Люминесцентный  анализ органических соединений затруднен, поскольку их спектры люминесценции, как правило, не специфичны. Однако предложенные методы количественного  обнаружения порфиринов, витаминов, антибиотиков и хлорофилла в растворах. Ароматические соединения в замороженных растворах углеводородов при температуре 77 К дают характерные для каждого вещества спектры люминесценции. Поэтому данный метод используют для обнаружения и количественного определения поле циклических ароматических соединений в экстрактах растений почв, продуктов питания.[4]

    Л.а. находит применение также в криминалистике (для определения подлинности документов, выявление следов токсических веществ и т.п.), реставрационных работах, дефектоскопии. Л.а. находит применение в гигиене (определение качества некоторых продуктов, питьевой воды) и промышленно-санитарной химии (определение содержания вредных веществ в воздухе) и т.п. Способность некоторых веществ люминесцировать под действием элементарных частиц высоких энергий обеспечило широкое применение методов Л.а. в ядерной физике.

    Преимуществом люминесцентного химического анализа  по сравнению с другими физико-химическими  методами является его высокая чувствительность. С помощью люминесцентного анализа  можно определить до миллионной доли процента вещества. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Раздел II. Экспериментальная  часть.

     Прибор для люминесцентного анализа.

    Аппаратура  для люминесцентных исследований должна быть портативной, удобной, должна обеспечивать проведение диагностических наблюдений в любых условиях, иметь оптико-светотехническую систему для концентрации излучения  на определенную участок.

    Основными узлами аппаратуры для люминесцентного  анализа являются осветитель со светофильтрами, кюветы, диафрагмы и устройство для  измерения интенсивности свечения. Лампой для люминесцентного анализа, как правило, используют ртутные  лампы. Приемником выступает фотоэлемент  или фото умножитель. Принципиальная схема лабораторного флуориметра ЕФ-ЗМ,  показана на рис. 4.[1]

Рис. 4. Схема лабораторного флуориметра ЕФ-3М.

1- кварцевая  лампа; 2- диафрагма; 3-заслонка; 4-фильтр; 5-кварцевая оптика; 6-сосуд с исследуемым  раствором; 7-кварцевая оптика; 8-светофильтры;

9- фотоэлементы.

    Свет  от кварцевой лампы, проходя через  диафрагму, светофильтр и кварцевую  оптику, попадает на сосуд с исследуемым  раствором. Люминесцентное свечение исследуемого раствора проходит через кварцевую  оптику, вторичные светофильтры, попадает на фотоэлемент. Фотоэлемент, превращая световую энергию в электрическую, подает ее на электронный усилитель, в анодную цепь которому подключен микроамперметра. Показания микроамперметра прямо пропорциональны концентрации люминесцирующего вещества.

Раздел III. Практическая часть.

    3.1.Методика определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в коровьем молоке

       Метод основан на: