Освоение методики исследования кинетики реакции N-ацилирования α-аминокислот сложным эфиром в водно-органическом растворителе

Министерство  образования и науки Российской Федерации

ФГБОУ ВПО Ивановский государственный  университет

Биолого-химический факультет

Кафедра неорганической и  аналитической химии

КУРСОВАЯ РАБОТА

На тему:  Освоение методики исследования кинетики реакции

 N-ацилирования α-аминокислот сложным эфиром

 в водно-органическом растворителе

Выполнила студентка 4 курса

Биолого-химического  факультета

 Киселёва  Н.А.     ___________________________________      

 Научный  руководитель     к.х.н., доц. Дорофеева Ю.С.  

 Зав. кафедрой                                                        д.х.н., проф. Сырбу С.А.

Иваново 2013г

Содержание

Введение…………………………………………………………………….…3

1. Обзор литературы ………………………………………………………..5

1.1. Влияние строения  аминосоединений на скорость реакции……….…...5

1.2. Влияние растворителя на кинетику ацилирования   аминосоединений…………………………………………………………….16      

1.3. О механизме реакции ацилирования аминокислот…….……………...24

     II.  Экспериментальная часть………………………...…………………..32

     2.1. Очистка реагентов и растворителей…………………………………....32

2.2. Спектрофотометрический  метод определения констант скорости  реакции N-ацилирования  α-аминокислот сложными фениловыми эфирами в водно-органических средах……………………………………..34

2.3. Приготовление  рабочих растворов……………………………………..37

2.4. Методика  кинетических измерений N-ацилирования  α-аминокислот       сложными фениловыми эфирами в водно-органических средах………....38

2.5. Методика  обработки кинетических измерений……………..…………40

2.6. Расчет активационных параметров…………………………………......41

Выводы……..………………………………………………………………...42

Список  литературы…………………………………………………………43

Введение

В настоящее  время наблюдается интерес к  процессам, протекающим в природе. Большинство реакций, протекающих  в организме идут с участием α-аминокислот. В живых организмах аминокислоты выполняют множество функций: являются структурными элементами пептидов и белков, переносчиками сигналов; производные аминокислот входят в состав коферментов, желчных кислот, антибиотиков [1]. Многие аминокислоты принимают участие в обмене веществ, например, служат донорами азота.

Некоторые из аминокислот  не могут синтезироваться в организме  человека и должны поступать вместе с пищей. Это незаменимые аминокислоты (валин, лейцин, изолейцин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин, лизин). Избирательность их действия указывает на то, что подбирая соответствующим образом аминокислотные производные по длине углеводородной цепи, структуре заместителей и учитывая природу среды, можно регулировать характер и интенсивность воздействия этих веществ на свойства различных систем.

Наличие в молекулах  α-аминокислот двух функциональных групп, способных к кислотно-основному  взаимодействию, влияет на кинетику реакций  с их участием. Кинетические исследования α-аминокислот в бинарных водно-органических растворителях имеют важное значение при объяснении механизмов протекания реакций в биологических системах, при выборе оптимальных условий для синтеза различных веществ в реакциях ацильного переноса.

Изучение природы  взаимодействий в растворах биомолекул и их модельных соединений является актуальной задачей, так как особенности сольватации простых структурных элементов (аминокислот и пептидов) во многом определяют сольватацию и биологическую активность более сложных биосистем. Органические растворители (ацетон, спирты и др.), используемые в работе, присутствуют в той или иной мере в живых организмах и могут существенно изменять свойства растворов белковых молекул.

Цель данной работы заключается в освоении методики изучения кинетики  реакции  N – ацилирования a-аминокислоты сложным эфиром в водно-органическом растворителе.  Исходя из поставленной цели, были определены задачи работы:

• Произвести обзор литературы по изучению кинетики реакции N-ацилирования α-аминокислот сложным эфиром в водно-органических растворителях.
• Освоить методику исследования кинетики реакции N-ацилирования a-аминокислот сложным эфиром в водно-органических растворителях спектрофотометрическим методом, а также познакомиться с методами очистки реагентов, методикой приготовления  рабочих растворов заданной концентрации.

I. Обзор литературы

1.1. Влияние строения  аминосоединений на скорость  реакции

Все a-аминокислоты можно рассматривать как производные аминоуксусной кислоты, в которой водород при a-углеродном атоме замещен на заместитель (R), который может иметь различное строение [2].

a-Аминокислоты являются амфотерными веществами, имеющими как основную (-NH₂), так и кислотную (-СООН) группы. В сильно кислых растворах протонируется и карбоксильная, и аминогруппы, и аминокислоты существуют в виде катионов. В сильно щелочных средах аминокислоты заряжены отрицательно в результате депротонирования (СООН-) и (NH₂-) групп, и существуют в виде анионов. В растворах, аминокислоты могут присутствовать в четырех формах, находящихся в равновесии, как показано в уравнении (1.1.1) [3-4]:

где (I) и (IV) – катионная и анионная формы аминокислоты;

      (II) и (III) – незаряженная и цвиттерионная соответственно.

Однако a-аминокислоты не являются обычными амфолитами, поскольку при промежуточных значениях рН обе функциональные группы у большинства молекул полностью ионизированы, т.е. a-аминокислоты при рН=6¸7 находятся в основном в цвиттерионной форме (III) [5].

Ацилирование  α-аминокислот ангидридами, хлорангидридами  и сложными эфирами карбоновых кислот относится к реакциям нуклеофильного замещения у карбонильного атома  углерода, которые в общем виде могут быть выражены уравнением (1.1.2): 

(1.1.2)   

 где R₁, R₂ -  атом или группы атомов, связанные функциональными группами реагентов, принимающие участие в реакции. X – уходящая группа, S – растворитель, T – температура.

В ходе протекания реакции образуется амидная связь  (N-C) и разрываются связи (N-H) в амине и (C-X) в ацилирующем агенте.

Данный тип  реакции, с образованием амидной связи (N-C), лежит в основе синтеза термостойких полиамидов, органических красителей, лекарственных препаратов и биологически активных веществ. В частности, реакция взаимодействия ариламинов с ангидридами карбоновых кислот может служить моделью первой стадии синтеза полиимидов, которые благодаря высокой прочности, термостойкости, избирательной растворимости в органических растворителях и другим ценным эксплуатационным свойствам находят широкое применение в автомобилестроении, строительстве, электротехнике и других областях.

Кинетические  закономерности образования амидной  связи в реакции ароматических аминов с хлорангидридами карбоновых кислот систематически начали изучаться с 1934 года в работах Гиншельвуда с сотрудниками [6-8]. Было исследовано влияние природы некоторых растворителей (гексана, четыреххлористого углерода, ацетонитрила и нитробензола) на скорость реакции анилина с бензоилхлоридом, влияние заместителей в моно- и дизамещенных анилинах на их реакционную способность. Впервые было показано, что энтропия активации изученных реакций практически не зависит от природы заместителей в амине. В последующие годы  существенный вклад в изучение кинетики реакции ацилирования аминосоединений был внесен трудами Литвиненко Л.М., Олейника Н.М., Попова А.Ф., Савеловой В.А. и других авторов Донецкой школы ученых   [9,11-15], а также работами Воробьева Н.К. и Курицына Л.В. с соавторами [16-18,36, 44].

Основными факторами, определяющими скорость реакций, протекающих  в растворах, являются структура  реагентов, природа среды, в которой  протекает реакция, и температура, поэтому необходимо оставаться на особенностях влияния указанных факторов на кинетику реакции ацилирования аминосоединений в водно-органических растворителях.

Скорость реакции  ацилирования аминосоединений производными карбоновых кислот сильно зависит от строения аминосоединения. Следует  отметить, что основным фактором, определяющим реакционную способность аминов, является их основность. С ростом основности амина растет и его реакционная способность. Основность алифатических аминов больше основности, например, анилина на пять порядков. Приблизительно на пять порядков больше и константа скорости ацилирования алифатических аминов одним и тем же ацилирующим агентом в одном и том же растворителе [36].

Рядом авторов [20,22,23] показано, что скорость реакции  монозамещенных анилинов с хлорангидридами и ангидридами карбоновых кислот увеличивается с ростом основности (pK_a) аминов независимо от природы растворителя.

В литературе имеется  незначительное количество работ, посвященных  непосредственно проблемам N-ацилирования α-аминокислот. Это на наш взгляд, связано с некоторыми экспериментальными трудностями. Изучению реакции N-ацилирования α-аминокислот препятствует практически полная нерастворимость α-аминокислот в большинстве органических растворителей, высокие скорости ацилирования аминогруппы, связанной с алифатическим радикалом, а также высокая скорость гидролиза ацилирующих агентов при проведении в воде и водно-органических средах при pH>9.

Ранее была изучена  реакция N-ацилирования α-аминокислот N-ацетилоксисукцинимидом в воде. Полученные авторами [34] значения констант скорости приводятся в таблице (1.1.1):

Таблица 1.1.1                                                                          

Константы скорости реакции с N-ацетилоксисукцинимидом

в воде  при pH=pK_a – 1; 298К

Кинетика данной реакции изучалась при pH = pK_a - 1, где K_a - константа диссоциации исследуемой кислоты.

Авторами данных исследований установлено существование  линейной зависимости между lgk и pH с угловым коэффициентом - (-1,0). Показано, что lgk коррелирует с основностью аминокислоты. Угловой коэффициент этой зависимости - (0,7). На основании полученных результатов авторы [35] сделали вывод о механизме реакции, который включает нуклеофильную атаку свободной аминогруппы на карбонильный углерод. Следует отметить, что в данной работе определены эффективные константы скорости, т.к. не учитывалось кислотно-основное взаимодействие α-аминокислот. Эксперимент проводился при pH=pK_a - 1. Полученные значения k отражают соотношение констант скорости ацилирования различных α-аминокислот.            

         Авторами работ [25-32] были выполнены исследования реакционной способности ряда a-аминокислот и дипептидов в растворителе вода-диоксан (DL-a-аланина, L-валина, DL-валина, DL-лейцина и др.). Показано, что ионные равновесия a-аминокислот оказывают сильное влияние на скорость их ацилирования, являясь своеобразными «чувствительными регуляторами» процесса. Показано, что с увеличением содержания воды в водно-диоксановом растворителе эффективная константа скорости ацилирования

a-аминокислот бензоилхлоридом растет, а константа скорости ацилирования анионных форм a-аминокислот, наоборот, уменьшается. Авторами также показано, что a-аминокислоты не катализируют гидролиз бензоилхлорида в водно-диоксановой среде, что позволяет получать надежные кинетические данные N-ацилирования a-аминокислот. В работе [35] из данных кинетических исследований ряда a-аминокислот бензоилхлоридом в водном диоксане авторами даются следующие выводы:

- кислотно-основное равновесие  в растворе a-аминокислот оказывает существенное влияние на скорость N-ацилирования. (При рН = 6,5 константа N-ацилирования меньше константы скорости реакции » в 10⁴ раз. Увеличение эффективной энергии активации Е₁ по сравнению с энергией активации Е_а повышает чувствительность скорости реакции к изменению температуры и замедляет процесс N-ацилирования a-аминокислот);

- непротонированная аминогруппа a-аминокислот обладает высокой реакционной способностью, сравнимой с реакционной способностью алифатических аминов;

-  константа скорости изученных дипептидов существенно меньше констант скоростей соответствующих a-аминокислот, что можно объяснить меньшей основностью дипептидов и существованием конформаций, способных к образованию внутримолекулярных ионных пар.

В работе [35] так же показано, что при переходе от L-аспарагина (рК_а = 9,91) к L-пролину (рК_а = 11,59) в растворителе вода (39,2 масс. %) – диоксан при 25°С константа скорости ацилирования увеличивается в 150 раз. Отмечено также, что между логарифмами констант скорости N-ацилирования a-аминокислот и значениями рК_а в водном диоксане имеется линейная зависимость. Отклонение от линейности DL-a-аланина обусловлено, по мнению авторов, стерическими препятствиями, создаваемыми метильной группой при N-ацилировании. В случае L-пролина, аминогруппа которого входит в гетероцикл и является вторичной аминогруппой, отклонения от линейности указывают на то, что, кроме основности L-пролина, на скорость реакции оказывают влияние и другие факторы (специфическая сольватация, электронные взаимодействия в переходном состоянии и др.). Эта закономерность справедлива и при N-ацилировании α-аминокислот сложными эфирами.

В работе [37] была предпринята попытка установить взаимосвязь констант скорости реакции N-ацилирования изучаемых α-аминокислот 2,4-динитрофениловым эфиром бензойной кислоты в растворителе вода-2-пропанол от pK_a этих же α-аминокислот в воде и растворителе: вода (0,76 м.д.) - 2-пропанол. Экспериментальные данные, получены для реакции 2,4 - динитрофенилового эфира бензойной кислоты с α-аминокислотами, представленные в таблице (1.1.2) сопоставлены со справочными данными о константах диссоциации α-аминокислот в воде pКа_Н2О [47] и растворителе вода (0,76 м.д.) - 2-пропанол pK_a(S). Полученные данные представлены в виде рис. (1.1.1). Наличие линейной зависимости подтверждает тот факт, что основность является одним из основных факторов, определяющих реакционную способность α-аминокислот в реакции N-ацилирования сложными эфирами. Значительные отклонения от прямой в случае L-серина и DL-лейцина возможно связаны с наличием систематических погрешностей в определении pК_a в среде вода-2-пропанол. На доступность сопоставления логарифма констант скорости изучаемых реакций от pK_a в воде указывают линейные зависимости pK_a аминов и карбоновых кислот в разных средах, приведенные в работе [37]. Линейная зависимость pК_a аминов и карбоновых кислот описывается уравнением прямой линии (1.1.4):

                                                lgk = a + bpKa                                      (1.1.4)

Таблица 1.1.2

Значения  констант скорости N-ацилирования α-аминокислот

2,4-динитрофениловым  эфиром бензойной кислоты и pK_a(S)

в растворителе вода (0,76 м.д.) - 2-пропанол при 298К

Рис. 1.1.1. Зависимость логарифма N-ацилирования α-аминокислот

2,4-ДНФЭБК  в растворителе вода (0,76 м.д.) - 2-пропанол

от  pK_a этих же α-аминокислот в воде, 298К

В таблице (1.1.3) приведены данные уравнения для  зависимостей lgk

N-ацилирования a-аминокислот сложными фениловыми эфирами бензойных кислот во всех изученных составах растворителя вода-2-пропанол:

Таблица 1.1.3

Уравнения зависимостей lgk N-ацилирования a-аминокислот      2,4-динитрофениловым эфиром бензойной кислоты в растворителе вода-2-пропанол от pKa в воде,  r-коэффициент корреляции [37]

Из приведенных  корреляционных уравнений видно, что  предпочтение следует сделать в пользу использования pKa_(H2O) в качестве критерия, определяющего реакционную способность a-аминокислот в их реакции со сложными эфирами, поскольку он является более точным по мнению авторов по сравнению с pKa в водно-органическом растворителе.

В работе [38] показано, что строение α-аминокислот и состав растворителя оказывают существенное влияние на констант скорости реакции. При переходе от аланина к глицину константа скорости возрастает в 2-3 раза, а при изменении мольной доли водно-органического растворителя (от 0,6 до 0,9) воды константа скорости увеличивается в 3-5 раз. Полученные закономерности представлены на рисунке (1.1.2). Аналогичные закономерности наблюдались в работах [37,39,40].

Рис. 1.1.2. Зависимость логарифмов констант скорости N-ацилирования α- аминокислот Gly, DL-α-Ala, DL-Leu 2,5-ДНФЭБК от мольной доли воды в растворителе вода-ацетонитрил, 298К

Авторы [37,39,40] отмечают, что прослеживается определенная закономерность изменения активационных параметров реакции. С увеличением константы скорости реакции происходит уменьшение энергии активации и заметное увеличение энтропии активации, причем между этими величинами существует линейная зависимость (компенсационный эффект), которая описывается уравнением (1.1.5):

ΔΗ^≠ = А + Т_изо ΔS^≠ (1.1.5)

где  А- постоянная величина, Т_изо- изокинетическая температура.

Зависимость между ΔΗ^≠ и ΔS^≠ изученных в работах [37, 39, 40] реакций N-ацилирования глицина сложными эфирами бензойной кислоты в растворителе вода-2-пропанол может быть представлена в виде уравнений представленных в таблице (1.1.4):

Таблица 1.1.4

Уравнения зависимости ΔΗ^≠ и ΔS^≠ N-ацилирования глицина

фениловыми  эфирами бензойной кислоты

в растворителе вода-2-пропанол, r-коэффициент корреляции

Существование компенсационного эффекта в кинетике химических реакций авторы [36] связывают с особенностями сольватации реагентов реакции и активированного комплекса. Уменьшение DS^¹ с увеличением концентрации воды в водно-органическом растворителе объясняется увеличением упорядоченности переходного состояния.

Растворитель  может оказывать такое же сильное влияние на скорость реакции ацилирования аминосоединений, как и строение реагентов, изменяя константу скорости реакции на несколько порядков.

1.2. Влияние  растворителя на кинетику ацилирования          

       аминосоединений

В работах [48,49] показано, что влияние растворителя на реакционную способность аминов и α-аминокислот в реакциях ацилирования хлорангидридами карбоновых кислот связано со специфической сольватацией функциональных групп реагентов участвующих в реакции.

Особенности взаимодействия различных органических растворителей с аминами можно проследить на примере ацилирования анилина [22]. Поскольку аминогруппа в анилине может быть как акцептором, так и донором электронов, то в растворе могут существовать комплексы анилина с растворителем различного состава: донорно-акцепторные (а), комплексы, образованные за счет водородной связи (б) и (в) (причем молекулы растворителя могут являться как донорами, так и акцепторами электронов) и т.д. [48,49]:

где DR и AR – молекулы растворителя, являющиеся соответственно донорами и акцепторами электронов.

Комплексы (б) и (в) образуются за счет водородной связи. Существование таких комплексов анилина с рядом растворителей подтверждено экспериментально в работах [48,49]. В системе анилин – диоксан - бензол установлено, что в диоксане около 65% анилина находится в виде комплекса (в); дипольный момент анилина в диоксане выше, чем в бензоле, за счет образования водородных связей.

Влияние растворителя на кинетику реакций  N-ацилирования дипептидов и a-аминокислот бензоилхлоридом экспериментально изучалось в работах [25-31,]. Авторы этих работ отмечают, что основным фактором изменения константы скорости реакции глицинат–иона с бензоилхлоридом является специфическое взаимодействие молекул воды с глицинат–ионом, а отрицательный порядок по воде можно объяснить частичной десольватацией глицинат–иона, предшествующей образованию переходного состояния.

Известно, что состав бинарного  растворителя оказывает сильное  влияние как на термодинамические, так и на кинетические параметры реакций, протекающих в растворах. В ряде работ изучалось влияние состава водно-органического растворителя на реакционную способность [25-26,31,, 36, 50] и диссоциацию [19,32,51-53] a-аминокислот. Применение водно-органических растворителей обеспечивает гомогенное протекание рассматриваемых реакций и возможность изучения кинетики реакции N-ацилирования a-аминокислот. Исследование скорости реакции N-ацилирования a-аминокислот в органических растворителях затруднено из-за  их плохой растворимости.

При растворении  аминокислот в водно-органических растворителях наблюдается энтальпийно-энтропийный  компенсационный эффект. Авторы работы [41] изучавшие влияние состава водно-органических растворителей и буферных систем на энтальпийные характеристики сольватации аминокислот и дипептидов высказывают предположение, что экстремальный характер изменения энтальпии растворения аминокислот и дипептидов в водных растворах ацетонитрила связан с усилением электронодонорных свойств смеси (данные Маркуса), уменьшением структурного вклада в энтальпии растворения аминокислот и уменьшением энтальпии образования полости в структуре смешанного растворителя по сравнению с чистой водой, при этом ацетонитрил, разрушая структуру воды и образуя с ней слабые связи, способствует взаимодействию с Gly и Ala.

Межчастичные  взаимодействия в трехкомпонентных водных системах авторы  [42,43] характеризуют в рамках формализма теории МакМиллана-Майера для разбавленных растворов путем расчета энтальпийных коэффициентов парных взаимодействий h_xy аминокислот и пептидов с молекулами растворителя, представленных в таблице 1.2.1.

Таблица 1.2.1.

Энтальпийные  парные коэффициенты взаимодействия h_xy (Дж×кг×моль^-2) аминокислот и пептидов с органическим компонентом раствора [42,43]

Как видно из таблицы 1.2.1 коэффициенты h_xy для всех исследуемых систем, кроме Gly и Ala в смеси с ацетонитрилом, положительны. Авторы полагают, что в области большого содержания воды вещества хорошо гидратируемы и взаимодействия между гидратированными молекулами вещества и растворителя слабы. Коэффициенты h_xy увеличиваются в ряду Gly < Ala < Ala-Gly < Ala-Ala, что связано с ростом размеров молекул и появлением дополнительных неполярных групп, способствующих повышению гидрофобной гидратации [42,43].

Авторами [36] показано, что с увеличением процентного содержания воды в органическом растворителе значения констант скорости растут.  При одном и том же содержании воды в органическом растворителе значения констант скорости в системах вода – 2-пропанол и вода – 2-метил-2-пропанол выше, чем в системе вода – ацетонитрил. Подобное влияние состава водно-органического растворителя отмечалось в исследовании [52] при изучении кинетики реакции ацилирования 4-нитроанилина бензоилхлоридом.

Известно, что амидные растворители относятся к системам с сильным межмолекулярным взаимодействием компонентов, приводящим к образованию молекулярных комплексов состава 1:1 [75]. Авторы данной работы объясняют вид полученных зависимостей констант скорости от мольной доли амидного растворителя в бинарной смеси, исходя из общепринятого допущения о том, что влияние растворителя на скорость ацилирования обусловлено специфической сольватацией функциональных групп, участвующих в реакции. Именно селективная сольватация функциональных групп реагентов с образованием молекулярных комплексов определяет их реакционную способность в ацилировании. Полученные ими данные, представленные на рис.1.2.1 свидетельствуют о сложном характере влияния состава растворителя вода-N,N-диметилацетамид (N,N-ДМАА) на константы скорости всех изученных реакций.