Ирина Эланс

Автор который поможет с любыми образовательными и учебными заданиями

Агароза

Министерство образования и науки, молодежи и

спорта Украины Луганский национальный университет

имени Тараса Шевченко

Реферат на тему:

“АГАРОЗА”

Выполнила: студентка 3-го курса,

Специальность “биология”

Баярова Д.Т

Проверил: И.В Дяченко

План:

1. Гели агар

2.Агарозы - получение, свойства

3. Активация Присоединение

Введение

Актуальность проблемы. Необходимость всестороннего изучения полимерных студней определяется все возрастающей ролью их в практике получения таких полимерных изделий как волокна, пленки, при создании искусственной пищи, медицинских материалов и т.д.

Цель работы. В процессе изучения полимерных студней в последнее время успешно решается целый ряд задач: например, фазовое состояние студней, термодинамические особенности процесса застудневания полимерных систем, морфология студней, влияние термодинамического качества растворителя и другие.

При изучении фазового разделения системы полимер-растворитель при застудневании основное внимание уделяется установлению закономерностей формирования студневой сетки /полимерного каркаса/ и реологическим свойствам, определяемым полимерной компонентой, влиянию растворителя на формирование фазы, обогащенной полимером.

В задачу нашей работы входило комплексное изучение формирования структуры как твердой, так и жидкой фаз, установление их взаимного влияния и роли в формировании студневой структуры в целом.

Научная новизна работы заключается в детальном изучении механизма студнеобразования на основе водных студней агарозы с привлечением разнообразных методов и рассмотрении зависимости свойств студней от различных факторов - концентрации, температуры, растворителя, добавок. Установлено наличие ассоциатов даже в разбавленных растворах агарозы.Впервые получены фракции агарозы и определены их молекулярные массы.Методом распределения в водной и водно-органической двухфазных системах впервые количественно оценена относительная гидрофобность агарозы и ее водно-солевых растворов.

Практическая значимость заключается в том,что в качестве объекта исследования выбрана агароза, являющаяся главным компонентом многотоннажного пищевого полимера - агара, применяемого в различных отраслях народного хозяйства /например,пищевая, кондитерская промышленность, медицина, биология/. Агароза является одним из классических природных полимеров, образующих студни в структурно-сложном растворителе - воде.

Установленные закономерности открывают возможность более рационального использования студне образователя в промышленности и выбора оптимальных условий при проведении технологических процессов производства.

Надо отметить,что особый интерес представляют именно водные растворы и студни агарозы, поскольку вода является обязательной составной частью всех клеток и тканей человека, животных и растительных организмов, саше разнообразные биохимические процессы протекают именно в водной среде. Изучение водных растворов полимеров к тому же может дать сведения и о самой воде.

Между тем в отечественной литературе данных об этом полисахариде недостаточно, а об агарозе отечественного производства не удалось обнаружить сведений вообще. Учитывая вышесказанное, исследование агарозы, выпускаемой нашей промышленностью, само по себе представляет интерес.

Гели агарозы

Агароза —это особо чистая фракция природного, линейного полисахарида, агара, выделяемого из морских водорослей. Мы с ним уже встречались.

Молекулярная масса одиночных нитей агарозы лежит в пределах 10-100 тысяч дальтон. Агароза для электрофореза поставляется в виде лиофилизированного (высушенного в вакууме) порошка. Гелеобразование происходит при остывании даже очень разбавленного горячего раствора агарозы в буфере. При температуре 84-96° С (а у некоторых типов агарозы уже при 70°) нити полимера плавятся и образуют с окружающей водной средой однородную прозрачную жидкость. Она обладает ярко выраженным температурным гистерезисом — застывает при температуре порядка 40°С. Остывая до этой температуры, даже 0,4% -ные растворы агарозы образуют прочные гели. У легкоплавких типов агарозы температура затвердевания снижается до 30°. Такая особенность агарозы облегчает все манипуляции с ее растворами, не опасаясь их затвердевания. Более того,, расплавленную на кипящей бане взвесь агарозы в воде охлаждают до 50-55° и только при этой температуре добавляют концентрат буфера и все другие добавки, а затем заливают в форму для электрофореза. Это удобно и не связано с возникновением тепловых деформаций.

Остывая, хаотически ориентированные нити затвердевшей агарозы благодаря множественным водородным связям между нитями собираются в жгуты. Эти жгуты свободно перекрещиваясь, создают в окружающей их жидкости очень крупнопористую и, вместе с тем, жесткую пространственную сетку.

Размер пор геля агарозы, естественно, связан с концентрацией ее исходного раствора. Можно привести некоторые рекомендации по выбору этой концентрации, почерпнутые из опыта электрофореза нуклеиновых кислот:

Для нуклеиновых кислот вирусов и крупных плазмид 0,4-0,5%.

Для рестриктов ДНК, содержащих 5—20 тысяч пар оснований 0,7-0,8%.

Для более коротких рестриктов ДНК и двунитевых РНК рео-вируса 1,5%.

Для рибосомальных РНК — 1,75%.

Для иРНК и рестриктов ДНК до 1000 п.о. — 2% .

Приготовление пластины для электрофореза в агарозе очень просто. Нужного размера стекло оклеивают со всех сторон по ребру сплошной липкой лентой так, чтобы ее верхний край на несколько миллиметров выступал над поверхностью стекла. Последнее кладут на строго горизонтальный столик. Прямо на стекло выливают рассчитанный объем еще жидкого раствора агарозы. Затем в него близ одного края стекла устанавливают гребенку, подобную той, которую ставят в форму ПААГ перед его полимеризацией. Только на этот раз гребенку погружают в агарозу перпендикулярно стеклу (зубцы ее, однако, не должны касаться стекла). После застывания агарозы гребенку вынимают, образуя таким образом «колодцы» для препаратов. Электрофорез ведут в горизонтальном положении (в треках), накладывая фитили, идущие от резервуаров с буферами. Рабочее значение напряженности поля 2-5 В/см.

ДНК, особенно двунитевые, а также и РНК хорошо окрашиваются желтым флюоресцентным красителем — бромистым эти-дием. Этот краситель несет положительный заряд, что позволяет ему взаимодействовать с фосфатными группами нуклеиновых кислот. Кроме того он способен интеркалировать (встраиваться) между оснований двунитевой ДНК, что приводит к резкому усилению его флюоресценции при освещении ультрафиолетовым светом. Окраску можно производить и после электрофореза вымачиванием геля в течение 0,5—1 часа в водном растворе красителя (1 мкг/мл) или же вводить его непосредственно в гель. В последнем случае можно следить за движением полос в геле. Стеклянную пластину в этом случае освещают УФ-лампой снизу. Чувствительность окраски высока. Можно наблюдать и фотографировать полосы, содержащие 0,01 мкгДНК.

В конце электрофореза ДНК можно зафиксировать в геле осаждением из раствора, вымачивая гель в 70% -ном этаноле.

Агарозы - получение, свойства

Агароза - линейный компонент агара, точно так же, как и амилоза в крахмале. В агарозе для электрофореза/иммунодиффузии удалены остаточные сульфогруппы, которые в агаре присутствуют от природы (их удаляют для предотвращения электроэндосмоса при форезе), а в легкоплавкой агарозе (low melting point), определённые группы вводятся для изменения физических свойств.

Агароза — это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который извлекают из некоторых видов морских водорослей. В полимерной цепи агарозы чередуются beta-D-галактопираноза и 3,6-ангидро-alfa-L-галактопираноза. Молекулярная масса ее составляет 104—105. Гелеобразование идет, как уже указывалось, путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы образуют прочные гели уже при концентрации 0,3%. При температурах 84—96° (а у специальных типов—уже при 70°) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость — «плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10—15 сП, что примерно соответствует вязкости 50%-ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36—42°). У легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой—можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают до 50—55° и уже при этой температуре дозируют и заливают в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных тепловых деформаций.

Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено не наличием примесей, а своего рода «кристаллизацией» геля и свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель представляет собой не вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость. Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных «гелей агарозы.

Температуры плавления и гелеобразования зависят от содержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3—4%. Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза.

Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смешивают с раствором агарозы в горячем виде (при 50—60°). Они не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду, что высокая концентрация агентов,' диссоциирующих водородные связи, несколько затрудняет образование геля. Например, гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при 75°, но не застывают за 1 ч. при 20° [Langridge et al., 1980]. Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию агарозы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза готовят путем заливки дозированного объема расплавленной агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нужного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом.

Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний Размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует' диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гельфильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле…

Матрица агарозы

«Ножка» привязана к гелю агарозы эфирной связью. «Ножка» привязана к гелю агарозы бромциановым методом,меняется даже при кратковременном (2—3-часовом) выдерживании при комнатной температуре в 0,1 М едком натре и 1 М соляной кислоте. Для аффинной хроматографии веществ, слабо растворимых в воде, можно использовать также растворы в 50%-ном диметилформамиде или в 50%-ном этиленгликоле. Лиофильное высушивание можно осуществлять только после добавления в водную суспензию сорбента защитных веществ, например декстра- на, глюкозы и сывороточного альбумина.

Стабильность матрицы агарозы можно значительно повысить путем сшивания эпихлоргидрином 2,3-днбромпропанолом или дивинилсульфоном [34, 58] перед активацией бром- цианом. Устойчивость в водной среде как в кислой, так и в щелочной областях (рН 3—14) растет с увеличением числа сшивок. Возможность использования хаотропных солей, главным образом для элюирования антител, обсуждается в разд. 10.2. Благодаря сшиванию гели приобретают большую устойчивость в органических растворителях, таких, как спирт, диметилформамид, тетра- ги-дрофуран, ацетон, диметилсульфокснд, хлороформ, хлористый метилен, дихлорэтан и дихлорэтан — пиридин (1 : 1).

Связывание аффнниых лигандов с агарозой, активированной бромцианом

Наиболее широко используемый метод связывания аффинного лиганда с сефарозой разработан Поратом, Аксеном и Эрнбаком он основан на активации носителя бромцианом. Аффинные лиганды связываются посредством первичных алифатических или ароматических аминогрупп в непротонированной форме. Ак- сен и Эрнбак предположили, что при этом образуются три различные структуры, а именно N-замещенные карбаматы, N-за- мещенные имидокарбонаты и N-замещенные изомочевины. N-за- мещенная мочевина, как предположил Свенсон на основании работ по изоэлектрофокусированию, является преобладающей формой. В'ильчек и др. [93] представили различные химические доказательства того, что N-замещенные изомочев'ины действительно являются главными продуктами реакции между аминами и сефарозой, активированной бромцианом, как это показано на следующей схеме:

Активация Присоединение

Присоединение аминов к сефарозе, активированной бромцианом, приводит, таким образом, к замещенным изомочевинам. Так,

Сед>ароза, б результате реакции в нейтральной.и щелочной средах образуются группы, способные протонироваться и функционирующие- как ионообменники. Дальнейшее добавление аминов к N-заме- щенным изомочевинам приводит к образованию Мь Ыг-дизаме- щенных гуанидинов. В комбинации с гидрофобными цепами ал- киламинов образующиеся положительные заряды действуют как детергенты. В результате этого возрастает неспецифическая сорбция, что может рассматриваться как обратимая денатурация белков «детергеноподобными» производным^ атарозы и как следствие в некоторых случаях, например при элюировании пеницилли- назы с этилсефарозы 1 М раствором хлорида натрия, происходит инактивация фермента [90].

Образование катионных групп носителя на стадии Б может быть предотвращено использованием гидразидов вместо алифатических аминов. Образующиеся производные имеют р/С 4,2, и, следовательно, они не заряжены при нейтральных рН [37, 50, 91, 92]. Преимущества использования в качестве пространственных групп гидразидов детально обсуждаются в разд. 8.3.

Изучение реакции N-замещенной изомочевины, конъюгирован- ной сефарозой, с аминами и бычьим сывороточным альбумином [93] помогло понять расхождение между опубликованными данными о стабильности конъюгатов. Соединения, содержащие ну- клеофилы, например амины или белки, расщепляют связи изомочевины согласно приведенной выше схеме. Если расщепление связей наблюдается в отсутствие таких соединений, то это происходит, вероятнее всего, благодаря освобождению адсорбированных молекул аффинного лиганда, которые были плохо отмыты. Количество освобождающегося лиганда в результате очень медленного гидролиза изомочевины обычно очень мало и не мешает нормальному процессу аффинной хроматографии. Как показано в разд. 8.5, отщепление аффинного лиганда от специфического сорбента существенно главным образом в системах с высоким сродством или при выделении небольших количеств вещества. Шнапп и Шалитин [65] предотвращали отщепление аффинных лигандов под действием нуклеофилов после присоединения к сефарозе, активированной бромцианом, путем замены связи изомочевины более устойчивой связью гуанидина, для чего бромцианом активировали носитель, содержащий аминогруппы.

Степень активации агарозы, оцениваемая данными о емкости но связыванию небольших пептидов [1], прямо пропорциональна |>Н. Активация проводится при рН 11. Методика активации сефарозы бромцианом детально описана ниже [2, 12, 55].

(Активация агарозы бромцианом при контроле рН с помощью рН-метра

Отмытая и декантированная сефароза суспендируется в дистиллированной воде (1 :1). Работу проводят под тягой. Электроды рН-метра погружают в сус- Ьензию, в которую при постоянном перемешивании прибавляют небольшими пор-циями бромциан (50—300 мг на 1 мл набухшей сефарозы). рН суспензии поддерживают добавляя раствор едкого натра. Концентрацию последнего выбирают в зависимости от количеств сефарозы и бромциана. Куатреказас [12] рекомендует использовать для 5—10 мл набухшей сефарозы и I—3 г добавляемого бромциана 2 М NaOH, а для 100—300 мл набухшей сефарозы и 20—30 г бромциана — 8 М NaOH. Температура не должна превышать 20 °С, если необходимо охлаждение, добавляют лед. Реакция заканчивается за 8—12 мин, После быстрого перенесения суспензии в воронку Бюхнера при постоянном отсасывании активированную сефарозу промывают охлажденным буферным раствором того же состава, который используется при последующей привязке аффинного лиганда. Объем буферного раствора для промывания должен быть в 10—15 раз больше объема раствора, в котором проводилась активация сефарозы. Промытая сефароза как можно быстрее суспендируется в равном объеме раствора аффинного лиганда. Согласно Куатреказасу [12], промывка, добавление раствора аффинного лигаида и смешивание не должны занимать более 90 с. Даже при низкой температуре активированная сефароза нестабильна.

Активированная бромцианом сефароза 4В поступает в продажу в виде лиофильно высушенного продукта, содержащего дек- стран и лактозу, которые перед использованием следует отмывать. Ниже приводится методика для привязки аффинного лиганда к активированной бромцианом сефарозе, предлагаемая фирмой Pharmacia.Требуемое количество геля замачивают для набухания в Ю-3 М соляной кислоте; Ю-3 М соляную кислоту используют также для промывки геля в течение 15 мин. 1 г лиофильно высушенного геля набухает до объема ~3,5 мл. Гель рекомендуется промывать в несколько приемов, используя на 1 г сухого геля 200 мл раствора. Сразу же после промывки добавляют раствор аффинного лиганда, который необходимо привязать к сефарозе. Оптимальные условия для связывания аффинного лиганда (рН, состав буфера н температура) зависят до определенной степени от характера лиганда. Как правило, реакция связывания наиболее эффективна при рН 8—10, но можно использовать и более низкие значения рН, если этого требует природа связываемого лиганда. Аффинный лиганд присоединяется в достаточных количествах даже и при этих рН, если увеличить количество бромциана при активации и количество лиганда при связывании, Аффинный лиганд, в особенности белкового характера, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5) для предотвращения неспецифической адсорбции. Высокая ионная сила облегчает затем последующую промывку. Можно использовать карбонатный и боратиый буферы с добавками хлорида натрия.

Количество связанного аффинного лиганда зависит от содержания его в реакционной смеси и объема геля, рН реакции, природы присоединяемого лиганда (числа реакционных групп и т. п.), а также от времени реакции и температуры. Например, при присоединении химотрипсина к 2 мл активированной бромцианом сефарозы при рН 8 из 10 мг присутствующего белка присоединяется только 5 мг, из 20 мг 8 мг, а из 30 мг 10 мг. При комнатной температуре (20—25 °С) присоединение обычно заканчивается за 2 ч, в то время как при более низких температурах рекомендуется оставлять реакционную смесь на ночь. Реакционную смесь следует перемешивать, однако не рекомендуется использовать магнитную мешалку, так как это может привести к механической деструкции геля.

Когда присоединение заканчивается, гель с привязанным аффинным лнгаи- дом переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают тем же самым буферным раствором, в котором проводилось присоединение. Для удаления оставшихся активных групп фирма Pharmacia рекомендует блокировать их обработкой 1 М 2-аминоэтанолом при рН 8 в течение 2 ч. Продукт должен быть затемпромыт 4—5 раз другими буферными растворами с высоким и низким рН [например, ацетатным (0,1 моль/л, рН 4) и боратным (0,1 моль/л, рН 8,5) буферами, содержащими 1 моль/л хлорида натрия]. Как уже указывалось, все вещества, связанные не ковалентно, должны быть удалены в ходе промывок.

Активация агарозы бромцианом в концентрированном фосфатном буфере [54]

Для активации больших количеств агарозы и для активации мембран из агарозы или тонких слоев агарозы, покрывающих стеклянные шарики, Порат и др. [54] разработали очень простой и воспроизводимый метод активации в щелочном фосфатном растворе очень высокой буферной емкости; при этом отпадает необходимость контроля рН и интенсивного перемешивания. Найдены условия для высокой, средней и низкой степеней активации, которые выбираются, исходя из природы связываемого аффинного лиганда. Кроме того для высокой степени активирования гелей, были выбраны условия как для гелей с низким содержанием агарозы (р= 1—4%), так и с высоким {/> = 4—8%) содержанием. Методики даны для гелей с разным содержанием (р, %) агарозы в набухшем геле.

Метод А. Высокоактивированные гели агарозы (р—1—4%)

Набухший гель (10 г р %-ной агарозы) суспендируют в 2,5 р мл холодного (5—10°С) 5 М К-фосфашого буфера (3,33 моль К>Р04 +1,67 моль К2НР04 в 1 л раствора). Суспензию разбавляют дистиллированной водой до 20 мл и прибавляют небольшими порциями в течение 2 мин 0,1 р мл водного раствора бромциана (100 мг/мл). Раствор в течение 10 мин (включая время, необходимое для прибавления бромциана) осторожно перемешивают при 5—10 °С. Продукт активации промывают на стеклянном фильтре холодной водой до нейтральной реакции.

Метод Б. Высокоьктивированные гели агарозы (р=4—8%)

Гель агарозы промывают 2 М фосфатным буфером и отфильтровывают при отсасывании. 10 г р %-ной агарозы суспендируют в 2,5 р мл холодного фосфатного буфера и активируют, как в методе А, с 1,0 р мл водного раствора бром- циана.

Метод В. Среднеактивированные гели агарозы (р — 1—8%)

Методика идентична описанной для метода А; для приготовления суспензии используют 0,5 р мл буферного раствора и прибавляют 0,2 р мл бромциана.

Метод Г. Слабоактивированные гели агарозы (р=/—8%)

Методика аналогична описанной для метода А; для приготовления суспензии используют 0,12 р мл буферного раствора и прибавляют 0,05 мл бромциана.

Активированные продукты быстро промывают 0,25 М карбонатом натрия (рН 9), в котором проводили связывание химотрипсина, по методике, подобной той, которая используется для промывания продажной активированной сефарозы.

Упрощенный метод активации агарозы бромцианом

Бромциан растворяют в ацетонитриле (2 г/мл, т.е. 19 моль/л). Раствор устойчив при —20 "С и может храниться при этой температуре. Равные объемы 50%-ной (по объему) водной суспензии агарозы и растворы 2 М карбоната натрия смешивают и охлаждают во льду. Затем прибавляют ацетонитрильный раствор бромциана (0,2 г бромциана на 1 мл набухшей агарозы) и смесь 1—2 мин перемешивают. Активированный гель затем промывают и добавляют к раствору связываемого вещества (например, а 0,2 М бикарбонате натрия, рН 9,5). Преимуществом этого метода является его простота и существенное сокращение неприятных и опасных манипуляций с бромцианом во время взвешивания.

Высокая стабильность бромциана в Ы-метил-2-пир- ролидоне использована Ни- шикавой и Бэйлоном при изучении влияния количества бромциана на активацию агарозы. На рис. 8.2 показано влияние ■бромциана на связывание 6-аминогексановой кислоты 6, 4 и 2%-ной агарозой. Бромциан прибавлялся в виде 16% -кого (по объему) водного раствора в N-ме- тил-2-пнрролидоне.

Конечное количество связанного аффинного лиганда можно регулировать, изменяя количество бромциана, вводимого при активации. Необходимо, чтобы используемые препараты бромциана были бесцветными, а кристаллы практически не плавились. Желтоватоокрашенные препараты плохо реагируют. Изучение влияния концентрации е-аминокапроновой кислоты на ее связывание активированной бромцианом сефарозой показало, что высокая концентрация аффинного лиганда при коротком времени инкубации дает лучшие результаты, чем низкая концентрация при продолжительной инкубации.

Присоединение аффинных лигандов к агарозе с помощью бифункциональных оксиранов [71]

Бисоксираны (например, диглицидильный эфир бутандиола-1,4) были использованы для введения в агарозу реакционноспособ-

Метод пригоден для связывания Сахаров, которые образуют- эфирные овязи по своим гидравсильным группам. Белки и пептиды своими первичными аминогруппами образуют алкиламинные связи, С веществами, которые содержат тиольные группы, образуются тиоэфирные связи. Когда используется М-бис^.З-эиокси- пропокси) бутан, то между лигандом и цепью агарозы вводится пространственная группа, соответствующая цепи из 12 углеродных атомов. Под действием бисоксирана происходит поперечное сшивание углеводных цепей матрицы геля, которое повышает ее устойчивость. Это позволяет применять более жесткие условия для связывания и элюирования. Эти гели поступают в продажу под названием эпоксиактивированной сефарозы.

Активация, поперечное сшивание и связывание

1 г подсушенной при отсасывании агарозы (сефароза 6В) промывают водой на воронке со стеклянным фильтром, а затем смешивают с 1 мл диглици- :дилового эфира и 1 мл 0,6 М едкого натра, содержащего 2 мг/мл борогидрида иатрия. Суспензию перемешивают (вращением) при 25 "С в течение 8 ч, затем реакцию останавливают; гель промывают большим объемом воды (500 мл) на воронке со стеклянным фильтром. Связывание проводят, смешивая 1 г подсушенной отсасыванием оксиран-агарозы с 2 мл раствора вещества, подлежащего иммобилизации, в буфере с требуемым рН. Белки связываются при рН 8,5—>10- 'ш температуре 25 "С, продолжительность реакции 15—48 ч.

Связывание аминокислот, аминов, углеводов и других более или менее устойчивых соединений можно проводить при рН 9—11, 25—75°С, с продолжительностью реакции 4—15 ч. Увеличить выход в реакции связывания можно, повысив рН и температуру реакции.

Уменьшение выхода для связывания белков при низких рН и температуре? можно компенсировать увеличением продолжительности реакции. Остающиеся оксирановые группы, способные к дальнейшему связыванию, блокируются, например, 24-часовой обработкой 2 М глицином или 2-аминсэтанолом, предпочтительно при рН >8,5 и температуре 23 °С. Наряду с водными растворами, можно работать в присутствии также органических растворителей, таких, как днметилформа- мид или дкоксэн (содержание их в конечной смеси должно соответствовать 50%),

Обратимая ковалентная иммобилизация ферментов с помощью тиол-дисульфидиого обмена

Карлсон и др. использовали эпоксиактивированную ага- розу в качестве основы для приготовления меркаптооксипропилового эфира агарозы, хоторую они применили для ковалентной иммобилизации а-амилазы и химотрипсина с помощью тиол-дисуль- фидного обмена. Методика включает две стадии: а) тиолирова- ние ферментов метил-3-меркаптопропиоимидатом и б) связывание тиолированных ферментов со смешанными дисульфидными производными агарозы, лолученными при взаимодействии меркаптоок- сипропилового эфира агарозы с г^'-дипиридилдисульфидом. Полученные препараты иммобилизованных ферментов обладали высокой активностью. Иммобилизованная а-амилаза была применена для непрерывного гидролиза крахмала. Когда препарат терял свою ферментативную активность, неактивный белок удаляли восстановлением дисульфидных связей и гель повторно использовали для связывания свежей активной тиолированной «-амилазы.