Амилолитические преператы

АМИЛОЛИТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

     Амилолитические препараты широко выпускаются в  нашей стране и за рубежом. В основном это крупнотоннажное производство. Амилазы находят применение почти  во всех областях, где перерабатывается крахмалсо-держащее сырье. Амилазы  используют для осахаривания зернового и кар­тофельного крахмала. Самым большим потребителем амилолитических ферментов является спиртовая и пивоваренная промышленности, где в на­стоящее время солод (проращенное зерно) успешно заменяется амилолитическими ферментными препаратами.

 Источники получения амилаз

     Амилазы очень широко распространены в природе. Они синтезируются многими микроорганизмами (бактерии, грибы, актиномицеты, дрожжи), животными и растениями. До развития ферментной промышленности главным  промышленным источником получения амилаз в европейских странах было проросшее зерно (солод). Для медицинских целей амилазы получали из животного сырья. В настоящее время главным источником амилаз являются микроорганизмы, особенно бактерии, грибы и реже дрожжи.

Механизм действия и свойства амилаз

     Субстратами для действия амилаз являются крахмал, состоящий из амилозы и амилопектина, продукты частичного гидролиза крахмала и гликоген.

     Крахмал - растительный полисахарид с очень  сложным строением. Это двухкомпонентное соединение, состоящее из 13-30% амилозы и 70-85% амилопектина. Оба компонента неоднородны, их молекулярная масса (М. м.) колеблется в широких пределах и зависит от природы крахмала. Амилоза - это неветвящийся полимер, в котором остатки глюкозы соединены a-1, 4-гликозидной связью; степень полимеризации около 2000. В «аномальных» амилозах с одной-двумя a-1, 6-связями полимеризация может возрасти до 6000 (рис.1). Амилоза практически не обладает восстанавливающей способностью, так как в каждой молекуле амилозы имеется только одна свободная альдегидная группа.

     Молекула  амилозы представляет собой растянутую спираль, шаг которой составляет 10,6 А и в каждый виток входит 3 остатка глюкозы.   
 

Рис 1. Строение амилозы:

а — амилоза  без аномальных отклонений; б - схема возможных ветвлений амилозы; в — спираль амилозы в растворе с заключенными в ее полость молекулами йода.

Концевые звенья с альдегидными группами 1 разветвление 2 разветвления 4 разветвления 8 разветвлений

16 концевых звеньев 64 концевых звена

Рис. 2.2. Амилопектин, схема дихотомического деления  амилопектина (по К. Мейеру):

а - в плоскости; б - в пространстве.

     Максимальнаяная длина молекулы амилозы достигает 7000 А. В растворе спираль сжимается за счет увеличения витка, в котором уже участвует 6 остатков глюкозы. При вхождении молекул йода в спираль амилозы возникает характерный синий цвет. Строго говорить о величине молекулы амилозы нельзя, т. е. даже из одного образца крахмала извлекается амилоза, с величиной молекулы от 500 до 2000 остатков глюкозы. Амилопектин имеет большую молекулярную массу, чем амилоза, и более сложное строение. Это ветвящийся полисахарид. Предполагается, амилопектин ветвится дихотомически, т. е. число концевых звеньев всегда на единицу больше числа звеньев, дающих ветвление, а сумма этих чисел дает общее число звеньев по всей цепи (см. рис. 2.2).

     Механизм  действия. К группе амилотических  ферментов относятся a- и b-амилазы, глюкоамилаза, пуллуланаза, изоамилаза и некоторые  другие ферменты. Амилазы бывают двух типов: эндо- и экзоамилазы. Четко выраженной эндоамилазой является а-амилаза, способная к разрыву внутримолекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата.

     Глюкоамилаза  и b-амилаза являются экзоамилазами, т. е. ферментами, атакующими субстрат с нередуцирующего конца.

     При изучении механизма действия амилаз имеются определенные сложности, и  прежде всего они заключаются  в том, что субстрат - крахмал неоднороден  и имеет различные характеристики по степени полимеризации гли-козидной цепи и количеству ветвлений.

     Реакции, катализируемые амилазами, имеют две  стадии: короткую -предстационарную и  длительную - стационарную. Во время  первой стадии эндоамилаза быстро уменьшает  молекулярную массу субстрата, образуя  смесь линейных и разветвленных  олигосахаридов. Второй этап реакции продолжается, пока продукты гидролиза не перестанут окрашиваться йодом; он протекает значительно медленнее и зависит от индивидуальных свойств фермента и его природы. Поэтому конечные продукты гидролиза а-амилазами могут быть различными. Первая стадия воздействия фермента на субстрат хотя и носит неупорядоченный характер, имеет для всех видов a-амилаз схожий механизм.

     Существует  две гипотезы о механизме действия экзоамилаз на субстрат. Первая гипотеза предполагает, что, воздействуя на субстрат по одноцепочечному или «молниеобразному» механизму, экзоамилаза образует фермент-субстратный комплекс с захватом нередуцирующего конца цепи.

     Дальнейшее  продвижение фермента по этой цепи происходит до полного ее гидролиза. По второй гипотезе (b- и глюкоамилаза действуют на субстрат путем механизма множественной атаки, т. е. фермент образует комплекс с молекулой субстрата, затем через несколько этапов этот комплекс распадается и фермент связывается с новой молекулой субстрата. Иными словами, при множественной атаке происходит нечто среднее между неупорядоченным механизмом и одноцепочечной, «молниеобразной» атакой. Для полного гидролиза по этому механизму одна молекула субстрата должна образовывать много раз фермент-субстратные комплексы. При этом возможен гидролиз нескольких связей в одном каталитическом акте.

     Механизм  воздействия амилаз на субстрат может  быть рассмотрен с нескольких позиций:

1)     вид разрываемой связи (a-1,4 или  a-1,6);

2)     тип воздействия на субстрат (эндо- или экзо-);

3)     влияние на скорость гидролиза степени полимеризации субстрата;

4) возможность  гидролиза олигосахаридов;

4)     способность фермента к множественной  атаке субстрата. 

     Наличие признаков амилаз, отраженных в 3 и 4 позициях, при действии на линейные субстраты может свидетельствовать о существовании у этих ферментов подцентровой структуры. Вероятно, активный центр амилазы может состоять из нескольких  подцентров, каждый из которых может вступать в контакты с глюкозным остатком. Энергия взаимодействия (А;), выраженная в единицах свободной энергии (кДж/моль), определяет подцентровое сродство фермента к субстрату. Это сродство индивидуально и может быть как положительным, так и отрицательным. Вероятность существования подцентровых структур амилаз помогает установить строение активного центра амилаз, дает более четкое объяснение субстратной специфичности, но не дает объяснений механизма гидролиза разветвленных субстратов.

     a-Амилаза.  а-Амилаза (а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1.) является эндоамилазой, вызывающей  гидролитическое расщепление a-1,4-гли-козидных связей внутри высокополимеризованного субстрата. Фермент назван a-амилазой потому, что он высвобождает глюкозу в a-мутамерной форме.

     а-Амилаза - водорастворимый белок, обладающий свойствами глобулина и имеющий  М. м. 45 000-60 000. Своего рода исключением является a-амилаза В. macerans, которая имеет М. м. 130 000. Есть указания, что некоторые термостабильные a-амилазы имеют М. м. 14 000-15 000, но в их молекулах содержится в 2-3 раза больше атомов кальция.

     Все а-амилазы относятся к металлоэнзимам, содержание в них Са колеблется от 1 до 30 г атом на 1 г  моль фермента. Полное удаление кальция приводит к инактивации фермента. Повторное введение кальция в среду может частично восстановить его активность. a-Амилаза В. subtilis с помощью иона цинка способна образовывать димерную форму, чего лишены другие a-амилазы. Все a-амилазы устойчивы к воздействию протеаз. Они богаты тирозином и триптофаном. Глютаминовая и аспарагиновая кислоты составляют 25% массы белка. Наличие этих кислот в а-амилазе связывают с их оса-харивающей способностью. Так, разжижающие a-амилазы не имеют сульфгидрильных групп, а осахаривающие содержат один остаток цистеина. Сравнительно мало или совсем отсутствуют в а-амилазах содержащие серу аминокислоты. Некоторые a-амилазы грибного происхождения имеют углеводный фрагмент, в состав которого могут входить манноза, ксилоза, гексозоамин, но функции его не установлены.

     В зависимости от вида микроорганизма свойства ос-амилаз могут сильно отличаться не только по механизму воздействия  на субстрат и конечным продуктам, но и по оптимальным условиям для  проявления максимальной активности.

     Действуя  на целое крахмальное зерно, a-амилаза атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т.е. как бы раскалывает зерно на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием на окрашиваемые йодом продукты - в основном состоящие из низкомолекулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия a-амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йодом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются a-амилазой до ди- и моносахаридов.

     Все a-амилазы проявляют наименьшее сродство к гидролизу концевых связей в  субстрате. Некоторые же а-амилазы, особенно грибного происхождения, на второй стадии процесса гидролизуют субстрат более глубоко с образованием небольшого количества мальтозы и глюкозы. Схему гидролиза под действием а-амилазы можно записать следующим образом:

                  а-Амилаза                                            

Крахмал,----------------> а-Декстрины + Мальтоза + Глюкоза 

гликоген                          (много)            (мало)         (мало) 

     b-Амилаза. b-Амилаза (a-1,4-глюкан мальтогидролаза,  КФ 3.2.1.2) - активный белок, обладающий  свойствами альбумина. Каталитический  центр фермента содержит сульфгидрильные  и карбоксильные группы и имидозольный цикл остатков гистидина. b-Амилаза -экзофермент концевого действия, проявляющий сродство к предпоследней b

-1,4-связи с  нередуцирующего конца линейного  участка амилозы и амилопектина.

     В отличие от a-амилазы b-амилаза практически  не гидролизует нативный крахмал, тогда как клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием мальтозы b-конфигурации, поэтому данная амилаза по аналогии с a-амилазой называется b-амилазой. Если гидролизу подвергается амилоза, то гидролиз идет полностью до мальтозы. Незначительное количество декстринов может образовываться при гидролизе «аномальных»  амилоз, так как гидролиз b-амилазой идет только по линейной цепи до a-1,6-связей. Если субстратом для b-амилазы служит амилопектин, то гидролиз идет в значительно меньшей степени. b-Амилаза отщепляет фрагмент с нередуцирующего конца участка от внешних линейных ветвей, имеющих по 20-26 глюкозных остатков, с образованием 10—12молекул мальтозы. Гидролиз приостанавливается на предпоследней a-1,4-связи, граничащей с a-1,6-связью. В гидролизате накапливается 54-58% мальтозы, остальное составляют высокомолекулярные декстрины, содержащие значительное количество а-1,6-связей - так называемые b-декстрины. Действие b-амилазы на крахмал можно записать в виде следующей схемы:

                 b-Амилаза  

Крахмал,----------------> Мальтоза + р-Декстрин 

гликоген                     (54-58%)       (42-46%)

     b-Амилазы  проявляют большую стабильность  в отсутствие ионов Са2+. Молекулярная  масса b-амилазы растений достаточно  высока, она составляет от 50 000до 200 000. Фермент может состоять из одной или четырех субъединиц до 50 000 каждая. Фермент содержит SH-группы и чувствителен к действию тяжелых металлов. Считается, что (b-ами-лаза обладает высокой способностью к множественной атаке субстрата. Для амилозы средней молекулярной массы в одном присоединении фермента к субстрату возможно отщепление до четырех остатков мальтозы. При увеличении молекулярной массы субстрата возможно и большее количество мест атаки. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     ГЛЮКОАМИЛАЗА

     Глюкоамилаза (а-1,4-глюкан глюкогидролаза, КФ 3.2.1.3.) широко распространена в природе. Она синтезируется многими микроорганизмами и образуется в животных тканях, особенно в печени, почках, плаценте кишечника и т. д. Фермент в литературе известен под различными названиями: амилоглюкозидаза, g-амилаза, лизосомальная a-глюкозидаза, кислая мальтаза, матулаза и экзо-1,4-a-глюкозидаза. Глюкоамилаза катализирует последовательное отщепление концевых остатков a-D-глюкозы с нередуцирующих концов субстрата. Это фермент с экзогенным механизмом воздействия на субстрат. Многие глюкоамилазы обладают способностью так же быстро, как и a-1,4-связь, гидролизовать a-1,6-глюкозидные связи. Но это происходит только в том случае, когда за a-1,6-связью следует a-1,4-связь, поэтому декстран ими не гидролизуется. Отличительной особенностью глюкоамилаз является способность в десятки раз быстрее гидролизовать высокополимеризованный субстрат, чем олиго-и дисахариды.

           В литературе высказывается мнение, что механизм атаки субстрата  глюкоамилазой может быть двух типов: либо одно-цепочечный, либо множественной атаки, и что активный центр имеет под-центровую структуру.

     Почти все глюкоамилазы являются гликопротеидами, содержащими от 5 до 35% углеводов, которые  состоят из олиго-, ди- и моносахаридов. Углеводный компонент может быть целостным фрагментом или же разбитым на индивидуальные соединения, которые прикрепляются к белку через треонин и серин. Например, у глюкоамилазы A. niger их 20. Большинство известных глюкоамилаз имеет оптимум рН при 4,5-5,2, реже - при 5,7-6,0, в основном для дрожжевых глюкоамилаз.

     РН-стабильность микробных глюкоамилаз лежит  в широком диапазоне -от 2,5 до 9. Термостабильность  глюкоамилаз лежит в интервале  от 30 до 45°С и редко повышается до 55-60°С. Глюкоамилазы различного происхождения заметно отличаются по молекулярной массе, которая, по данным различных авторов, имеет значения от 48 000 до 210 000. Следует заметить, что далеко не все микробные глюкоамилазы способы полностью гидролизовать крахмал до глюкозы. Еще в 60-х годах И.Фукумото предложил все микробные глюкоамилазы разделить на два типа:

1)     полностью гидролизующие крахмал  до глюкозы и 

2)     гидролизующие крахмал до глюкозы  на 80-85%.

     В то время предполагалось, что степень  гидролиза зависит только от свойств  глюкоамилаз и их происхождения. Позже было показано, что при росте культуры параллельно накапливаются и другие амилолитические ферменты, обладающие не только гидролитическим, но и трансферазным действием. Это гликозилтрансфераза и a-амилаза. Даже в случае, если система открытая и продукт гидролиза (глюкоза) постоянно удаляется из системы, процесс может дойти до полного гидролиза крахмала до глюкозы. Если же система закрытая и концентрация субстрата велика, то при достижении определенной концентрации глюкозы в реакционной среде в результате переноса глюкозильных остатков на глюкозу, ди- и олигосахариды начинают накапливаться изомальтоза, паноза, нигероза, изомальтотриоза и другие сахара, которые имеют горький вкус. В результате процесс не может дойти до полного превращения крахмала в глюкозу и возникает ошибочное представление, что глюкоамилаза не полностью гидролизует крахмал. Сама же глюкоамилаза может проявлять небольшую трансферазную активность, но только при концентрации глюкозы свыше 60-70%. Поэтому ранее принятое деление глюкоамилаз на два типа следует считать необоснованным. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  литературы 

1. Алейникова  Т.Л., Рубцова Г.В. «Руководство  к практическим занятиям

 по биологической  химии». М.: Высшая школа 1988 г. 

2. Жеребцов Н.А.  «Амилолитические ферменты в пищевой

 промышленности».  М.: Лёгкая и пищевая промышленность 1984 г. 

3. А. Ленинджер  «Биохимия». 1976 г. 

4. Лещук Р.И., Хило З.В. «Малый практикум  по биохимии». Томск 1984г. 

5. Производство  и применение амилолитических  ферментов в пищевой

 промышленности. М.: Пищевая промышленность 1968 г. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

МИНИСТЕРСТВО  ОБРАЗОВАНИЯ  И  НАУКИ  РОССИЙСКОЙ  ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ  ГОСУДАРСТВЕННОЕ  БЮДЖЕТНОЕ  ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧЕРЕЖДЕНИЕ  ВЫСШЕГО  ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО  ОБРАЗОВАНИЯ

«МОСКОВСКИЙ  ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ

ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ» 
 

Кафедра «Биотехнология» 

Реферат

на тему: «Глюкоамилаза». 
 
 

Выполнил  студент

Васильева Марина

Группы 08-ТПМ-13 

Преподаватель: Филатова Г.Л. 
 
 
 
 

Москва 2011

Содержание: