Барьеры против инфекций

Мы живем в  потенциально враждебном мире, наполненном  огромным множеством инфекционных агентов, которые имеют различные размеры, форму, строение и разрушительную способность. Они были бы рады использовать нас для размножения своих «паразитических генов», если бы мы в свою очередь не выработали целый ряд защитных механизмов, по меньшей мере равных по эффективности и изобретательности (все же при многих паразитарных инфекциях ситуацию можно охарактеризовать как странное и зачастую не достигающее своей цели перемирие). Действие этих защитных механизмов, обеспечивающих возникновение иммунитета к инфекциям (от лат. immunitas - свободный от чего-либо), и составляет основу предмета, называемого «иммунология».

За исключением  не до конца понятых конституциональных факторов, делающих один вид восприимчивым, а другой невосприимчивым к определенным инфекциям, существует ряд неспецифических антимикробных систем (например, система фагоцитов), которые являются «врожденными» в том смысле, что их активность не зависит от предварительного контакта с антигеном. Мы рассмотрим эти системы и увидим, как их эффективность может быть существенно повышена в случае специфического приобретенного иммунитета. 

Барьеры против инфекций

   Простейший  путь избежать инфицирования - это предотвратить  проникновение возбудителя в  организм (рис. 1.2). Главной линией обороны  служит, конечно, кожа, которая, будучи неповрежденной, непроницаема для большинства инфекционных агентов. Когда целостность кожного покрова нарушена, например при ожогах, инфекция становится главной проблемой. Вдобавок большинство бактерий не способны долго существовать на поверхности кожи из-за прямого губительного воздействия молочной кислоты и жирных кислот, содержащихся в поте и секрете сальных желез и обусловливающих низкое значение рН. Исключение составляет золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), часто инфицирующий относительно уязвимые волосяные фолликулы и железы.

   Слизь, выделяемая стенками внутренних органов, действует как защитный барьер, препятствующий прикреплению бактерий к эпителиальным клеткам. Микробы и другие чужеродные частицы, захваченные слизью, удаляются механическим путем - за счет движения ресничек эпителия, с кашлем и чиханьем. К другим механическим факторам, способствующим защите поверхности эпителия, можно отнести вымывающее действие слез, слюны и мочи. Во многих жидкостях, секретируемых организмом, содержатся бактерицидные компоненты, такие, как кислота в желудочном соке, спермин и цинк в сперме, лактопероксидаза в молоке и лизоцим в слезах, носовых выделениях и слюне.

   Совершенно  иной характер имеет механизм микробного антагонизма, связанный с нормальной бактериальной флорой человека. Эти бактерии угнетают рост многих потенциально патогенных микроорганизмов и грибов вследствие конкуренции за необходимые питательные вещества или выработки таких соединений, как колицины или кислоты. Например, патогенная флора влагалища угнетается молочной кислотой, которая вырабатывается одним из видов бактерий-комменсалов. Эти бактерии метаболизируют гликоген, секретируемый клетками влагалищного эпителия. Если защитные комменсалы повреждены антибиотиками, то чувствительность к возможному инфицированию Candida и Clostridium difficile возрастает.

   Если  же микробы все-таки проникли в организм, то в действие вступают два способа защиты - разрушение растворимыми химическими факторами типа бактерицидных ферментов b фагоцитоз («поедание» клетками). 

Фагоцитирующие клетки уничтожают микроорганизмы

«Профессиональные»  фагоциты

  Захват  и переваривание микроорганизмов осуществляются двумя типами клеток, которые И.И.Мечников определил как микро- и макрофаги.

Полиморфноядерные нейтрофилы

   Эти клетки (называемые также микрофагами) имеют  общего гемопоэтического стволового предшественника с другими форменными элементами крови и доминируют среди остальных лейкоцитов. Полиморфноядерный нейтрофил-неделящаяся ко- роткоживущая клетка с сегментированным ядром и набором гранул, которые не прокрашиваются такими красителями, как гематоксилин и эозин, в отличие от аналогичных структур у эозинофилов и базофилов (рис. 1.3 и 1.5). У нейтрофилов известны три типа гранул: первичные азурофильные гранулы, содержащие миелопероксидазу, небольшое количество лизоцима и набор катионных белков; вторичные «специфические» гранулы, содержащие лактоферрин, лизоцим и белок, связывающий витамин В₁₂; третичные гранулы, похожие на обычные лизосомы и содержащие кислые гидролазы. Обширные запасы гликогена, который может быть использован в гликолизе, позволяют этим клеткам существовать в анаэробных условиях. 

Макрофаги

   Макрофаги образуются из промоноцитов костного мозга, которые после дифференцировки в моноциты крови в конце концов задерживаются в тканях в виде зрелых макрофагов, где и формируют систему мононуклеарных фагоцитов (рис. 1.4). Они присутствуют повсюду - в соединительных тканях и вокруг базальных мембран мелких кровеносных сосудов; особенно высоко их содержание в легких (альвеолярные макрофаги) и печени (клетки Купфера). Кроме того, макрофаги выстилают синусоиды селезенки и медуллярные синусы лимфатических узлов, где их основная функция - отфильтровывание чужеродных материалов. Другой пример макрофагов - мезангиальные клетки почечных клубочков, микроглиальные клетки мозга и остеокласты костной ткани. В отличие от полиморфноядерных лейкоцитов макрофаги - долгоживущие клетки с хорошо развитыми митохондриями и шероховатым эндоплазматическим ретикулумом (рис. 1.5). И если полиморфноядерные нейтрофилы обеспечивают основную защиту от пиогенных (гноеродных) бактерий, то функция макрофагов в основном сводится к борьбе с теми бактериями (рис. 1.3, ж), вирусами и простейшими, которые способны существовать внутри клеток хозяина. 

Фагоцитоз

   Чтобы осуществился фагоцитоз, должна произойти адгезия микроба на поверхности нейтрофила или макрофага. Это достигается за счет весьма примитивного механизма узнавания, вероятно основанного на взаимодействии углеводных остатков. В зависимости от своей природы частичка, прикрепившаяся к поверхностной мембране фагоцита, может инициировать фазу поглощения путем активации актин-миозиновой сократительной системы, что приводит к образованию вокруг частички псевдоподий (рис. 1.6 и 1.7). По мере того как близлежащие рецепторы последовательно присоединяются к поверхности микроба, плазматическая мембрана надвигается на частичку, подобно застежке-молнии, до тех пор, пока частичка не будет полностью заключена в вакуоль (фагосому; рис. 1.6 и 1.8). Далее события развиваются быстро, и в течение минуты цито- плазматические гранулы сливаются с фагосомой и изливают в нее свое содержимое. Захваченный микроорганизм (рис. 1.8) подвергается действию целого ряда бактерицидных механизмов. 

Уничтожение чужеродных клеток

Кислородзависимые механизмы

   Неприятности  для пришельца начинаются с того момента, когда инициируется фагоцитоз. Происходит резкая активация гексозомонофосфат- ного шунта, генерирующего НАДФН. НАДФН используется для восстановления молекулярного кислорода, связанного с уникальным мембранным цитохромом (cyt b_₂₄₅), что вызывает бурное потребление кислорода. В результате образуются надпероксидный анион, пероксид водорода, синглетный кислород и гидроксильные радикалы - все они служат мощными бактерицидными агентами. Более того, сочетание пероксида, миелопероксидазы и ионов галогенов создает мощную систему галогенирования, способную вызвать гибель как бактерий, так и вирусов (табл. 1.1). 

Кислородонезависимые механизмы

   Из  табл. 1.1 ясно, что при дисмутации надпероксида потребляются ионы водорода и слегка повышается рН, а это создает оптимальные условия для функционирования семейства катионных белков, которые еше не полностью охарактеризованы. Эти белки разрушают бактериальную мембрану как за счет протеиназного эффекта (нейтральная протеиназа катепсин G). так и за счет непосредственного присоединения к поверхности микроорганизма. Низкие значения рН, лизоцим и лактоферрин представляют собой кислородонезависимые бактерицидные и бактериостатические факторы, которые могут действовать в анаэробных условиях. В конце концов убитые микроорганизмы расщепляются гидролитическими ферментами, и продукты деградации высвобождаются из клетки (рис. 1.7).

   Мы  все находимся под надежной защитой  фагоцитирующих клеток. Но наш богатый арсенал бесполезен до тех пор, пока не произойдут три события: 1) сближение фагоцита и микроорганизма; 2) адгезия микроорганизма на поверхности фагоцита; 3) активация мембраны фагоцита, которая приводит к поглощению микроорганизма. Ряд бактерий действительно продуцирует химические соединения, направлено привлекающие лейкоциты, этот процесс известен как хемотаксис; некоторые бактерии прикрепляются к поверхности фагоцита, а другие способны спонтанно подать мембране инициирующий сигнал. Однако патогенные микроорганизмы постоянно претерпевают мутации и способны настолько видоизменяться, что выходят из-под контроля защитных механизмов. Но в течение миллионов лет эволюции без особых затруднений организм решил эту проблему, создав систему комплемента. 
 
 

   Система комплемента облегчает  фагоцитоз

   Система комплемента и  её активация

Комплементом  называют сложный комплекс белков (около 20), которые, так же как и белки, участвующие и процессах свертывания крови, фибринолиза и образования кининов, формируют каскадные системы, обнаруженные в плазме крови. Для этих систем характерно формирование быстрого, многократно усиленного ответа на первичный сигнал за счет каскадного процесса. В этом случае продукт одной реакции служит катализатором последующей.

   Ряд компонентов  системы комплемента обозначают  символом «С» и цифрой, которая  соответствует больше хронологии их открытия, чем порядковому номеру в последовательности реакции. В наибольшей концентрации в сыворотке крови присутствует компонент СЗ (1,2 мг/мл). Его мол. масса равна 195 кДа. 

Механизм расщепления СЗ

    При нормальных условиях внутренняя тиоэфирная связь в СЗ активируется очень медленно в результате реакции с водой или следовыми количествами протеолитических ферментов плазмы крови, что приводит к образованию активного промежуточного продукта - продукта расщепления СЗ, а именно СЗb или функционально сходной молекулы. В присутствии ионов Mg²⁺ СЗb может образовать комплекс с другим компонентом системы комплемента, фактором В; затем фактор В расщепляется одним из ферментов плазмы крови (фактором D). Образованный комплекс обозначается СЗbВb. При расщеплении компонентов системы комплемента большему продукту присваивается символ «b», а меньшему - символ «а».

    СЗbВb обладает новой важной ферментативной активностью: он представляет собой «СЗ-конвертазу» и способен расщеплять СЗ на СЗа и СЗb. Ниже мы остановимся на важных биологических последствиях расщепления СЗ для защиты от микробов, но в нормальных условиях должен существовать механизм, сдерживающий это расщепление на «отключенном» уровне, поскольку данный процесс сам по себе может приводить к увеличению концентрации СЗbВb; т.е. мы имеем дело с потенциально выходящей из-под контроля системой с положительной обратной связью. В принципе все системы с обратной положительной связью, которые могут выйти из-под контроля, обладают мощными регуляторными механизмами. 

Контроль  уровня С3b

C3bBb-конвертаза в растворах нестабильна, и фактор В легко замещается другим компонентом – фактором H, образуя комплекс, доступный для атаки фактором I, инактивирующим C3b(рис 1.10). Инактивированный C3bi биологически инертен и в дальнейшем расщепляется трипсиноподобными ферментами, присутсвующими в организме. 

Активация механизма расщепления  СЗ

Некоторые микроорганизмы могут активировать СЗbВb-конвертазу с образованием большого количества продуктов расщепления СЗ путем связывания СЗbВb-конвертазы на углеводных участках своей поверхностной мембраны и защищая ее тем самым от действия фактора Н. Затем другой белок - пропердин - взаимодействует со связанной конвертазой, стабилизируя ее еще сильнее. Как только СЗ расщепляется связанным с мембраной СЗbBb, его внутренняя тиоэфирная связь активируется, и реакционноспособное производное СЗ ковалентно связывается с мембраной. Таким образом, один активный центр СЗbВb позволяет связаться с микроорганизмом большому количеству молекул СЗb. Эта последовательность реакций, вызываемая непосредственно микроорганизмами и приводящая к расщеплению СЗ, носит название альтернативный путь активации комплемента (рис. 1.11).

Последовательность  содытий после расщепления СЗ

Следующий активируемый компонент -С5, взаимодействуя с мембраносвязанным СЗЬ, становится субстратом для СЗbВb и расщепляется с выделением короткого полипептида С5а, причем больший фрагмент С5b остается связанным с мембраной. С5b последовательно связывает С6, С7 и С8, образуя комплекс, способствующий правильной ориентации двух или более молекул последнего компонента С9. Это приводит к развертыванию молекул С9, проникновению их внутрь липидного бислоя и полимеризации в кольцеобразный «мембраноатакующий комплекс» (МАК, рис. 1.12 и 2.2), формирующий трансмембранный канал, полностью проницаемый для электролитов и воды. За счет высокого коллоидно-осмотического давления внутри клетки в нее поступают ионы Na⁺ и вода, что и приводит к лизису.

Система комплемента  обладает несколькими биологическими функциями:

1. Реакции адгезии

  Фагоцитирующие клетки имеют рецепторы для СЗb и C3bi, которые облегчают адгезию микроорганизмов, нагруженных СЗb, на поверхности клетки.

2. Образование биологически активных фрагментов

СЗа и С5а-небольшие пептиды, отщепляемые в процессе активации комплемента от молекул- предшественников, выполняют ряд важных функций. Они действуют непосредственно на фагоциты, особенно на нейтрофилы, вызывая резкую активацию дыхания, что связано с продукцией метаболитов кислорода. Кроме того, оба представляют собой «анафилатоксины» и могут вызвать выброс медиаторов из тучных клеток (рис. 1.3 и 1.13) и из циркулирующих в крови базофилов (рис. 1.3). Это явление уместно рассмотреть в рамках настоящего обсуждения, и поэтому на рис. 1.14 подробно представлены медиаторы и их биологическое действие. Особенно следует отметить хемо- таксические свойства этих молекул и их влияние на кровеносные сосуды. В свою очередь С5а служит мощным хемотаксическим агентом для нейтрофилов и способен эффективно воздействовать на клетки эндотелия капилляров, вызывая расширение сосудов и повышая их проницаемость. Данный эффект пролонгируется лейкотриеном В₄, который выделяют тучные клетки и активированные нейтрофилы.

3. Повреждение мембран

   Как отмечалось выше, встраивание МАК в мембрану может привести к лизису клетки. К счастью, система комплемента  относительно малоэффективна в отношении лизиса мембран аутологичных клеток. 
 
 
 
 

Острая  воспалительная реакция, опосредованная активацией комплемента. 

   Итак, теперь можно создать хорошо аранжированный сценарий защиты организма. Спектакль начинается с активации комплемента по альтернативному пути (рис. 1.15)

В первом действии СЗbВb закрепляется на поверхности микроорганизма и расщепляет большие количества СЗ. Фрагмент СЗа выделяется, а многочисленные молекулы СЗb связываются с микроорганизмом. Это активирует следующий этап с образованием С5а и МАК (хотя многие микроорганизмы обладают устойчивостью к действию последнего).

   Во  втором действии мы видим СЗа и С5а, которые способствуют высвобождению медиаторов из тучных клеток и вместе с ними вовлекают полиморфноядерные нейтрофилы и другие компоненты системы комплемента в очаг проникновения микроорганизма. Все это вызывает расслабление стенок артерий и приводит к усилению кровотока и расширению мелких сосудов, в то время как сокращение клеток эндотелия капилляров позволяет выходить белкам плазмы из сосудов. Нейтрофилы замедляют движение у стенок капилляров, проникают в отверстия между эндотелиальными клетками (диапедез) и перемещаются по градиенту концентрации хемотаксических факторов до тех пор, пока не окажутся лицом к лицу с микроорганизмом, покрытым СЗb. Далее происходит связывание микроорганизма с СЗЬ - рецепторами нейтрофила, СЗа и С5а резко активируют клеточное дыхание, и мгновенно наступает финал последнего действия!

Расширение капилляров (гиперемия), экссудация белков плазмы и других жидкостей из-за изменений гидростатического и осмотического давления (отек) и накопление нейтрофилов носят общее название острой воспалительной реакции. 

Гуморальные механизмы  обеспечивают вторую стратегию защиты

  Обращаясь к тем защитным системам, действие которых опосредовано исключительно растворимыми факторами, вспомним, что многие микроорганизмы активируют систему комплемента и чувствительны к литическому действию МАК. Распространение инфекции может быть ограничено ферментами, высвобождающимися из поврежденных тканей и активирующими систему свертывания крови. Среди растворимых бактерицидных соединений, вырабатываемых организмом, наиболее распространен фермент лизоцим (мурамидаза, расщепляющая пептидогликаны клеточной стенки чувствительных бактерий).

Белки острой фазы

     Концентрация некоторых белков плазмы крови, имеющих общее название белки острой фазы, резко увеличивается в ответ на инфекцию или повреждение тканей. К этим белкам относятся: С-реактивный белок (CRP, от англ. C-reactive protein), сывороточный амилоидный А-белок, a₁-антитрипсин, а₂-макроглобулин, фибриноген, церулоплазмин, компонент комплемента С9 и фактор В.

     В  процессе инфекции продукты жизнедеятельности  микробов, такие, как эндотоксины,  стимулируют выработку интерлейкина-1 (ИЛ-1), который представляет собой эндогенный пироген (он увеличивает эффективность защитных механизмов, вызывая повышение температуры тела). Кроме того, ИЛ-1 действует и на печень, усиливая синтез и секрецию CRP до такой степени, что концентрация последнего в плазме крови может увеличиваться в 1000 раз.

CRP человека состоит из пяти идентичных, нековалентно связанных полипептидных цепей, образующих замкнутый пентамер. Этот класс белков распространен в животном мире уже давно, поскольку гомологичный CRP белок лимулин-обнаружен в гемолимфе мечехвоста, филогенетически очень далеко отстоящего от Homo sapiens. Важное свойство CRP-способность связываться при участии кальция с некоторыми микроорганизмами, у которых в состав мембраны входит фосфорилхолин. Образовавшийся комплекс активирует систему комплемента (по классическому, а не по хорошо нам знакомому альтернативному пути). Это приводит к связыванию СЗb с поверхностью микроба, и в результате последний опсонизируется, т.е. подготавливается к фагоцитозу. 

Интерфероны

  У рыб, птиц, рептилий, так же как у млекопитающих, обнаружен ряд антивирусных агентов широкого спектра действия - интерферонов, впервые выявленных при изучении вирусной интерференции, когда животное, зараженное одним вирусом, устойчиво к заражению другим неродственным вирусом. Идентифицированы различные типы интерферонов; гены каждого из них клонированы. Существуют по меньшей мере 14 α-интерферонов (α-ИФН), которые продуцируются лимфоцитами, тогда как фибробласты, а возможно, и другие клетки продуцируют β-ИФН. Пока мы не будем рассматривать γ-ИНФ, поскольку его образование не индуцируется вирусами.

При вирусной инфекции клетки синтезируют интерферон и  секретируют его в межклеточное пространство, где он связывается  со специфическими рецепторами соседних незараженных клеток. Связанный интерферон оказывает противовирусное действие следующим образом. Полагают, что в клетке, подвергшейся воздействию интерферона, дерепрессируются по меньшей мере два гена и начинается синтез двух ферментов. Первый - протеинкиназа - фосфорилирует рибосомальный белок и фактор инициации, необходимый для синтеза белка, тем самым значительно снижая трансляцию мРНК. Второй фермент катализирует образование короткого полимера адениловой кислоты, активирующего латентную эндонуклеазу, что приводит к деградации мРНК как вируса, так и хозяина.

   Каким бы ни был конкретный механизм действия интерферона, конечный результат состоит в образовании барьера, из неинфицированных клеток вокруг очага вирусной инфекции, чтобы ограничить ее распространение. Об эффективности действия интерферона in vivo можно судить по результатам введения мышам антисыворотки к собственному интерферону При этом летальная доза вируса оказывается в несколько сот раз меньше, чем в контроле. Однако следует подчеркнуть, что интерфероны играют большую роль именно в борьбе с вирусами, но не в предотвращении вирусных инфекций.

     Может оказаться, что интерфероны как система в целом обладают более широким биологическим действием, чем ограничение вирусной инфекции. Необходимо выяснить, способны ли описанные выше ферменты, синтез которых индуцируется интерфероном, ингибировать деление клеток хозяина с той же эффективностью, что и репликацию вируса. Интерфероны способны модулировать активность и других клеток, например нормальных киллеров (НК). 

Внеклеточное  уничтожение

Нормальные  киллеры

   Вирусы способны размножаться только в клетках инфицированного хозяина, используя для этого их репликативные механизмы. Очевидно, что в интересах хозяина уничтожить эти зараженные клетки до того, как вирус получит возможность размножаться. Исследования in vitro показали, что «именно этим и занимаются нормальные киллеры (НК).

НК это большие зернистые лимфоциты (рис. 1.3) с характерной морфологией. Полагают, что они узнают определенные структуры высокомолекулярных гликопротеинов, которые экспрессируются на мембране инфицированных вирусом клеток. Благодаря этому НК отличают такие клетки от нормальных. Узнавание клетки-мишени и сближение с ней происходит за счет рецепторов НК. В результате НК активируются, и содержимое гранул выбрасывается в межклеточное пространство. Возможно, главная роль здесь принадлежит перфорину или цитолизину, имеющему некоторое структурное сходство с компонентом комплемента С9. Подобно С9, перфорин может встраиваться в мембрану клетки-мишени и образовывать трансмембранную пору, как и в случае МАК системы комплемента, что приводит к гибели клетки. Антитела к цитолизину подавляют внеклеточное уничтожение. Кроме того, гранулы НК содержат две сериновые протеиназы, которые могут функционировать как цитотоксические факторы, но не вполне ясно, принадлежит ли им главная роль в НК-зависимом лизисе. Хондроитинсульфат А протеогликан, устойчивый к протеиназам и имеющий высокий отрицательный заряд, тоже обнаружен в НК и может защищать эти клетки от автолиза (рис. 1.16).

   Различные интерфероны усиливают цитотоксичность НК, а поскольку интерфероны вырабатываются инфицированными вирусом клетками, то перед нами - хорошо интегрированная защитная система с обратной связью.

Эозинофилы 

Крупные паразиты типа гельминтов физически не могут  быть фагоцитированы. Чтобы справиться с ними, на помощь приходят эозинофилы, осуществляющие внеклеточное уничтожение. Эти лиморфноядерные  «двоюродные братья» нейтрофилов содержат в отличие от последних гранулы, интенсивно прокрашивающиеся кислыми красителями (рис. 1.3) и имеющие характерный вид на электронных микрофотографиях.

Главный основный белок (МВР, от англ. major basic protein) локализован в ядре гранул, в то время как катионный белок и пероксидаза эозинофилов находятся в матриксе гранул. Арилсульфатаза В, фосфолипаза D и гистаминаза также включены в гранулы. Клетки имеют поверхностный рецептор для СЗb, а при активации в них происходит особенно мощное усиление дыхания, сопровождающееся выработкой активных метаболитов кислорода. Вдобавок, недавно было показано, что один из белков находящихся в гранулах, может «протыкать» мембрану клетки-мишени подобно С9 или перфорину НК.

Большинство гельминтов способны активировать комплемент по альтернативному пути, и, хотя они устойчивы к действию С9, связывание ими СЗb позволяет эозинофилам с помощью СЗb-рецепторов присоединиться к их поверхности через СЗb. После активации эозинофилы начинают свою атаку, высвобождая МВР и преимущественно катионный белок, которые повреждают мембрану паразита.