Биотехнологии в селекции

Возникновение Селекции связано с введением  в культуру растений. Начав возделывать  растения, человек стал отбирать и  размножать наиболее продуктивные особи, что способствовало их непроизвольному  улучшению. Так, на заре человеческой культуры возникла примитивная селекция. Её история исчисляется тысячелетиями.

Древние селекционеры создали прекрасные сорта плодовых растений, винограда, многие сорта пшеницы, породы домашних животных. Им были известны некоторые современные селекционные приёмы. Например, искусственное опыление финиковой пальмы применяли в  Египте и Месопотамии за несколько  веков до н. э.

Во второй половине XIX в. Немецкий ученый Герман Гельрих 20 сентября 1886 г. сделал в Берлине, в Обществе немецких естествоиспытателей и врачей, доклад «В какой форме азот доступен для растений». Результаты его экспериментов доказывают участие в фиксации азота микроорганизмов.

Правда, это  открытие не стало для ученых большой  неожиданностью, оно уже было подготовлено ходом науки, – идея, что называется, носилась в воздухе. Гельриху просто посчастливилось первому доказать то, что большинство ученых уже давно предполагали.

Через два  года, в 1888 г., знаменитый голландский  бактериолог М.Бейеринк, смог выделить и вырастить чистую культуру азотфиксирующих бактерий. Позднее, по предложению Б.Франка, они получили название Rhizobium (1889 г.).

Еще через  два года (1890) А. Празмовский показал, что эта культура удовлетворяет постулатам Роберта Коха о паразитических бактериях.

ПОСТУЛАТЫ ГЕНЛЕ-КОХА (HENLE-KOCH POSTULATES) — впервые сформулированы Якобом Генле и адаптированы Робертом Кохом в 1877 г., поправки внесены в 1882 г. Кох полагал, что принять тот или иной бактериальный паразит как причину инфекционной болезни можно в случае, если соблюдаются следующие условия. 
 

1. Присутствие возбудителя в каждом случае болезни должно быть доказано выделением в чистой культуре.
2. Возбудитель не должен обнаруживаться при других болезнях.
3. Выделенный возбудитель должен воспроизводить болезнь у экспериментальных животных.
4. Возбудитель должен быть выделен от животного при экспериментально вызванной болезни.

 Он вырастил  растения гороха на стерильной  почве, оказалось, что при таком  выращивании клубеньков у них  не образуется. Потом ученый заразил  выросший без клубеньков горох  чистой культурой Rhizobium leguminozarum и наблюдал, как после этого на корнях растений развиваются клубеньки. Из этих клубеньков Празмовский повторно выделил бактерии, которые оказались все теми же Rhizobium leguminozarum.

Однако, несмотря на бурное и многообещающее начало, новые идеи в этой области очень  скоро перестали появляться

Но именно этот «застой» вынудил ученых обратить внимание на «менее интересные» факты: а именно, на другие случаи опухолеобразования у растений, например на известные ботаникам корончатые галлы. Многие виды галлов вызываются насекомыми-паразитами, но корончатые галлы возникали явно без их участия. Первыми их исследователями были американский фитопатолог Э.Смит и датский ветеринар К.Енсен. Причем, последний заинтересовался корончатыми галлами, изучая образование опухолей у животных (растения служили ему моделью). Енсен показал, что опухоль у свеклы может возникнуть, если заразить растение чистой культурой Agrobacterium tumefaciens. Смиту и его сотруднику Гаунсенду удалось показать то же самое для хризантемы.

Таким образом, был найден еще один интересный случай заражения растений бактериями, причем эти бактерии относились уже к  другому роду, а растения были не бобовыми. И хотя при этом на растении также возникало разрастание  тканей, на симбиоз бобовых с Rhizobium это явно не походило. Ученые переключились на эксперименты с бактериями – нужно было понять, чем они отличаются друг от друга.

Ключом к  решению проблемы стало обнаружение  в 1974 г. у агробактерий плазмид – небольших кольцевых молекул ДНК. Это открытие было сделано Генте в лаборатории Дж.Шелла.

Открытием плазмид у агробактерий заинтересовались многочисленные коллективы молекулярных генетиков, началась настоящая гонка научных исследований – тогда-то и стала обрисовываться перспектива разработки метода получения трансгенных растений. Узкая научная тропинка вывела на широкую дорогу открытий – почти каждое новое исследование шаг за шагом продвигало вперед решение старой проблемы.

В 1978 г. разные группы ученых (под руководством Тампе и Пти во Франции, М. ван Монтегю в Бельгии, Шелла и Холстера в Германии) описали способность Тi-плазмиды (Ti – от tumor-inducing, индуцирующие опухоль) передаваться от одной бактерии к другой путем конъюгации.

В 1978 г. Шеллом было показано, что Тi-плазмиду можно использовать как переносчик любых чужеродных генов, если только вставить их в область Т-ДНК плазмиды. В том же году эту возможность продемонстрировали Схильперорт и Ледебур в Голландии, а позже, в 1980 г., Нестер и Чилтон в США. С этого началась не только новая дорога научных поисков, но и новая эра в развитии сельского хозяйства и мировой экономики.

Несомненно, что первым импульсом к генной и хромосомной инженерии послужили  достижения клеточной биологии, прежде всего реализация методов культивирования  клеток, тканей и органов. Для растений главным итогом культуральных работ было установление принципа тотипотентности, то есть возможности получения полноценного организма из любой клетки на специальных искусственных средах. Важность этого принципа заключается в том, что любая дифференцированная клетка в специально созданных условиях может повторить весь путь онтогенеза, иными словами, весь путь развития организма.

Вторым импульсом для направленного  введения чужих генов в геном  растений стало открытие механизма  встройки почвенной бактерией части  своего генома в геном растений. В конце 70-х годов в ряде лабораторий  Бельгии, США и ФРГ было показано, что болезнь растений под названием "корончатые галлы" не что иное, как опухолевые образования, которые  возникают в результате встройки в геном растения части мегаплазмиды почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Это бактерия несет гены, вызывающие опухоли у растений.

Экспериментаторы рассматривают  почвенную бактерию, как природного геноинженера. Пришлось только обезоружить ее: опухолеиндуцирующую область плазмиды удалили и заменили на искусственно сконструированный вектор, в который включен избранный нами чужой ген, переносимый в ядерный геном растений. Следует отметить, что все трансгенные растения получены на основе схемы агробактериального переноса. Однако она эффективна лишь для двудольных растений. Для однодольных, в основном злаковых растений, разработаны другие способы переноса генетических конструкций, из них чаще используется баллистический - с помощью установки под названиями "генная пушка", или "дробовик". На микрочастицы золота или вольфрама помещаются ДНК-векторы и под давлением "выстреливаются" в растительные клетки.

Методы биотехнологии  в селекции:

• Хромосомная инженерия;
• Генная инженерия
• Клеточная селекция;

Хромосомная инженерия.

В настоящий момент хромосомная  инженерия связывается, прежде всего, с возможностями замещения (замены) отдельных хромосом у растений или  добавления новых.

Известно, что в клетках каждого  диплоидного организма имеются  пары гомологичных хромосом. Такой  организм называют дисомиком. Если в какой-либо паре хромосом остается одна гомологичная хромосома, то получается моносомик. При добавлении третьей гомологичной хромосомы возникает трисомик, а при отсутствии в геноме одной пары гомологичных хромосом возникает нуллисомик. Такие манипуляции с хромосомами дают возможность заменять одну или обе гомологичные хромосомы, допустим, одного сорта пшеницы на ту же пару хромосом, но из другого сорта. Что это дает селекционеру? Тем самым он может один признак, который ему кажется слабым у данного сорта, заменить на этот же, но более сильный признак из другого сорта. Таким образом, он приближается к созданию « идеального» сорта, у которого все полезные признаки будут выражены в максимальной степени.

Эту же цель преследует и методика замены отдельных хромосом одного вида на хромосомы другого вида, близкого по своему происхождению. В литературе принято вместо слов «замена хромосом»  употреблять «замещение хромосом». Поэтому полученные таким путем  формы называются замещенными линиями. Другой методический прием состоит  во введении (внедрении) в геном определенного  вида или сорта какой-либо дополнительной пары хромосом другого вида растений, которые определяют развитие признака, отсутствующего у первого вида. Если такое введение пары дополнительных хромосом удается осуществить, то полученные формы называют дополненными линиями.

Метод гаплоидов

Очень перспективен, основан на выращивании гаплоидных растений с последующим удвоением хромосом. Например, из зерен кукурузы выращивают гаплоидные растения, содержащие 10 хромосом, затем хромосомы удваивают и получают диплоидные (10 пар хромосом), полностью гомозиготные растения всего за 2-3 года вместо 6- 8-летнего инбридинга.

Получение полиплоидных остатков

Также важным методом хромосомной  инженерии является получение полиплоидных остатков в результате кратного увеличения хромосом. Подробности метода описаны  выше.

Генная инженерия

Под генной инженерией обычно понимают искусственный перенос нужных генов  от одного вида живых организмов (бактерий, животных, растений) в другой вид, часто  очень далекий по своему происхождению. Чтобы осуществить перенос генов (или трансгенез), необходимо выполнить следующие сложные операции:

1. выделение из клеток бактерий, животных или растений тех генов, которые намечены для переноса. Иногда эту операцию заменяют искусственным синтезом нужных генов, если таковой оказывается возможным;
2. создание специальных генетических конструкций (векторов), в составе которых намеченные гены будут внедряться в геном другого вида. Такие конструкции кроме самого гена должны содержать все необходимое для управления его работой (промоторы,терминаторы) и гены-«репортеры», которые будут сообщать, что перенос успешно осуществлен;
3. внедрение генетических векторов сначала в клетку, а затем в геном другого вида и выращивание измененных клеток в целые организмы (регенерация).

На рисунке показана одна из схем получения гена, кодирующего  нужный нам белок. На первом этапе  из клеток выделяют и-РНК. Затем на ней, как на матрице, синтезируют нить комплиментарной ей ДНК (к-ДНК). Благодаря этому получается гибридная ДНК-РНК-молекула. После удаления РНК из этой молекулы на оставшейся одноцепочечной ДНК осуществляют синтез второй нити. В результате возникает полноценная молекула ДНК.

Используя специальные  ферменты, ее встраивают в кольцевую  ДНК плазмид (внехромосомных молекул ДНК), которые выполняют роль переносчика нужного гена. На последнем этапе плазмиды со вставкой встраиваются в бактериальную хромосому. В ней перенесенный ген человека, животного, растения или другого микроорганизма начинает работать, и в бактериальной клетке накапливается необходимый белок, остается лишь выделить его из бактериальной массы. Таких бактерий размножают в промышленных масштабах и получают необходимый белок в больших количествах. Все эти технологические приемы основаны на успехах в познании физико-химических основ жизни. Решение практических задач с помощью описанных методов молекулярной биологии и генетики и составляет сущность генной инженерии. 

Растения и животные, геном которых  изменен в результате таких генно-инженерных операций, получили название трансгенных растений или животных.

Для более наглядного представления  можно рассмотреть пример, в котором ученым из разных стран, в том числе и нашей, удалось с помощью генно-инженерных методов создать ценные для селекции новые формы растений. В природе существует бактерия Bacillus thuringiensis, которая нарабатывает белок, называемый эндотоксином.  Свое название он получил потому, что при попадании этой бактерии в желудок насекомых – вредителей сельскохозяйственных растений этот белок вызывает лизис (разрушение) стенки желудка и гибель насекомого – вредителя. Это свойство белка генные инженеры решили использовать для создания форм полезных сельскохозяйственных растений, устойчивых к насекомым – вредителям. Они выделили из бактериальной ДНК ген, кодирующий белок эндотоксин. Далее ген был встроен в состав природных генетических векторов – Ti-плазмид, присутствующих в клетках почвенной бактерии Acrobacterium tumefaciens. Этой бактерией были заражены кусочки растительной ткани, выращиваемой на питательной среде. Через некоторое время плазмиды, несущие ген белка-токсина, внедрились в растительные клетки, а затем ген встроился в ДНК растений. О том, что этот процесс прошел успешно, сообщил специальный ген-«репортер», также искусственным путем введенный в состав Ti-плазмид. Затем кусочки растительной ткани перенесли на питательную среду другого состава, которая обеспечивает рост и развитие полноценных растений. В конце концов, такие растения были выращены, и оказалось, что если на их листья посадить гусениц насекомых-вредителей, то, попробовав растительной ткани с белком-токсином, гусеницы погибают. Важно, что белок-токсин оказался гибельным только для насекомых и совершенно безвреден для человека и сельскохозяйственных животных. Описанным выше путем к настоящему моменту удалось получить формы картофеля, томатов, табака, рапса, устойчивые к разнообразным сельскохозяйственным вредителям. Это одно из первых и самых значительных достижений генной инженерии растений в практической селекции.

Одной из важных областей приложения методов генной инженерии в растениеводстве  является биологическая фиксация азота. Эти исследования проводятся с целью  повышения продуктивности азотфиксирующих  бактерий и получения эффективных  биологических препаратов для фиксации азота посевами как бобовых, так  и не бобовых культур; создания симбиотических отношений между азотфиксирующими микроорганизмами и не бобовыми культурами, в частности злаковыми; получения  растений, способных самостоятельно, без помощи микроорганизмов, фиксировать  азот.

Обнаружены азотфиксирующие микроорганизмы из семейств Spirillaceae, Enterobacteriaceae, Bacillaceae и ряда других, способные сосуществовать с корневой системой злаков (рис, кукуруза, пшеница, сорго), снабжающей их углеводами. Наиболее широко работы ведутся с бактериями Azospirillum (Postgate, 1989). В серии опытов, проведенных в различных штатах Индии, инокуляция семян пшеницы, риса, сорго, проса ри-зосферными азотфиксаторами обеспечивала прибавки урожая зерна до 30% (Subba Rao, 1982).

Методы генной инженерии

К методам прямого переноса чужеродной ДНК в протопласты растений и  животных относится электропарация: кратковременные электрические разряды (1—100 мкс при напряженности поля 1000—10000 В/см2) увеличивают проницаемость мембран протопластов, куда и проникает находящееся в растворе ДНК. Так были получены трансформанты кукурузы, риса и сахарного тростника. В MCXA разрабатывается метод введения чужеродной ДНК с использованием электрофореза в агаровом геле. Показана возможность применения данного метода для трансформации каллусов пшеницы с последующей регенерацией из них трансгенных растений.

     Оригинальный способ  введения чужеродной ДНК в  злаки разработан в Корнельском  университете США. С помощью  генетического пистолета в клетки  растений выстреливают крохотные  вольфрамовые шарики, покрытые генетическим  материалом. Например, способ баллистической  трансформации применили для  введения гена вируса табачной  мозаики в клетки лука. Была  установлена экспрессия гена  в клетках (Уайк, 1988). Метод высокоскоростной баллистической трансформации в настоящее время широко используется в Центре "Биоинженерия", ИМГ, ИФР. ВНИИСБ при создании трансгенных растений пшеницы, кукурузы, подсолнечника, плодовых.

Нерешенные проблемы генной инженерии.

        Одной из самых значительных  трудностей генной инженерии  является введение в геном  больших генов или нескольких  функциональных генов. Это связано  с емкостью векторов для трансформации.  Гены, в особенности эукариотические значительны по размеру(5-15 т.н.п.), но они все чаще используются для трансформации растений. Но кроме выбранного гена векторные конструкции должны содержать в себе селективные гены. В некоторых случаях для укорачивания конструкции используют кДНК последовательности. Однако кДНК комплексы не всегда приемлемы из- за специфики сплайсинга in vivo.

Лимитирующим  фактором для трансформации растений может быть и то, что необходимый  признак кодируется несколькими  генами, и получение трансгенных растений обладающих такими признаками пока технически не выполнимо.

Отдельно  стоит проблема, возникающая при  экспрессии чужеродного гена. Часто  после двух  - пяти поколений активно  транскрибирующийся ген, перестает  экспрессироваться. Чаще всего инактивация трансгена происходит из-за метилирования регуляторных последовательностей, либо возможна репрессия в результате взаимодействия с промотором каких-то белков. Активировать такой выключенный трансген не представляется возможным. Спрогнозировать данную ситуацию довольно-таки трудно, так как она зависит от ряда факторов, в том числе и от последовательности самого белка и конкретном месте интеграции его в геном растения. Преодолеть это вероятно в какой-то мере возможно путем получения многократной трансформации и получения различных линий, несущих одинаковую векторную конструкцию с различными местами интеграции в геном растения.

Одной из самых  главных причин сдерживающих интенсивность  и эффективность работ по трансгенезу остается крайне слабое развитие исследований по идентификации эффективных генов, созданию банков генов и ограниченная научная база генетической инженерии, что связано с крайне слабой финансовой поддержкой в нашей стране генной инженерии, как важнейшего приоритета XXI  века.

Клеточная селекция

Более широкое  практическое применение в настоящее  время получило другое важнейшее  направление современной биотехнологии  — клеточная селекция как метод  создания новых форм растений путем  выделения мутантных клеток и  сомаклональных вариаций в селективных условиях.

Сомаклональные вариации (варианты) (somaclonal variations 
(variants)) [греч. soma — тело и clon — отпрыск, ветвь; лат. variatio — изменение; франц. variante, от лат. 
varians (variantis) — изменяющийся] — фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органельных геномов клеток; от истинных генных мутаций отличаются большей частотой возникновения и множественностью происходящих изменений (изменения в структуре генов, хромосом, геномов).

  Клеточная селекция является как бы развитием мутационной селекции, но реализуется на уровне единичных клеток с использованием техники in vitro (в пробирке, вне живого организма), что придает ей, с одной стороны, более широкие возможности, а с другой стороны — создает значительные трудности из-за необходимости регенерации из отдельных клеток полноценных. Преимущество клеточной селекции перед традиционными методами состоит в отсутствии сезонности в работе, возможности использования миллионов клеток при отборе, направленности селекции путем применения селективных сред и выполнении работ в лабораторных условиях.

С развитием  культуры in vitro появилась реальная возможность более широкого использования гаплоидии в селекции сельскохозяйственных культур. Применение метода культуры клеток позволило осуществить регенерацию растений из генеративных клеток, содержащих гаплоидный набор хромосом. Стало возможным массовое получение гаплоидов. Практическое значение в селекции в настоящее время получили культура пыльников (андрогенез), завязей и семяпочек (гиногенез) и метод гаплопродюсера, который является разновидностью гиногенеза Keller et al., 1987).

В Селекционно-генетическом институте (г. Одесса, бывш. ВСГИ) методом гаплопродюсера были созданы первые два отечественные сорта ячменя Исток и Одесский 115. Сорт Одесский отличался повышенной продуктивностью и устойчивостью к болезням и был признан перспективным в ряде областей (Новолоцкий, 1986). В последующем этим методом были получены засухоустойчивые сорта Прерия и Степной дар (Новолоцкий, 1997). Срок выведения сортов ячменя при использовании гаплоидной селекции сокращается на 4—6 лет.

При изучении растений, регенерированных из соматических клеток в культуре in vitro, было установлено, что они генетически не всегда однородны. Эту, так называемую, сомаклональную изменчивость, как источник полезных мутаций стали использовать в селекции растений. У регенерантов в отличие от индуцированных мутантов редко наблюдается мозаичность, что является результатом их происхождения из единичной клетки, и поэтому сомаклоны могут быть стабилизированы в течение одного поколения.