Содержание. 

1. Введение

2. Получение соматотропина

3. Производство инсулина

4. Получение интерферонов

5. Заключение

6. Список испоьзованных источников 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение 

     Полипептиды — высокомолекулярные органические вещества, состоящие из соединённых в цепочку пептидной связью альфа-аминокислот. В живых организмах аминокислотный состав белков определяется генетическим кодом, при синтезе в большинстве случаев используется 20 стандартных аминокислот. Множество их комбинаций дают большое разнообразие свойств молекул белков. Кроме того, аминокислоты в составе белка часто подвергаются посттрансляционным модификациям, которые могут возникать и до того, как белок начинает выполнять свою функцию, и во время его «работы» в клетке. Часто в живых организмах несколько молекул белков образуют сложные комплексы, например, фотосинтетический комплекс.

     Так же как и другие биологические  макромолекулы (полисахариды, липиды) и нуклеиновые кислоты, белки  — необходимые компоненты всех живых  организмов, они участвуют в большинстве  жизненных процессов клетки. Белки  осуществляют обмен веществ и  энергетические превращения. Белки  входят в состав клеточных структур — органелл, секретируются во внеклеточное пространство для обмена сигналами  между клетками, гидролиза пищи и  образования межклеточного вещества.

     Следует отметить, что классификация белков по их функции достаточно условна, потому что у эукариот один и тот же белок может выполнять несколько функций. Хорошо изученным примером такой многофункциональности служит лизил-тРНК-синтетаза — фермент из класса аминоацил-тРНК синтетаз, который не только присоединяет лизин к тРНК, но и регулирует транскрипцию нескольких генов[27]. Многие функции белки выполняют благодаря своей ферментативной активности. Так, ферментами являются двигательный белок миозин, регуляторные белки протеинкиназы, транспортный белок натрий-калиевая аденозинтрифосфатаза и др. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Получение соматотропина 

     Структура гормона роста  человека. Соматотропины разной видовой принадлежности, обладая различиями в химической структуре, иногда довольно значительными, тем не менее проявляют четкую структурную гомологию. Все изученные соматотропины млекопитающих, в том числе человека, построены из одной полипептидной цепи, состоящей из 191 аминокислотного остатка. Они содержат по одному остатку триптофана и четыре остатка полуцистина. Два дисульфидных мостика (в соматотропине человека между остатками Цис54-Цис165 и ЦИС182-ЦИС189) формируют две петли полипептидной цепи - большую, включающую центральный участок аминокислотной последовательности, и малую на С-концевом участке.

     Пространственная  структура соматотропинов характеризуется высокой степенью упорядоченности. Высокое содержание в составе соматотропинов нелолярных аминокислот обуславливает их большую склонность к образованию в растворе димеров и более крупных агрегатов [5].

     Отмечая в целом эволюционную консервативность соматотропина в ряду млекопитающих, которая сочетается с консервативностью его биологической функции, следует сказать, однако, что в этом ряду несколько особняком стоит соматотропин человека. Сохраняя схему строения, общую для других млекопитающих, гормон человека отличается аминокислотной последовательностью от изученных соматотропинов животных на 34-35%. Этим может объясняться неэффективность соматотропинов животного происхождения как стимуляторов роста при введении людям.

     Вместе  с тем при сравнении аминокислотных последовательностей соматотропинов человека и различных животных во всех этих белках легко выявляются участки, почти идентичные по структуре. Высокая эволюционная консервативность отдельных участков полипептидной цепи может свидетельствовать об их принципиально важной функциональной роли как носителей информации о специфической функции гормонального белка.

     Гормон  роста, или соматотропный гормон (СТГ), продуцируется специализированными  клетками гипофиза - соматотрофами. Содержание соматотропного гормона в одном гипофизе человека составляет около 5 мг и по крайней мере на порядок превышает содержание других гормонов.

     Биосинтез и секреция соматотропного гормона  находятся под сложным контролем, включающим регуляцию в первую очередь  гипоталамическими факторами: ингибирующую регуляцию соматостатином и стимулирующую СТГ-рилизинг фактором, а также гормонами - трийодтиронином и глюкокортикоидами, опиоидными пептидами и т.д.

     Секреция  соматотропного гормона зависит  также от концентрации в плазме крови  метаболитов, в регуляции обмена которых участвует СТГ, увеличивается  в условиях дефицита энергетических субстратов, а также во время сна  и в стрессовых ситуациях.

     Продуцируемый гипофизом соматотропный гормон отличается высокой гетерогенностью, являющейся результатом как альтернативного сплайсинга мРНК соматотропного гормона, так и посттрансляционных модификаций - протеолиза, фосфорилирования, гликозилирования, димеризации и олигомеризации. При стимуляции секреции гормона все эти формы высвобождаются из гипофиза в циркуляцию и через 30 мин более 50% соматотропного гормона присутствует в плазме крови в мономерной форме, 27% - в димерной и менее 20% - в олигомерной.

     Среди мономерных форм соматотропного гормона доминирует 22 кдальтон СТГ (83%), в меньших количествах присутствует 20 кдальтон СТГ (11%) и около 6% составляют различные кислые формы гормона. Таким образом, реакция организма на соматотропный гормонаявляется результатом суммарного действия белков, несколько различающихся по физико-химическим, биологическим и иммунологическим свойствам [1].

     Технология  получения гормона  роста. Несмотря на большой прогресс, достигнутый в исследовании соматотропных гормонов человека и животных, механизм их действия на молекулярном уровне изучен недостаточно. Отсутствие данных о точной пространственной структуре гормонов этой группы затрудняет исследования их взаимодействия с рецепторами, ограничивает возможности изучения структурно-функциональных взаимоотношений различных участков полипептидной цепи, не позволяет в полной мере использовать достижения белковой инженерии для создания аналогов соматотропинов.

     Рекомбинантный соматотропин, получивший название соматрем, стал вторым биосинтетическим фармацевтическим препаратом. СТГ, биологически чистый и свободный от вирусных загрязнений, впервые был получен в 1980 году фирмой «Genentech». Гормон, синтезированный в генетически сконструированных клетках кишечной палочки, отличается от гормона, выделенного из гипофиза, дополнительным остатком метионина на NН₂ – конце молекулы.

     На  первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединяли, затем «подстроили» к паре промоторов (промотор – специфическая последовательность в ДНК, необходимая для инициации транскрипции РНК-полимеразы) и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 млг на 1 мл культуры E.cjli (100000 молекул гормона на клетку). СТГ, синтезированный в бактериях, обладал нужной м.м. и не связан с каким-либо бактериальным белком, от которого его необходимо было отщеплять.

     Изменяя аминокислотную последовательность СТГ  посредством модификации кодирующего  его гена, в бактериальных клетках  можно синтезировать аналоги гормона, очень важные для изучения активных участков молекулы и этиологии карликовости на молекулярном уровне.

     Используя методы рекомбинантных ДНК, можно синтезировать и другие факторы роста и факторы дифференцировки тканей, выделив вначале их мРНК, затем получив соответствующие гены. Это относится к соматомедину А, стимулирующему фиксацию серы в хряще, образование которого индуцируется соматотропином.

     В 1982 году выделен и синтезирован полипептид, содержащий из 44 аминокислотных остатков, обладающий полной биологической активностью  гипоталамического ризилинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение СТГ-РФ способно компенсировать недостаток соматотропина. Примнение СТГ-РФ возможно не только для лечения гипофизарной карликовости, но и при некоторых формах диабета и для ускорения регенерации тканей у людей, получивших сильные ожоги.

     Весь  технологический цикл состоит из пяти функционально различных этапов:

     1) ферментация;

     2) первичная очистка белка;

     3) хроматографическая очистка;

     4) изготовление лекарственной формы;

     5) анализ качества субстанции и  лекарственной формы соматогена.

     Важной  особенностью технологического процесса является обеспечение апирогенности при проведении хроматографической очистки белка.

     Неотъемлемой  составной частью каждого технологического цикла промышленного производства является проведение сложного комплекса  анализов качества продукта. В основе объема и номенклатуры этих анализов лежат соответствующие рекомендации ВОЗ.

      Производство инсулина 

     Инсули́н (от лат. insula — остров) — гормон пептидной природы, образуется в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Оказывает многогранное влияние на обмен практически во всех тканях.

     Основная  функция инсулина – обеспечивать проницаемость клеточных мембран  для молекул глюкозы. В упрощенном виде можно сказать, что не только углеводы, но и любые питательные  вещества в конечном счете расщепляются до глюкозы, которая и используется для синтеза других содержащих углерод молекул, и является единственным видом топлива для клеточных энергостанций – митохондрий. Без инсулина проницаемость клеточной мембраны для глюкозы падает в 20 раз, и клетки умирают от голода, а растворенный в крови избыток сахара отравляет организм.

     Нарушение секреции инсулина вследствие деструкции бета-клеток — абсолютная недостаточность инсулина — является ключевым звеном патогенеза сахарного диабета 1-го типа. Нарушение действия инсулина на ткани — относительная инсулиновая недостаточность — имеет важное место в развитии сахарного диабета 2-го типа.

     История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 века), доказавшего, что уровень  сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной  железы.

     В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной  железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом. результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.

     После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько  лет пройден огромный путь его  выделения и очистки. В результате гормон стал доступен для больных  сахарным диабетом 1 типа.

     В 1935 году датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат.

     Первые  кристаллы инсулина были получены в 1952 году, а в в1954 году английский биохимик Г.Сенджер расшифровал структуру инсулина. Развитие методов очистки гормона от других гормональных веществ и продуктов деградации инсулина позволили получиь гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным.

     В начале 70-х г.г. советскими учеными А.Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина, однако осуществление данного синтеза в промышленном масштабе было дорогостоящим и нерентабельным.

     В 80- годах достижения молекулярной биологии позволили синтезировать с помощью  E.coli обе цепи человеческого инсулина, которые были затем соединены в молекулу биологически активного гормона, а в Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli.

     Использование аффинной хромотографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител.

     Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется  и независимо от формы препарата  имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногены, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.

     Типы  препаратов инсулина. Препараты инсулина отличаются друг от друга по степени очистки; источнику получения (бычий, свиной, человеческий); веществам, добавляемым к раствору инсулина (удлиняющим его действие, бактериостатикам и т.д.); концентрации; величине рН; возможности смешивания ИКД с ИПД.

     Препараты инсулина различаются по источнику  получения. Инсулин свиньи и быка отличается от человеческого по аминокислотному составу: бычий - по трем аминокислотам, а свиной - по одной. Неудивительно, что при лечении бычьим инсулином побочные реакции развиваются гораздо чаще, чем при терапии свиным или человеческим инсулином. Эти реакции выражаются в иммунологической инсулинорезистентности, аллергии к инсулину, липодистрофиях (изменении подкожножировой клетчатки в месте инъекции).

     Несмотря  на явные недостатки бычьего инсулина, он все еще широко используется в  мире. И все же недостатки бычьего  инсулина в иммунологическом плане  очевидны: его ни в коем случае не рекомендуется назначать больным впервые выявленным сахарным диабетом, беременным или для кратковременной инсулинотерапии, например в периоперационном периоде. Отрицательные качества бычьего инсулина сохраняются и при использовании его в смеси со свиным, поэтому смешанные (свиной+бычий) инсулины также не стоит использовать для терапии указанных категорий больных.

     Препараты инсулина человека по химической структуре  полностью идентичны человеческому  инсулину.

     Основной  проблемой биосинтетическиго метода получения инсулина человека является полная очистка конечного продукта от малейших примесей использованных микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности. Новые методы контроля качества гарантируют, что биосинтетические инсулины человека вышеперечисленных производителей свободны от каких-либо вредных примесей; таким образом, их степень очистки и сахароснижающая эффективность отвечают самым высоким требованиям и являются практически одинаковыми. Каких-либо нежелательных побочных действий, зависящих от примесей, эти препараты инсулина не имеют.

     В настоящее время в медицинской  практике используют инсулины трех типов:

     - короткодействующие с быстрым началом эффекта;

     - средней продолжительности действия;

     - длительного действия с медленным  проявлением эффекта. 

     Инсулин короткого действия (ИКД)– регулярный инсулин – представляет собой  короткодействующий растворимый при  нейтральном значении рН кристаллический цинк-инсулин, эффект которого развивается в течение 15 минут после подкожного введения и продолжается 5-7 часов.

     Первый  инсулин продленного действия (ИПД) был создан в конце 30-х гг., чтобы  больные смогли делать инъекции реже, чем это было при использовании  только ИКД, - по возможности один раз  в сутки. С целью увеличения длительности действия все другие препараты инсулина модифицированы и при растворении  в нейтральной среде образуют суспензию. Они содержат протамин в  фосфатном буфере – протамин-цинк-инсулин  и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) – НПХ-инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере – инсулины ультраленте, ленте, семиленте.

     Препараты инсулина средней продолжительности  действия содержат протамин, представляющий белок средней м.м. 4400, богатый аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1:10. после подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин, позволяя инсулину всасываться.

     НПХ-инсулин не изменяет фармакокинетический профиль смешиваемого с ним регуляторного инсулина. НПХ-инсулин предпочтительнее инсулина ленте в качестве компонента средней длительности действия в терапевтических смесях, содержащих регулярный инсулин.

     В фосфатном буфере все инсулины легко  образуют кристаллы с цинком, но только кристаллы бычьего инсулина обладают достаточной гидрофобностью, чтобы обеспечить замедленное и  стабильное высвобождение инсулина, характерного для ультраленте. Цинковые кристаллы свиного инсулина растворяются быстрее, эффект наступает раньше, длительность действия короче. Поэтому не существует препарата ультраленте, содержащего только свиной инсулин. Монокомпонентный свиной инсулин выпускают под названием инсулин-суспензия, инсулин-нейтрал, инсулин-изофан, инсулин-аминохинурид.

     Инсулин ленте – это смесь 30% инсулина семиленте (аморфный преципитат инсулина с ионами цинка в ацетатном буфере, эффект которого развеивается относительно быстро) с 70% инсулина ультраленте (плохо растворимый кристаллический цинк-инсулин, имеющий замедленное начало и пролонгированное действие). Эти два компонента обеспечивают комбинацию с относительно быстрой абсорбцией и стабильным длительным действием, делая инсулин-ленте удобным терапевтическим средством.

     Технология  получения инсулина. Инсулин человека можно производить четырьмя способами:

     1) полным химическим синтезом;

     2) экстракцией из поджелудочных  желез человека (оба этих способа  не подходят из-за неэкономичности:  недостаточной разработанности  первого способа и недостатка  сырья для массового производства  вторым способом);

     3) полусинтетическим методом с  помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин;

     4) биосинтетическим способом по  генноинженерной технологии. Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.

     В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами: модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом и генно-инженерным способом.

     Инсулин оказался первым белком, полученным для  коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.

     В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение  обеих цепей с последующим  фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

     Во  втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона. Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

     При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать:

     - белок носитель, обеспечивающий  транспортировку гибридного белка  в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;

     - аффинный компонент, существенно  облегчающий выделение гибридного  белка.

     При этом оба эти компонента могут  одновременно присутствовать в составе  гибридного белка. Кроме этого, при  создании гибридных белков может  использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.

     В Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.

     Химическим  способом получают ген, программирующий  биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие  в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина.

     Следующий этап – включение гена предшественника  инсулина (или гены цепей порознь) в геном E.coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия.

     Из  E.coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы E.coli). В результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку. В бактериях синезируется около100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

     Природа гормонального вещества, продуцируемого E.coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препитида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин.

     Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок  подвергают химко-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фпрнтальной, гельпроникающей, анионообменной).

     В Институте РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitroосуществляется в той же последовательности, что и in vivо – отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

     Можно использовать штамм со встроенной в  плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus.

     Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.

     Возможен  и другой путь: получается в бактериальной  системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяют, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом.

     Выделенный  белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.