Ферменттік препараттарды алу

Ферменттік препараттарды алу

Жоспар

1.      Кіріспе

Ферменттік препараттарды алу

2.      Ферменттердің техникалық препараттары

3.      Саңырауқұлақ уыты

4.      Субтилин

5.      Глюкоамилаза

6.      Целлолитикалық ферменттік препараттар

7.      Ферменттерді бөліп алу және тазалау

8.      Ферменттердің және микроорганизмдердің тұтач жасушаларын иммобилизациялау

9.      Қорытынды

Ферменттік препараттарды алу

  Ферменттік препараттарды алу үшін микроскопиялық саңырауқұлақтарды, сондай-ақ бактериялар мен ашытқыларды пайдаланады. Кейде техникалық ферменттік препараттарды алу ферментация процесін жүргізумен аяқталады. Мысалы, спирт өнеркәсібінде крахмалды қанттандыру үшін aspergillus niger сұйық культурасын қолданады, ол крахмал(1%) мен түрлі тұздар қосу арқылы спирттік бордта тереңдік культивирлеу әдісімен өсіріледі. Кейін оны сұйық күйде 10-12% мөлшерде қанттандырылатын заторға қосады. Бірақ культуральды сұйықтықтағы ферменттердің белсенділігі тез төмендейді. Сондықтан құрғақ техникалық ферменттік препараттарды алу кең таралған.

Ферменттердің техникалық препараттары

  Кешенді амилолитикалық ферменттік препаратты қатты қоректік ортада көгерткіш саңырауқұлақтарды өсіріп, одан кейін алынған массаны кептіру және ұсақтау арқылы алады. Ферменттік белсендірек препаратын культуральды сұйықтықтан амилазаны ацетонмен тұндырып, одан кейін коагулятты 27-28˚С температурада кептіру арқылы бөліп алуға болады. Ферментті тұндыру үшін аммоний сульфатын жиі қолданады. Культуралды сұйықтықты алдын ала құрғақ заттардың мөлшері 40% жеткенше 40˚С температурада кептіріп алады. Коагулятты толықтырғышпен бірге кептіреді. Японияда тағамдық қажеттіліктер үшін ерекше крахмалмен өңделген культуралды сұйықтықтан ферментті адсорбциялау арқылы алынған амилазаның техникалық препаратын пайдаланады. Содан кейін амилазаны крахмалмен бірге лиофилизациялайды.

  Құрамында пектиназа болатын препаратты лимон қышқылы өндірісінің қалдықтары –aspergillus niger мицелийінен алады. Ол үшін оны кептіреді немесе экстракттан мицелийдің ақуызды фракциясын коагуляциялайды. Бұл препаратты жемістер мен жидектерді өңдеген кезде шырындарды ашық түстендіру және олардың шығымын арттыру үшін қолданады.

  Саңырауқұлақ уыты. Соңғы жылдары Кеңес Одағында құрғақ амилолитикалық ферменнттерді спирттік және сыра қайнату өнеркәсіптерінің және мал шаруашылығының қажеттіліктеріне пайдаланылады. Бұл препаратты жиі «саңырауқұлақ уыты»  деп атайды. Саңырауқұлақ уытын алу үшін таза культураны колбаларда, одан кейін кюветтерде көбейтеді. Бұл деңгейде қоректік ортаны стерильді бидай кебегінен дайындайды (0,1 MПа қысымда бір сағат бойы автоклавтау). Кебектің ылғалдылығын 45%-ға жеткізеді және оны тұз немесе күкірт қышқылымен қышқылдандырады. Суытқаннан кейін ылғалды кебекке таза культураны егіп, 30˚С температурада 3-4 тәулік бойы споралардың интенсивті түзілу кезеңіне дейін өсіреді. Кюветтерде таза культураны 32-33˚С температурада 10-12 сағаттан кейін 27-28˚С температурада толық споруляцияға дейін өсіреді. Таза культураны жақсырақ сақтау үшін  кюветтерде ылғалдылығы 20-25% болғанша, 40˚С теператураға дейін қыздырылған стерильді ауамен үрлеу арқылы кептіреді. Мұндай культураны 2 аптаға дейін сақтауға болады. Процесті ары қарай  жалғастыру үшін таза культура өңделетін кебек көлемінен 0,3% көлемінде керек.  

  Ферменттік препаратты беттік культивирлеу әдісімен алу технологиясы 1-ші суретте көрсетілген.  Басты ферментацияда қолданылатын кебектерді стерилизациялау үшін араластырғыштары, бу ағыны және салқындатқыш қондырғылары бар арнайы аппараттар пайдаланылады. Кебекті салқындату үшін стерильді ауа қолданылады. Алдымен люк арқылы аппаратқа кебекті енгізеді, кейін біртіндеп алдын-ала сумен сұйытылған 0,2% формалин(кебек мөлшерінен)қосады. Араластырғыштарды іске қосып, буды жібередіжәне 100-105˚С температурада кебекті 50-60 минут бойы стерилизациялайды. Содан соң аппараттың қаптамасы арқылы сумен жіне ауамен 37˚С температураға дейін салқындатылады. Массаның ылғалдылығын салқындатылған қайнаған сумен 56-58%-ке жеткізеді, таза культураны қосады да, жақсылап араластырады. Кюветалардың өлшемдері 0,5м2, бүйір қабырғасының биіктігі 25мм. Кюветалар перфорирленген  жасалады, тесіктердің өлшемдері 1,5×20мм. Камераға кюветаларды салудың алдында оны немесе бөлмені 8 сағат бойы бумен және формалинмен стерилизациялайды, содан соң 3-4 сағат стерильді ауамен желдетеді.

  Көгерткіш саңырауқұлақтарды өсіру екі кезеңде іске асады. Алғашқы 8-10 сағатта 32-33˚С температура, төмен аэрация және ауаның салыстырмалы ылғалдылығы 32-93%-дан аз емес жағдайда споралары ісініп өсе бастайды. Екінші кезеңде амилозаға бай мицелий түзіледі. Бұл кезде температураны 26-28˚С дейін төмендетеді, ауаны ылғалдандырып(96-100%), ауа алмасуын күшейтеді. Ауа барлық кюветаларға біркелкі беріліп отыруы маңызды. Ауа ағынының оптимальды жылдамдығы 1-1.5м/с. Ауа шығынын төмендету үшін таза ауаның 5-6%-ын ғана жіберіп, рециркуляциясын пайдаланады. 24-36 сағаттың ішінде кебектің беті ақ, ұлпа мицелийімен жабылады, массаның ылғалдылығы 38-40%.

Өсірілген мицелийді ауамен кептіріп(40-45˚C температурада), ұсақтауға жібереді. Содан соң препарат барабанды немесе басқа жіпті кептіргішке кептірілуге жіберіледі, мұнда оны 85-90˚С температурада 10-14% ылғалдылыққа дейін құрғатады. Кептіру кезінде материал температурасы 45-60˚С аспау керек. Құрғақ препаратты 25-40кг қаптарға салады.

   Aspergillus awamori культурасы препаратының амилолитикалық белсенділігі 10-14бірлік/г, декстринолитикалық белсенділігі 300-350бірлік/г, мальтазалық белсенділігі-180-200бірлік/г. Амилолитикалық белсенділік(АС) бірлігіне t=30˚C жағдайда бір сағат ішінде фосфодекстриндерден 1мг мальтозалардың түзілуін катализдеуге қабілетті фермент мөлшері сәйкес келеді. Декстринолитикалық белсенділік(ДС) бірлігіне 50˚С температурада және рН=4,5-5,0 болған жағдайда бір сағат ішінде фосфодекстриндерден 1мг мальтозалардың түзілуін катализдеуге қабілетті фермент мөлшері қабылданады.

  Субтилин. Протеолитикалық және амилолитикалық ферменттердің кешенін bacillus subtilis культурасының көмегімен алады. Олар аэробты, грамм оң, қозғалғыш, эндоспоралар түзетін таяқшалары. Бұл бактерияларға гидролитикалық ферменттердің өте бай кешені тән. Қоректену көзі ретінде олар ақуыздар, көмірсулар,спирттер және органикалық қышқылдарды пайдалана алады. Bacillus subtilis культурасын кебекте,сондай-ақ сұйық орталарда(ерекше құрамды) сәйкесінше беттік культивирлеу және терең культивирлеу әдістерімен культивирлейді.

  Культураны өсірудің беттік әдісінде процесс 30немесе 37˚С температурада 2-3тәулік жалғасады. Бұл кезде bacillus subtilis құрғақ препаратының амилолитикалық белсенділігі(АС) 150 бірлік/г төмен емес,ал протеолитикалық белсенділігі 6 бірлік/г аз емесболуы керек. Протеолитикалық белсенділік бірлігі 40˚С температурада және 7,0-7,3 РН мәнінде 1 сағат ішінде ақуыздардан 1мг аминдік азоттың түзілуін катализдейтін ферменттің мөлшерін сипаттайды.

  Bacillus subtilis терең ферментациясы үшін ортаны жүгері ұнының негізінде дайындайды. Ферментация басында РН*тың мәні 7,0-7,8, ал аяғында 6,5-6,9 болуы керек. Аэробты жағдайда екі тәулік ішінде амилазалар мен протеазалардың максималды мүмкін мәнінен 90%*ға жуығы синтезделеді. Ферментация аяқталған кезде культуральді сұйықтықты вакуумда 28˚С температурада буландырады, содан соң келіп түсетін ауаның температурасы 140-150˚С болатын шашыратқыш типті кептіргіштерде кептіреді. Ылғалдылығы 4-10% , протеолитикалық және амилолитикалық белсенділігі өте жоғары ұнтақ  тәрізді өнім алады.

  Глюкоамилаза.  Бұл фермент крахмалды глюкозаға дейін ыдыратады, сондықтан негізінен глюкоза өндірісі үшін пайдаланылады. Латв КСР ғылым академиясының А.Кирхенштейн атындағы микробиология институтында глюкоамилазаның техникалық және азықтық препаратын endomycopsis fibuliger ашытқыларының көмегімен алу әдісі дайындалды. бұл культура көміртек көздері ретінде крахмал(0.5-1%) және ашытқылық автолизат (10-25мл/л) қолданылатын Ридер ортасында ұзындығы 5,5-12мкм және диаметрі 4,8-6,0мкм жасушалар түзеді. Интенсивті араластыру болмаған жағдайда культура тармақталған мицелий түзеді. Культура азот көзі ретінде жасушалар жақсы ассимиляцияламайтын нитраттар мен несепнәрге қарағанда аммоний тұздарын жақсы пайдаланады. Endomycopsis fibuliger көміртек көзі ретінде крахмал, мальтоза, лактоза, фруктоза, этанолды жақсы пайдаланады; глюкоза, сахароза, парафиндерді-әлсіз; ал органикалық қышқылдарды мүлдем пайдаланбайды.

Ферментация процесі endomycopsis fibuliger R313 культурасын интенсивті аэрация жағдайында өсіруге келіп соғады. Ферментацияны культуралды ортаның жалпы мөлшерінен ингредиенттердің мөлшері келесідей болатын (массалық %-бен) қоректік ортада жүргізеді.

Ферментация процесін ортаның температурасы 34˚С, РН-7,5-8,0 немесе араластырғыштың 350-52 айн/мин айналу жиілігінде жүргізеді. Процесті бақылау үшін өсудің әрбір 3-4 сағаты сайын сынама алып отырады. Ортаның РН-ын, глюкоамилазалық белсенділігін, тереңдік культураның 100мл-гі биомасса мөлшері г-мен, микроскопиялық түрде жасушалардың жағдайы мен ботен микрофлораның болмауын анықтайды. Максималды глюкоамилазалық белсенділікке жеткен кезде процесті тоқтатады.

  Ферментация процесін ағынды режимде жүргізу мүмкіндігі көрсетілген. Endmycopsis fibuliger –мен үздіксіз әдіс бойынша жұмыс істеген кезде гомогенді хемостаттың динамикалық тепе-теңдігін D 0,10-нан 0,27сағ минус бір дәрежесіне дейін болған кезде анықталады және бұл кезде глюколипаза түзілуінің максималды меншікті жылдамдығы Kv=5.7г О2/л сағ болғанда, D=0,2сағ минус бір дәрежесі кезінде байқалады.

  Периодты және ағынды endomycopsis fibuliger R313 культурасының салыстырмалы бағалануы мына бірінші кестеде көрсетілген.ы

Кесте-1. Endomycopsis fibuliger R313 ашытқысын периодты және үздіксіз культивирлеу кезіндегі бірнеше физиологиялық және экономикалық көрсеткіштері

Ағынды режимде биомасса бойынша культураның өнімділігі 17есе және өнім бойынша 6есе периодты прцестің өнімділігімен салыстырғанда жоғары. Ферментация уақытында глюкоамилазаның белсенділігі 50-80 бірлік/мг дуйін жоғарылайды. Глюкоамилазалық белсенділікті (ГБ) глюкооксидазалық әдіспен анықтаған кезде белсенділік бірлігі ретінде еритін крахмалдан 1сағат ішінде 30˚С температурада 1мг глюкозаның түзілуіне әкелетін фермент мөлшерін қабылдайды.

   Содан кейін тереңдік культура жинағыштарға түседі, одан вакуум-буландырғыш аппаратқа барады, мұнда 34-40˚С температурада көлемі бойынша шамамен 10есеге буланып кетеді. Культуралдық сұйықтықтың концентратына концентраттағы құрғақ заттардың құрамына 100%мөлшерде NaCl толықтырғышын енгізеді. Кептіруді 130-150˚С, кептіргіштен шығарда 60-70˚С температурада жүргізеді. Алынған өнім толықтырғыштар қосу арқылы стандартталады, бөлінеді және қапталады.

   Культуралды сұйықтықтан глюкоамилазаның тазаланған ферменттік препаратын бөліп алуға болады. Бұл жағдайда культивирлеу процесі аяқталған соң тереңдік культурадан сепараторда немесе барабарды вакуум-фильтрде биомассаны бөліп алады. Биомассадан бөлінген культуралдық сұйықтық аралық жинағышқа жиналады да, одан вакуум-буландырғыш аппаратқа жіберіледі. Тұндыру үшін концентрациясы 96,0-96,5%көлемдегі этил спиртін пайдаланады. Тұндыру алдында концентратты 5˚С температураға дейін салқындатады. Тұндыруды тұрақты араластыра отырып, тұндырғышта, спирттің төрт көлемімен (қоспадағы концентрациясы 77%) немесе 0,7 қанығуда аммоний сульфатымен жүргізеді.

  Алынған тұнбаны ылғалдылығы 8-12% болғанша кептіріп шарлы диірменде ұнтаққа айналдырады.

  Целлолитикалық ферменттік препараттар. Кейбір елдерде беттік әдіспен, негізінен Trichoderma viride саңырауқұлағының культурасын пайдаланып целлюлозаларды өсіру жолға қойылған. Қазіргі кезде әлемдік тәжірибеде тереңдік культуралардан целлюлозалар алу әдістері көміртек көздері ретінде тазаланған целлюлозаны немесе құрамында целлюлоза бар табиғи субстраттарды пайдаланатын қоректік ортада целлюлозалардың редуцент-микроорганизмдерін өсіруді қарастырады. Бірақ ортаның негізгі компоненті ретінде табиғи целлюлозаны пайдаланатын тереңдік целлюлоза алу бірқатар технологиялық қиындықтарға әкеледі. Ал ферментация үшін тазаланған целлюлозаны пайдалану экономикалық жағынан тиімсіз. Құрамында еритін «индуктор» болатын қоректік ортаны пайдалану рационалды шешім болып табылады. Мұндай қоректік орта қызметін сүт өнеркәсібінің қосымша өнімі-сүт сарысуы атқара алады, оның негізгі компоненті лактоза болып табылады. БКСР ҒА-ның микробиология институты және Латв КСР ҒА-ның А.Кирхенштейн атындағы микробиология Институты целлюлолитикалық ферменттердің препараттарын алу технологиясын дайындады. Алдын ала сүт сарысуынан ақуызды бөліп алады.

   Продуцент ретінде БКСР ҒА-ның микробиология Институтында бөлініп алынған Trichoderma lignorum ОМ534 саңырауқұлағын қолдануға болады, ол құрамында целлюлоза бар табиғи субстраттарды ыдыратуға қажетті целлюлолитикалық ферменттердің  толық кешенін (С1, С2, Сх компоненттерді де қоса алғанда) алуға мүмкіндік береді. Егу материалы ретінде орта көлемінің 5% мөлшерінде енгізілетін 1-2 тәуліктік мицелий немесе споралар өлшендісі қолданылады. Ортаның құрамы келесідей: құбыр суымен 3есе сұйылтылған ашық түстендірілген сүт сарысуы, NaNO3-0.3%, (NH4)2SO4-0.06%, MgSO4*7H2O-0.05%.  Культивирлеудің  оптимальды температурасы 29˚С.

Кесте-2. Аэрация ортасының ферментатордағы целлюлазаның биосинтезіне әсері

2-ші кестеден көрінетіндей, целлюлаза синтезі ортаның бір көлеміне бір көлем ауа жіберген  кезде ең белсенді деңдейде жүреді(араластырғыштың айналу жиілігі 280 айн/мин).

  Ферментация ұзақтығы (культуралды сұйықтықтағы целлюлазалардың максимал белсенділігіне жету уақыты) 60-62 сағатты құрайды.

   Сүт сарысуы бар ортада T.lignorum целлюлазасы синтезінің өзіндік ерекшелігі культуралды сұйықтықта 36-54сағ интервалында ферменттердің белсенді жиналуі және келесі сағаттарда белсенділіктің өте тез төмендеуі болып табылады. Культуралды сұйықтықтағы целлюлоза жиналуының максимумы уақыт бойынша орта лактозасын максималды тұтынумен және 7,6-7,8 РН-пен сәйкес келеді. Бұл кезде ферменттің белсенділігі 3,0-3,С2 бірлік/мл; биомасса концентрациясы 10-12г/л, ақуыз мөлшері 1,1мг/мл және культуралды сұйықтықтағы редуцирлеуші қанттардың мөлшері 0,1% .

   Содан соң, бірнеше сағаттың ішінде (орташа 2-4) РН-тың 8,0-8,1-ге дейін жоғарылауы және целлюлаза белсенділігін 2есе бірден төмендеуі байқалады. Ферментацияның аяқталғанын  7,8РН және тығыз сары түсті мицелийдің сыртқы түрі мен түссіз культуралды сұйықтық бойынша білуге болады. РН-тың 8,0 және одан да жоғары көтерілуі мицелий автолизінің болжауымен және культуралды сұйықтықтың лайлануымен бірге өтеді. Ферментация аяқталған соң бірнеше сағатта культуралды сұйықтыұтағы целлюлазалардың белсенділігінің бірден төмендеп кетуі ортада сарысу ақуыздарының болуы есебінен түзілетін протеолитикалық ферменттердің әсерінен болатын сияқты.

  Культуралды сұйықтықтан целлюлазаларды тұндыруды ацетонмен, изопропанолмен және желатин қосылған танинмен іске асыруға болады. Ацетон, изопропонол мен этанолды пайдаланған кезде культуралды сұйықтықтың көлеміне тұндырғыштың үш көлемін қосу керек. Ортаның бастапқы рн 7,6-7,8, температурасы 10-15°С. Тұнбаны тұндырғышты қосқаннан кейін 20-30 минут өткен соң бөліп алады.

  Аммоний сульфатымен өңдеуді 80% қанығуда, ортаның бастапқы рн 7,8 және температурасы 10-15°С жағдайда жүргізу қажет. Тұнбаны 3000-4000 айн/мин кезінде 10-15 минут бойы центрифугирлеу арқылы бөледі. Ферменттік тұнбаны меофильді немесе вакуум астында, 10-12% қалдық ылғалдылыққа дейін 25-30°С температурада кептіреді.

Целлюлазаларды түрлі тұндырғыштармен бөлу нәтижелері 21- кесте

  Целлюлазаларды түрлі тұндырғыштармен бөлу нәтижелері 21- кестеде көрсетілген.Одан белсенділігі мен шығындылығы бойынша жоғарғы көрсеткіштерге сульфатпен және танинмен тұндырылған препараттар ие екені көрінеді. Бірақ сульфатпен тұндырылған препарт жоғарырақ меншікті белсенділікке ие, препараттың ең жақсы үлгілері келесі көрсеткіштерді көрсетті: с1 – 1000 бірлік/г, с2 – 800 бірлік/г, сх - 1000 бірлік/г (целлюлолитикалық ферменттердің белсенділігі Mandels, Weber бойынша бірліктерде берілген.

    Культуралды сұйықтықтан целлюлазаларды биомассамен бірге тұндырғанда препараттың шығымы орташа 10 есе өсті, бірақ белсенділігі төмендеді.

   Культуралды сұйықтықтан целлюлозаны бөліп алудың сульфат-изопропилді әдісін пайдалану жақсы нәтиже береді. Целлюлолитикалық ферменттерді бөлудің оптимальді жағдайлары келесідей: температура 4-150С, культуралды сұйықтықтың бастапқы рн-7-8, аммоний сульфатымен өңдеу ұзақтығы 12-16 сағат, изопропональды концентрациасы 10%. Бұл кезде ферменттің белсенділігі бойынша шығымы 75-80% құрайды, ал алынған ферменттік препараттың белсенділігі с1 – 1000, с2 – 1130 және сх – 3900 бірлік/г құрайды. Препараттың минимальды тұрақтылығын қамтамасыз ететін кептіру түрі салыстырмалы төмен температурадағы миофильді немесе вакуумдық кептіру болып табылады.

Ферменттерді бөліп алу және тазалау.

   Жасуша цитоплазмасында еріген ферменттер одан сумен немесе тұздардың сұйытылған ерітінділерімен оңай экстракцияланады. Содан кейін бұл ферменттерді аммоний сульфатымен фракционирлеу арқылы тазалайды және бір-бірінен бөліп алады.

   Жасушаның құрылымдық элементтерімен байланысқан ферменттерді дезинтеграциадан, яғни жасуша қабықшасын бұзудан кейін ғана бөліп алуға болады. Жасушаларды уатып, қатырып және қайтадан ерітіп, ультрадыбыстың әсеріне ұшырату арқылы механикалық жолмен және арнайы ферменттік препараттарды пайдаланып ферментативтік жолмен бұзуға болады.

   Жасушаларды бұзу үшін алдымен биомассаның құрамында қандайда бір буфер, этилендиаминтетра сірке қышқылы және альбумин болатын сахарозаның децимолярлы ерітіндісіне (рн-7,3) жуады. Содан сон шыны микрошарларды қосады да, 13000 айн/мин жиілікте дезинтеграторда гомогенизациялайды. Жасуша қабықшаларын және шыны микрошарларды центрифугалау арқылы бөліп алады.

   Егер фермент суда ерімейтін липопротеидті кешендердің құрамында болса, онда ферментті ерітінді көлемінің 3-6% мөлшеріндегі бутил ерітіндісінің көмегімен ерітіндіден липиттерді бөліп алады. Фермент сулы қабатта қалады, ал липиттер бутил спиртінің қабатына ауысады.

  Ферменттер ерітінділерін концентірлеуге ең алдымен балластық белоктардан құтылу арқылы қол жеткізіледі. Егер фермент  термотұрақты болса, мысалы рибонуклеаза, онда белоктардан ерітіндіні қыздыру арқылы құтылады. Кейде белоктарды қышқылдармен денатурациялау немесе ферменттік ерітіндіге хлороформмен немесе хлорофильмен спирттің қоспасымен томен температурада әсер ету арқылы жояды.

   Балластық белоктардың бір бөлігін жойған соң одан кейінгі ферменттерді концентірлеу үшін тұздар ерітінділерімен, мысалы аммоний сульфатымен фракционирлеуді пайдаланады.Бұл жағдайда Белсенсіз белоктар коагуляцияланатын, ал белсенді фермент ерітіндіде қосатын тұздар концентрациясын концентрациясын анықтау керек. Тұнбаны центрифугалау арқылы бөліп алады және насадкасы сұйықтықты лиофильдендіруден кейін ферменттік препарат алады.

  Белокатар коагуляциясы мен ферменттерді тазалау үшін сондай-ақ органикалық еріткіштер- ацетон, этил спирті, метил спирті, диоксан қолданылады.

  Ферменттік тазалаудың преспективті әдісі селективті немесе таңдамалы адсорбция болып табылады, мұнда ферменттік ерітіндіге аз мөлшерде каолин, кальций үшфосфаты, аммоний гидрототығы және де басқа адсорбенттер қосылады. Осылайша белсенді ферменттің немесе балластық белоктардың адсорбциясын жүзеге асырады. Бөлу центрифугалаумен бірге жүргізіледі. Адсорбенттен ферментті элюирлеу үшін фосфатты буфер ерітіндісін пайдаланады. Егер ферменттік ерітіндіде бейорганикалық тұздар көп болса, адсорбцияның алдында диализ немесе сефадекс арқылы ерітіндіні фильтрлеуді жүргізеді.

  Құрамында физико-химиялық қасиеттері бойынша ферментке ұқсас белоктар қоспасының біршама мөлшері болатындықтан, ферменттік препаратты ион алмастырғыш хромотография әдісімен тазалайды. Ион алмастырғыш процесінде белоктар ионитпен әрекеттеседі де, электро культуралды сұйықтықтан электростатикалық әсерлеудің көмегімен оның бетімен байланысады. Ионит бетінен белоктарды элюирлеу үшін буфер иониті арқылы өткізілетін рН кезінде концентрациясының өзгеруін немесе бейтарап тұздарды енгізуді (NaCl, KCl) қолданады.

  Соңғы уақытта ферменттерді бөлу үшін целлюлоза негізіндегі иониттерді кең пайдаланады.

  Белоктарды ақырғы фракционирлеу  үшін сондай- ақ электофорезді де қолданады,оның негізінде электр өрісінде белоктардың қышқыл және негізді молекулаларының зарядтары бойынша бөлінуі жатыр. Ерітіндіден жоғарғы дәрежеде тазаланған ферменттерді кристал түрінде де алуға болады. Ферменттер кристаллизация сын аммоний сульфаты , спирт немесе органикалық еріткіштер ерітінділерінен жүргізеді. Ферменттің концентрлі ерітіндісіне аздап, лайлап бастағанша, тамшылатып абайлап, аммоний сульфатф немесе спирттің қаныққан ерітіндісін қосады. Содан соң ерітіндіні суық жерге бірнеше күнге қояды. Алынған кристалдарды бөліп, фермент белсенділігінің өсуі тоқтағанша қайта крисаллизациялауды жүргізеді.

  Ашытқылардың биомассасы НАД  (никотинамидадениннуклеотид) коферментіне бай. Биохимиялық зертханаларда жұмыс істеуге қажет НАД препаратын нан пісіретін ашытқылардың экстрактынан алуға болады. Экстракцияны сумен (82-85%) аэросил А- 300 препаратының қатысында жүргізеді. Содан соң 25-300 С температураға дейін салқындатылған, рН 6,0-6,1 болатын фильтратты КУ- 23 (Н+ - форма) ион алмастырғыш шайырлар арқылы өткізеді. КАД-ты 0,005н тұз қышқылымен элюирлейді. Алынған элюатты АН-231 (Cl-  -форма) бар колонка арқылы тағы өткізіп, содан соң дистелденген сумен элюирлейді.  Ары қарай тазалау үшін алынған НАД ерітіндісін КУ- 23 (Н+ - форма) бар колонка арқылы өткізедіжәне тек 0,1н аммоний ацетатты буфер ерітіндісімен (рН 5,8-5,9) элюирлеген соң ғана құрамында 95-99% пиридиндік коферменттер бар ерітінді алады, оның 62-65% НАД белсенді коферменті құрайды. Мұндай өңдеу кезінде НАД шығымы 50-60% құрайды.

Ферменттердің және микроорганизмдердің тұтач жасушаларын иммобилизациялау

Ферменттер биологиялық объектілерде көбінесе түрлі жасушалық құрылымдардың- жиі мембраналардың (жарғақ) бетінде бекітілген күйде болады. Осының әсерінен ферменттер өздерінің белсенділігін ұзақ уақыт сақтайды. Технологияда ұзақ уақыт бойы бос ферментердің препараттары қолданылады; мұндай күйде оларды пайдалану ұзақтығы қысқа болады- тек бір өндірістік цикл. Молекулалық биология жетістіктері көптеген ферменттердің құрылысын нақтырақ зерттеуге мүмкіндік береді. Ферменттік белоктардың бірқатарының аминқышқылдық құрамы, олардың кеңістік конфиграциясы ашылады, белсенді орталықтары, ферменттік каталитикалық белсенділігінің байқауында түрлі функционалды топтардың алатын орны анықталды және т.б. Бұл пролонгирленген (ұзақ) әсерлі ферменттер өндірісі үшін теориялық база құрылған мүмкіндік берді,оларды кейде иммобилизацияланған, фиксацияланған немесе байланған ферменттік препараттар деп атайды. Ферменттер иммобилизациясының мәні- оларды белсенді формада ерімейтін негізгі бекіту немесе жартылай өткізгіш мембраналық жүйеге орналастыру. Ферментті  тасымалдағышқа бекіту адсорбциялық жолмен, химиялық байланыспен немесе ферментті органикалық немесе бейорганикалық гельге (капсулаға және т.б.) механикалық жалғау жолымен іске асырылады және бұл кезде ферментті тек оның белсенді орталығына кірмейтін және фермент- субстратты кешенінің түзілуіне қатыспайтын функционалды топтар арқылы ғана бекітуге ғана болады. Ферментті тасымалдаушы немесе матрицадәнді материал, талшықты құрылым, иілгіш бет, қабыршық немесе маталар, ортасы бос талшықтар, құбырлар, капсулалар және т.б түрлерінде бола алады. Тасымалдағыш бөлшектерінің өлшемдері маңызды рөл атқарады. Үлкен бетке ие болу керек, сондықтан диаметрі 0,1-0,2 мм бөлшектерді қолдану ұсынылады. Фермент тасымалдағышы табиғи зат та, синтетикалық полимерде бола алады. Иммобилизация үшін целлюлоза мен оның туындыларын- қышқыл карбоксиметилцеллюлозаны, ацетилцеллюлозаны және т.б кең қоданады. Целлюлоза суда ісінеді және оның гидроксильді топтары фермент молекуласының белгілі бөліктерін қосып алады.Синтетикалық тасымалдаушылардан полимерлі ион алмастырғыш шайырлар түріндегі карбоксилді немесе сульфоксильді  хлоридтерді, диазотталған полиаминостеринді, метакрил қышқылының  нитратты сополимерлерін атауға болады.

  Ферменттің иммобилизациялау процесін глюкоамилазаның ацетилэтилцеллюлозаның тасымалдағышымен байланысында көрсетуге болады. Тасымалдағашты ісіну үшін тәулік бойына дистелденген суға салып қояды. Содан соң ісінген ацетилцеллюлозаға араластыру қатысында алдымен рН 5,5 болатын натрийацетатты буфер, одан кейінгі тазаланған фермент ерітіндісін қояды; аралсатырған соң қоспаға көлденең тігуші агент-глутарлы альдегид қосады. Соңғысы тасымалдағыштың амин тобы мен ферменттік белоктың карбоксильді тобының арасында амидтік байланыс түзеді бірнеше сағаттан соң алынған препаратты кезекпен тасымалдағышта сорбирленген белокты жою үшін натрий ацетатты буфермен және хлорлы натрий ерітіндісімен жуады. Осылайша иммобилизацияланған фермент 3-5°С температурада су немесе буфер қабатының астында сақталады.