Ферментация

   СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ПРЕДФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ ПРОЦЕДУРЫ
1. ТРАНСПОРТ И ДОЗИРОВАНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЖИДКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
3. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

4. ДОЗИРОВАНИЕ ЖИДКИХ СТЕРИЛЬНЫХ
5. ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
6. И ДРУГИХ ЖИДКИХ КОМПОНЕНТОВ:
7. ПЕНОГАСИТЕЛИ, КОРРЕКТИРУЮЩИЕ
8. РН РАСТВОРЫ, ПОДПИТКА

3. ПРОВЕДЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ
1. ВЫБОР КОНСТРУКЦИИ БИОРЕАКТОРА
1. ТИПЫ  ФЕРМЕНТАТОРОВ И ОСОБЕННОСТИ  ПРОЦЕССОВ  КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
2. ПРИНЦИПЫ ВЫБОРА БИОРЕАКТОРОВ
4. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ
1. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ
2. ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ БИОМАССЫ

3. ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОБНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ
4. ПОЛУЧЕНИЕ БИОМАСС (КОРМОВЫХ, ОСЛАБЛЕННЫХ И ЖИВЫХ)
5. ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

   ВВЕДЕНИЕ

   Рассмотрение  технической реализации основных биотехнологических процессов, в первую очередь техники ферментации, целесообразно вести на основе универсальной технологической схемы, либо, как уже отмечено, аппаратура создается (подбирается) для реализации определенной технологии.

   В части схемы, касающейся обработки  продуктов ферментации, учтены следующие  основные товарные формы продуктов: концентраты, биомассы, очищенные целевые продукты.

   Схема в принципе охватывает все варианты культивирования:

1. глубинное и поверхностное (на жидких и твердых средах);
2. периодическое, отъемно-доливное и непрерывное;
3. стерильное и условно стерильное;
4. аэробное и анаэробное;
5. с использованием биокаталитических реакций (реактор полного перемешивания, иммобилизованные (ферменты, биомасса) системы и др.);
6. массовое культивирование растительных и животных тканевых клеток (кроме ряда специальных методов, используемых в лабораторных и пилотных масштабах, которые рассмотрены, например, в работе).

   Предферментационные процессы начинаются с приготовления  питательных сред в реакторе (1), далее проводится ее термическая стерилизация путем максимально быстрого нагревания до температуры стерилизации (4), выдержки (5) и максимально быстрого охлаждения до  температуры  ферментации  или  на  несколько градусов выше ее (6). В схеме, во избежание чрезмерного усложнения, не отражена холодная стерилизация (ультрафильтрация) термолабильных компонентов (раздельная стерилизация сред). Доминирующими в настоящее время в промышленности являются аэробный (10) и анаэробный (9) ферментаторы (биореакторы). В схеме отражены и поверхностные ферментаторы как на твердых (12), так и па жидких (13) средах. Будущее принадлежит биокаталитическим реакторам (11). Принципиальную роль в определении товарной формы продуктов играют сепаратор (15) и дезинтегратор биомасс (18).

   Рис. 4.1. Принципиальная схема реализации биотехнологических процессов.

   1  — реактор  для  приготовления   питательных  сред;  2   —  вихревой  насос;  3 —  аппарат  для приготовления   и   стерилизации   сред   из   нерастворимых   субстратов   для   поверхностной   и твердофазной   ферментации;   4   —   паровая   колонка   для   подогрева   питательных   сред  до температуры   стерилизации;   5   —   выдерживатель   питательных   сред   при   температуре   стерилизации;  6    -  теплообменник для  охлаждения  стерильных  питательных  сред;  7 —  мерник   —   сборник   питательной   среды;   8   —   дозатор;   9   —   анаэробный   ферментатор;   10   — основной глубинный  аэробный   ферментатор;   11  —   биокаталитический реактор;   12 —  различные   конструкции   поверхностных   и   твердофазных   ферментаторов;   13  —   поверхностный ферментатор   (протва)   на   жидких  средах;   14   —   экстрактор;   15   —  сепаратор   для   отделения   биомассы;   16  — система  локальной  автоматики  с  или   без   ЭВМ  для   поддерживания режимов   биосинтеза   (АСУТП);   11   —   плазмолизатор   биомассы  для   кормовых   препаратов; 18  —   дезинтегратор   биомассы;   19  —   выпарная  установка:   20  —   фракционирование   дезинтегратов;   21   —   сушилка   и   другие   аппараты   для   обезвоживания;   22   —   аппаратура   нормализации  и расфасовки; 23 —  ионообменные колонны,   мембранная  аппаратура,   аппараты реализации   химических   методов   выделения,   центрифуги,    фильтры,    выпарные   установки, кристаллизаторы  и  другие  устройства.

   Условные    обозначения:    рН     -   растзор   дл   корректировки   рН;    П   —   компоненты   и   среды   для   подпитки:   Нос   —   посенной   материал:   В   —   стерильный   сжатый воздух;   ПАВ   -     стерильный   пеногаситгль   (поверхностно-активные   вещества);   Ср   —   стерильная   питательная   среда;   для   процессов   брожения,   получения   кормовых   дрожжей   и др.  — условно стерильная;   БА —  биологический  агент.  

   ПРЕДФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

   ТРАНСПОРТ И ДОЗИРОВАНИЕ  КОМПОНЕНТОВ ПИТАТЕЛЬНЫХ  СРЕД

   По  разнообразию и свойствам компонентов  питательных сред биотехнология  весьма близка к пищевой промышленности. Поэтому в качестве дозирующего оборудования для подачи компонентов сред в реактор для приготовления сред главным образом применяются весовые и объемные устройства из арсенала пищевой, химической и других отраслей промышленности. Транспорт осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами, элеваторами, контейнерами и мешками на передвижных средствах и т. д. Сыпучие компоненты питательных сред нередко из транспортной тары засасывают в реактор вакуумом. Для этого к реактору подключают вакуум-насос.

   Нередко применяется принцип предварительных  смесей, например, соли предварительно растворяются, транспортируются насосами по трубопроводам и дозируются по объему.

   Ряд солей может поставляться на предприятие  в жидком виде. В этом случае хранение и все внутризаводские транспортные операции существенно упрощаются.

   Вместо  аммиачной воды в последних проектах предусматривается применение жидкого аммиака и его подача в газообразном состоянии в линию воздуха или в ферментатор по самостоятельному трубопроводу. Жидкий аммиак по проекту Латгипропрома поступает на завод в железнодорожных цистернах и хранится в рессиверах. Его транспорт и превращение в газообразное состояние осуществляется холодильной машиной МКТ 22-7-2 завода «Черкесскхолодмаш» в составе: компрессор аммиачный АВ-22, конденсатор КТГО-6Б, испаритель кожухотрубный ИТГ-9Б. Стерилизация (фильтрация) газообразного аммиака значительно проще холодной фильтрации аммиачной воды.

   В большинстве случаев выбор средств  внутризаводского транспорта и дозирования компонентов питательных сред серьезных инженерных трудностей не представляет. 
 

   ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЖИДКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ  СРЕД

   Жидкие  питательные среды приготавливаются в реакторах с мешалкой. В зависимости  от совместимости и растворимости  компонентов сред могут быть применены отдельные реакторы и их системы. Если в состав сред входят нерастворимые компоненты (мука, мел и др.), технология средоварения усложняется (разваривание муки и т. п.), однако аппаратурная схема сохраняется. Реакторы выбираются с якорными или другого вида мешалками для взвесей. Для транспорта таких сред применяются специальные, допускающие наличие в среде взвесей насосы.

   В конкретных технологиях могут быть применены специальные более  сложные схемы и аппаратура для  получения сред. Так, например, при производстве хлебопекарных дрожжей мелассные среды для получения нужного качества продукта специально осветляются. При производстве пива и этанола процесс средоварения включает осахаривание крахмала. Мучные среды могут быть подвергнуты дезинтеграции. При производстве кормовых дрожжей на гидролизатах из последних удаляется фурфурол. Нередко в состав сред входят экстракты или гидролизаты каких-либо продуктов, получение которых также относится к процессу средоварения. Если в рецептуру входят слаборастворимые ингредиенты, процесс эмульгирования также относится к средоварению.

   В последних проектах для определения массы содержимого реакторов, мерников и промежуточных емкостей широко применяются тензометрические. Диапазон 40—800 кг.

   СТЕРИЛИЗАЦИЯ  ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

   В настоящее время доминирует термический  метод стерилизации питательных сред. Холодная стерилизация (фильтрация) применяется для термолабильных компонентов. Эти среды не должны содержать нерастворимых веществ.

   Наиболее  часто применяемая принципиальная схема стерилизации включает подогрев среды острым паром  (в стерилизационной колонке) с последующим ее выдерживанием при нужной температуре и охлаждением.

   Время стерилизации среды (выдержку) регулируют путем изменения длины труб или количества пластинчатых теплообменников, температуру — подачей пара на подогрев. Для сред, содержащих термолабильные компоненты, необходимое время выдержки составляет иногда 18—20 мин при сравнительно низкой температуре, что трудно реализовать в проточных выдерживателях. Например,   при   производстве   кормового   лизина   в   этом   случае применяются многокорпусные объемные выдсрживатели с перемешиванием (увеличением скорости потока) при передаче среды последовательно из корпуса в корпус.

   Контрольно-измерительная  и управляющая аппаратура линии  стерилизации размещена на отдельном  пульте управления или на общем пульте цеха ферментации.

   Посевные  питательные среды рекомендуется  стерилизовать, а иногда приготавливать непосредственно в посевных ферментаторах. Последнее упрощает аппаратуру и уменьшает вероятность получения нестерильной культуры.

   Стерилизация  питательной среды для периодического процесса главной ферментации решается по-разному. Непрерывная стерилизация вне аппарата обеспечивает экономию тепла и минимум термической экспозиции питательных компонентов, хотя технически сложно осуществима и связана с повышенной вероятностью нестерильных операций, особенно на средах с нерастворимыми компонентами. Второй вариант — подача среды, нагретой до температуры стерилизации, в рабочие ферментаторы с последующей ее выдержкой и охлаждением в аппарате — более простой и надежный в отношении гарантий стерильности. Расход тепловой энергии и вероятность ухудшения свойств среды в результате длительного термического воздействия в этом случае возрастают.

   При синтезе вторичных продуктов  нередко необходимы более концентрированные  среды для подпитки. Их стерилизация в принципе не отличается от таковой для основных сред. Однако обычно верхний предел допустимого содержания в них сухих веществ все же определяется техническими параметрами линии стерилизации (образование накипи, оседание и др.), а температура стерилизации и время выдержки — составом среды (допустимая карамелизация и другие реакции компонентов среды).

   Линии стерилизации сред для непрерывных процессов не отличаются от таковых для периодических.

   Холодная  стерилизация, как уже было отмечено, применяется в настоящее время  только для термолабильных компонентов — раствора мочевины, аммиачной воды и других корректирующих рН растворов — для классической биотехнологии, ряда сложных сред — для нетрадиционной биотехнологии. Основным аппаратом линии холодной стерилизации является мембранный фильтр. Ведущие иностранные фирмы «Полл корпорейшн», «Миллипор» и другие предлагают ряд мембран из полипропилена, целлюлозы, пористой нержавеющей стали, спеченной тканой проволочной сети, микроволохна, нейлона, эпоксидной смолой целлюлозы и других материалов. Мембраны чаще всего оформлены в виде фильтрующих патронов. Например, «Полл корпорейшн» наиболее часто предлагает патроны диаметром 70 мм, длиной 250—760 мм. Корпуса патронов изготавливаются из нержавеющей стали.

   В линиях стерильных сред и других компонентов (а также для обвязки ферментаторов) в последних проектах применяется  только сильфонная стальная нержавеющая  арматура. В настоящее время стерильные сыпучие питательные среды реально  используются при производстве ферментов поверхностным методом. Эти технологии и аппаратура в достаточной степени описаны [30], поэтому на них подробнее останавливаться не будем.

   ДОЗИРОВАНИЕ ЖИДКИХ СТЕРИЛЬНЫХ

   ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

   И ДРУГИХ ЖИДКИХ КОМПОНЕНТОВ:

   ПЕНОГАСИТЕЛИ, КОРРЕКТИРУЮЩИЕ

   рН  РАСТВОРЫ, ПОДПИТКА

   Дозирование технологических потоков жидких сред в биотехнологии можно было бы осуществлять техническими средствами, аналогичными применяемым в пищевой, химической и других отраслях промышленности. Так эти операции выполняются при реализации нестерильных процессов (производство кормовых дрожжей, этилового спирта и т. д.). Однако особенность многих биотехнологий заключается в необходимости реализации процесса в асептических условиях, т. е. в дозировании стерильных, в большинстве случаев корродирующих, жидкостей.

   Дозирование стерильных корродирующих жидкостей  для периодических, отъемно-доливных и непрерывных способов культивирования реализуется при помощи индивидуальных групповых мерников, из которых соответствующий компонент вручную или автоматически подается в ферментатор согласно временному графику или величине соответствующего параметра процесса. Индивидуальные мерники моются и стерилизуются одновременно с ферментатором, для которого они предусмотрены. По мере развития техники ферментации дозирование жидкостей через мерники и емкости должно быть заменено использованием специальных дозирующих насосов или передавливанием с расходомерами на транспортной линии.

   В практике биотехнологии вопрос техники  дозирования целесообразно рассмотреть в комплексе со способами дозирования. Несколько примеров к сказанному.

   Если  ферментатор снабжен системой индикации уровня и состояния пены, то момент и доза подачи химического пеногасителя определяются этой системой, а в линии подачи от мерника (работает под избыточным давлением) до ферментатора собственно дозатор не нужен, достаточно иметь пневматическую или электромагнитную управляемую   (с учетом    инерции системы) запорную арматуру. При этом важен способ непосредственного ввода пеногасителя в аппарат (форсунка, механическое распыление и т. д.), а также общая схема пеногашения (химико-механическое, пневматическое, химическое).

   Аналогично  можно обойтись без дозаторов (расходомеров) при регулировании рН.

   Несколько сложнее состояние вопроса при  реализации стерильных непрерывных методов ферментации (хемостат, турбидостат и т. д.). В принципе возможно согласовать производительность линии непрерывной стерилизации с нужной скоростью протока в хемостате. Однако такие линии с трудом поддаются регулировке по производительности, поскольку приходится менять соотношение: время выдержки — температура стерилизации. Поэтому обеспечение даже наиболее простого режима — хемостата без промежуточной емкости (мерника) проблематична, и практически эти емкости применяются. Кроме того, следует отметить, что промышленный опыт технической реализации таких процессов весьма скуден. Так, например, в практике авторов настоящей работы производство лизина непрерывным методом — это единственный процесс, где реально необходим хемостат в промышленных экспериментах.

   Рассмотрение  проблемы дозирования стерильных жидкостей  целесообразно начать с лабораторных и пилотных масштабов. Практически  все такие исследовательские  установки, в том числе ФУ-8 и ФУ-30, комплектуются шланговыми насосами, которые при наличии гибких трубопроводов нужного качества и точного управления скорости вращения вала насоса обеспечивают нужные параметры дозирования и срок службы. Принцип работы таких насосов известен: периодическое пережимание шланга клавишным механизмом или скатывание специальных роликов по окружности петли шланга. Эти насосы допускают наличие суспензий в обрабатываемых потоках. Иностранные фирмы также выпускают шланговые насосы отдельно от ферментационных установок. В качестве примера можно упомянуть систему «Мастерфлекс» (США) производительностью 0,06—2280 мл/мин, имеющую до 10 параллельных каналов.

   Промышленные  насосы-дозаторы для стерильных жидкостей  могут быть созданы на базе имеющихся  в нестерильном исполнении путем уплотнения поршня, например применением специального сильфона. Такой пример описан в работе, и в настоящее время завод «Ригахиммаш» близок к выпуску первых отечественных промышленных насосов-дозаторов для стерильных жидкостей.

   Ожидается также прогресс в создании надежных, действующих в стерильных корродирующих  средах расходомеров. В таком случае, как отмечено выше, транспорт можно осуществлять насосами, передавливанием, самотеком и т. д. 

   ПРОВЕДЕНИЕ  ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ

   Проведение  процесса ферментации с точки  зрения его инженерной реализации сводится к обеспечению дозированной согласно технологическому режиму подачи потоков в ферментатор, отвода из него культуральной жидкости, тепла, отработанного воздуха (газов) и измерению (если необходимо — поддержанию) нужных для конкретного биологического агента физико-химических параметров среды, а также к управлению межфазным транспортом веществ в культуральной жидкости, т. е. обеспечению оптимальных концентраций субстратов/продуктов для конкретной культуры и гомогенности среды внутри биореактора. При этом большинство сред — корродирующие, непрозрачные, многокомпонентные, пенящиеся. Они могут содержать нерастворимые компоненты.

   Если  задаться целью систематизации самих  технологических способов, то, как  показывает результат нашей попытки такой систематизации, их разнообразие настолько велико, что, в отличие от классификации конструкций аппаратов, получаемая система настолько сложна, что ее использование затруднительно. 
 

   ВЫБОР КОНСТРУКЦИИ БИОРЕАКТОРА

   ТИПЫ  ФЕРМЕНТАТОРОВ И ОСОБЕННОСТИ  ПРОЦЕССОВ  КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

   Технически  наиболее сложным процессом ферментации  является глубинный, стерильный, непрерывный (с подпиткой),особенно на природном многокомпонентном сырье, образующем обильную пену.

   Ферментаторы  группы ФГ обычно обеспечивают дешевый  продукт, поэтому они используются при производстве дрожжей и других крупнотоннажных продуктов. Введение механической энергии сокращает длительность процесса культивирования, но связано с увеличением затрат. В результате нередко технико-экономические расчеты суммарной эффективности той или иной; конструкции аппарата сложны и окончательный выбор типа аппарата длится годами. Примером может служить производство лизина, где в течение последних 15 лет так и не дан окончательный ответ, какая группа аппаратов (ФГ или ФЖГК) наиболее приемлема.

   Хотя  классификация ферментаторов нами подробно рассмотрена ранее, все же следует отметить, что в иностранной литературе эти аппараты чаще всего различают по конструктивным признакам:

1. аппараты с мешалками  (ФЖГК — по нашей системе);
2. барботажные колонные реакторы (ФГ). Однако в эту группу входят аппараты с динамическими диспергаторами — эффекторами, инжекторами, соплами вентури (ФЖ), а также статическими соплами воздуха (ФГ). Деквер сюда же включает барботажные колонны с циркуляционным контуром обратного потока, хотя, после знакомства с данными Бланке, их можно также отнести к третьей группе;
3. третью группу, по мнению Бланке, составляют реакторы с выраженным (организованным) циркуляционным трактом (loop reactors), в том числе с механическими побудителями циркуляции (ФЖГК), газлифтные (ФГ), струйные (ФЖ), аппараты струи глубокого погружения (ФЖ) и др.

   Аппараты  для аэробной обработки сточных вод авторы не вводят в общую классификацию.

   Как известно, ферментаторы, перечисленные выше, главным образом создавались и применялись в течение «эры» антибиотиков и кормовых дрожжей. Они широко применяются и в наши дни. Однако прогресс в получении рекомбинантных культур выдвигает специальные требования к аппаратуре — биореакторам. Генетически модифицированные микроорганизмы являются более сложным объектом для биотехнологов и биоинженеров, так как при их использовании на первый план выдвигатся такие показатели, как стабильность модификаций биологических агентов, повышенные требования к асептике, лимитация срезовых усилий при перемешивании и т. д. Намечается тенденция объединить в биореакторе процессы биосинтеза и разделения полученных продуктов и биомасс. Нередко биореакторы этого класса комбинируются с внутренними или наружными системами мембран или осуществляется иммобилизация биологических агентов, что позволяет достичь высоких концентраций клеток, а следовательно, интенсифицировать процессы соответствующих биопревращений.

   Среди быстро развивающихся конструкций  для этих целей следует упомянуть:

1. биореакторы кипящего слоя (получение этилового спирта, циклоспорина, очистка сточных вод и др.);
2. биореакторы с подвижными микроносителями для биологических агентов, которые «любят» фиксироваться на поверхностях (получение интерферона и клеточных масс различного использования, например для продуцирования вирусов, для метанового брожения и т. д.). Системы весьма близки к иммобилизованным;
3. мембранные биореакторы с трубчатыми или ротирующими системами мембран (преимущественно экспериментальные) для выращивания клеточных культур и иммобилизации бактерий и дрожжей; применение широкое: получение вирусов, в том числе для производства вирусных вакцин, моноклональных антител, этанола, глюкозы, фруктозы и др.;
4. проточные колонны с иммобилизованными биологическими агентами широкого применения, начиная с получения этанола и кончая получением моноклональных антител.

   ПРИНЦИПЫ  ВЫБОРА БИОРЕАКТОРОВ

   Выбор или разработка биореакторов осуществляется исходя из их назначения. Для исследовательских  целей выбираются аппараты с универсальной системой перемешивания, для промышленных целей — специализированные. Ферментаторы для твердофазных (поверхностных) процессов описаны в работе. Неотъемлемым элементом ферментаторов является система пенорегулирования. 

   ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ

   ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ  КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ

   Возможны  следующие принципиальные варианты переработки культуральных жидкостей:

1. обезвоживание с получением всего сухого остатка в виде микробиологических концентратов;
2. фракционирование на биомассу и жидкую часть (фугат) с получением живой (хлебопекарные дрожжи, бактериальные удобрения и др.), ослабленной (вакцины) или инактивированной (кормовой белок) клеточной массы и продуктов различной степени очистки из фугата или фракций дезинтегратов биомасс.

   Методы  фракционирования - сепарирование, фильтрование, осаждение.

   Исходным  материалом для выделения продуктов  микробиологического   синтеза   является   культуральная   жидкость,    которая представляет собой сложную многофазную систему, содержащую клетки микроорганизмов, остатки питательной среды, жиры. Исследования фильтрационных характеристик культуральных жидкостей, в частности при получении антибиотиков, показали,, что содержание в них сухого остатка достигает 17% и более, а целевого продукта — не превышает 1,5%.

   Выделение целевого продукта из такой сложной  смеси связано с определенными трудностями и, как правило, зависит от эффективной предварительной очистки культуральных жидкостей.

   Независимо  от типа биосинтеза (внеклеточное или  внутриклеточное расположение целевого продукта) первой стадией подготовки культуральной жидкости для дальнейшей переработки является отделение взвешенной фазы — биомассы. На производстве это связано с переработкой больших объемов труднофильтруемых суспензий, значительными потерями целевого продукта, в определенной  степени  влияющими  на показатели  последующих стадий очистки.

   Фракционирование  целесообразно осуществить путем  сепарирования, имеющего ряд преимуществ перед фильтрацией и другими способами, а именно:

1. нет необходимости в применении фильтрующих добавок; кроме технологических удобств и экономии это позволяет ненужную для дальнейшей обработки фракцию использовать в корм животным;
2. сепарация как более надежный, непрерывный процесс дает-возможность обработать материал с наименьшими потерями активного вещества;
3. процесс легче поддается автоматизации, агрегаты занимают меньше помещений, легче осуществить мойку оборудования.