ГМО в продуктах харчування

I. АПАРАТУРА,  ІНСТРУМЕНТИ, ЛАБОРАТОРНИЙ ПОСУД,  РЕАКТИВИ

 

 1.1. Для проведення ідентифікації і кількісного визначення ГМО рослинного походження використовується наступна апаратура і інструменти :

- ампліфикатори типу ABI Prism 7000, iCycler iQ, Rotor Gene - 3000 (6000), AHK - 32, "Терцик МС-2" і інші;

- комплекс апаратно-програмний  для аналізу біологічних мікрочіпів  типу "ДЕРМІГЕН-001"; - прилад для горизонтального електрофорезу типу "Mini - Sub Cell GT System" з комплектом кювет і гребінок;

- джерело напруги типу "Power Pac 300" з діапазоном регульованої напруги 50 - 300 В;

- трансиллюминатор типу  Т12 із захисним екраном, діапазон  випромінювання 300 - 400 нм;

- відеосистема типу "Gel Doc 2000(ТМ) ", призначена для введення в комп'ютер, аналізу і документування зображень люминесцирующих слідів ДНК в гелях, забарвлених бромистим этидием, чутливість - не менше 10 нг ДНК (по бромистому этидию);

- холодильник побутовий  електричний типу "Електролюкс", з температурою морозильної камери  мінус 20 °C;

- мікроцентрифуга настільна типу Еппендорф (частота обертання не менше 13000 хв.(- 1));

- термостат типу "TERMO 24-15" під пробірки типу Епендорф місткістю 0,5 і 1,5 мл, діапазон температур від 15 °C до 120 °C, кількість гнізд - не менше 20 кожного типу, точність підтримки температури - 0,2 °C, різниця температур між сусідніми осередками - не більше 0,5 °C;

- термостат сухоповітряний  типу ТВЗ-25 з робочою температурою 42 °C, робочий діапазон від 20 °C  до 60 °C, точність підтримки температури  /- 1 °C;

- апарат для струшування типу "Вортекс", швидкість обертання 250 - 3000 хв.(- 1);

- пекти мікрохвильова  (потужністю не менше 400 W); - ваги  лабораторні загального призначення  2-го класу точності з найбільшою  межею зважування 200 г; 

- аналізатор потенціометр  типу МР 220, погрішність вимірів pH /- 0,01;

- гомогенізатор перистальтичного типу "Стомайкер" або інших моделей;

- опромінювач бактерицидний  настінний типу ОБН-150; - дозатори  зі змінним об'ємом дозування  : 0,2 - 2,0 мкл з кроком 0,01 мкл, з  точністю /- 1,2%; 0,5 - 10,0 мкл з кроком 0,01 мкл, з точністю /- 0,8%; 2 - 20 мкл з кроком 0,01 мкл, з точністю /- 0,8%; 20 - 200 мкл з кроком 0,1 мкл, з точністю /0,6%; 100 - 1000 мкл з кроком 1 мкл, з точністю /- 3%; 2 - 10 мл з кроком 0,1 мл, з точністю /- 0,5%.

1.2. Для проведення ідентифікації і кількісного визначення ГМО рослинного походження використовується наступний лабораторний посуд:

- циліндри мірні лабораторні  місткістю 10, 25, 100, 1000 мл, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Z 327263-2 EA, Z 327301-2 ЕА, Z 327379-2 ЕА, Z 327476-2 ЕА;

- колби мірні лабораторні  місткістю 25, 50, 100, 250, 1000 мл, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Z 329517-1 EA, Z 329525-1 EA, Z 329533-1 ЕА, Z 329541-1 EA, Z 329576-1 EA;

- пробірки микроцентрифужные  типу Эппендорф місткістю 0,2, 0,5, 1,5 мл;

- наконечники з фільтром  для дозаторів зі змінним об'ємом  дозування до: 10; 20; 200; 1000 мкл; 10 мл.

1.3. Для проведення ідентифікації і кількісного визначення ГМО рослинного походження використовуються наступні реактиви:

- кислота соляна, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Н 1758;

- кислота борна, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N В 7901;

- натрій їдкий, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N 221465;

- натрій хлористий,  корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N S 3014;

- етилендиамінтетраоцетова  кислота (ЕДТА), корпорація "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Е 5134;

- гексадецилтриметиламмониум  бромід (СТАВ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Н 5882;

- трис (оксиметил) амінометан, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Т 6791;

- альбумін бичачий сироватковий  сухий (БСА), корпорація "Сигма  Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287;

- этидий бромистий, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Е 4391;

- спирт етиловий, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат N 459836;

- спирт изопропиловый,  корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N 19516;

- хлороформ, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N 151823; - вода деіонізована, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N W 4502;

- вода дистильована, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N W 3500;

- 2-меркаптоетанол, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N М 3148;

- термостабільний фермент  Taq -полимераза, оптимум роботи в  області 70 °C - 72 °C, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 1806;

- буфер для ПЦР з MgCl2, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 2192;

- агароза для електрофорезу  (тип П), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N А 6877; - маркер молекулярної маси ДНК, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 1473;

- стандартний зразок  складу генетично немодифікованого організму рослинного походження, корпорація "Сігма Алдрич" (Fluka), кат. N 53198;

- стандартний зразок  складу ГМО рослинного походження, корпорація "Сігма Алдрич" (Fluka), кат. N 44386;

- 2 '- дезоксиаденозин-5 'трифосфорной  кислоти тетранатрієвая сіль, тригідрат (АТФ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4788;

- 2 '- дезоксицитидін-5 'трифосфорной кислоти тетранатриевая сіль, тригідрат (ЦТФ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4913;

- 2 '- дезоксигуанозин-5 'трифосфорной кислоти тетранатриевая сіль, тригідрат (ГТФ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 5038;

- 2 '- дезокситимідин-5 'трифосфорної кислоти тетранатриевая сіль, тригідрат (ТТФ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Т 9656;

- праймери, ЗАТ "Синтол" (Росія); - натрію додецилсульфат (SDS), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N L 4390;

- 3% -вий розчин перекису водню, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N 7722.

1.4. Допускається використання іншої апаратури, інструментів і реактивів з технічними характеристиками не гірше вказаних вище за вітчизняне і зарубіжне виробництво, дозволених для застосування в установленому порядку.

 

II. ПІДГОТОВКА  ДО АНАЛІЗУ

 

2.1. Приготування розчинів :

- для приготування 1М  ТРИС - HCl (pH 7,5) в мірній колбі на 100 мл розчинити 12,11 г Трис (оксиметил) амінометану в 80 мл дистильованої води, довести pH концентрованою соляною кислотою до 7,5, довести об'єм розчину до мітки деионизованной водою, перемішати, зберігати при температурі - 20 °C в течію не більше року;

- для приготування 5М  NaCl розчинити 29,22 г натрію хлористого  в 100 мл дистильованої води, перемішати, зберігати в колбі з притертой  пробкою при кімнатній температурі  до 1 року; - для приготування 30% -ной  NaOH розчинити 3 г натрію гідроокису в 7 мл дистильованої води;

- для приготування 0,5М ЕДТА (pH 8,0) в мірній колбі на 100 мл розчинити 18,62 г етилендиамінтетраоцетової кислоти в 80 мл дистильованої води, розчином 30% -ной натрію гідроокису довести pH розчину до 8,0, дистильованою водою об'єм розчину довести до мітки, перемішати, зберігати в колбі з притертой пробкою при кімнатній температурі до 1 року.

2.2. Приготування хлороформу, насиченого водою :

- змішати 100 мл хлороформу з  20 мл деіонізованої води і залишити  на 24 ч для насичення;

- термін зберігання при температурі  від 4 °C до 5 °C - не більше 6 міс. 

2.3. Приготування 70% -го розчину етилового спирту :

- змішати 70 мл 96% -го етилового  спирту з 26 мл деіонізованої  води;

- термін зберігання при температурі  від 4 °C до 5 °C - не більше 2 міс.

2.4. Приготування розчину БСА (20 мкг/мл) :

- розчинити 0,002 г сухого альбуміну  бичачого сироваткового в 1 мл  деіонізованої води, 10 мкл отриманого  розчину змішати з 990 мкл деіонізованої  води;

- термін зберігання в морозильній  камері при температурі мінус 20 °C - не більше 6 міс.

2.5. Приготування буфера (2% -го "СТАВ"), що лізирує :

- розчинити 0,5 г гексадецилтриметиламмония  броміду в 10 мл деіонізованої  води, додати 2,5 мл 1M Трис - HCl, 7 мл 5М NaCl, 1 мл 0,5М ЭДТА, довести об'єм розчину деіонізованою водою до 25 мл, перемішати;

- термін зберігання при температурі  від 4 °C до 5 °C - не більше 6 міс. 

2.6. Приготування 1 x ТВЕ буфера для електрофорезу:

- в мірній колбі на 1000 мл розчинити  10,8 г Трис (оксиметил) амінометану, 5,5 г борної кислоти і 0,92 г етилендиамінтетраоцетової кислоти, довести дистильованою водою до мітки, перемішати до повного розчинення;

- термін зберігання 1х розчину  - 10 днів.

2.7. Приготування розчину бромистого этидия - C21H20N3Br (10 міліграм/мл) :

- розчинити 1 г бромистого этидия в 100 мл дистильованої води;

- термін зберігання в посуді  темного скла при температурі  від 4 °C до 5 °C - 12 міс. 

2.8. Приготування осаджуючого буфера СТАВ:

- в мірну колбу внести 1 г СТАВ, 0,5 г NaCl, додати 100 мл деіонізованої води, довести розчином 30% -го натрію гідроокису pH розчину до 8,0, довести об'єм деіонізованою водою до 200 мл; - зберігати при 4 °C не більше 6 місяців.

2.9. Приготування 1,2М NaCl :

- розчинити 7,0 г NaCl в 100 мл деіонізованої води, перемішати;

- зберігати в колбі  з притертой пробкою при кімнатній  температурі до 1 року.

2.10. Приготування 10% -го розчину SDS :

- розчинити 10 г SDS в 90 мл дистильованої води;

- зберігати при кімнатній  температурі не більше 1 року.

 

IІІ. ВИДІЛЕННЯ ДНК

 

3.1. Метод виділення ДНК з допомогою СТАВ:

- навішування досліджуваного гомогенізованого  продукту масою 100 міліграм помістити  в микроцентрифужную пробірку  типу Эппендорф на 1,5 мл;

- додати 300 мкл деіонізованої води, перемішати шпателем;

- додати 500 мкл СТАВ-буфера, що лізирує, з меркаптоэтанолом, ретельно перемішати шпателем;

- інкубувати при 65 °C 90 хвилин;

- центрифугировати 10 хвилин при 13000 о./хв.;

- перенести 500 мкл супернатанту  в чисту пробірку типу Эппендорф  місткістю 1,5 мл;

- додати 500 мкл хлороформу, перемішати на вортекс 30 секунд;

- центрифугировать 10 хвилин при  13000 о./хв.;

- перенести 500 мкл верхньої фракції  в чисту пробірку, додати 500 мкл  хлороформу, перемішати;

- центрифугировать 5 хвилин при  13000 о./хв.;

- перенести верхню фракцію в чисту пробірку типу Эппендорф місткістю 1,5 мл, не захоплюючи шар хлороформу;

- додати 2 об'єми СТАВ-осаждающего  буфера, перемішати пипетированием;

- інкубувати 60 хвилин при кімнатній  температурі; 

- центрифугировати 5 хвилин при 13000 о./хв.;

- видалити супернатант; 

- розчинити осад в 350 мкл NaCl (1,2М);

- додати 350 мкл хлороформу, перемішати  на вортекс 30 секунд;

- центрифугировать 10 хвилин  при 13000 о./хв.; - перенести верхню  фракцію в чисту пробірку типу  Эппендорф місткістю 1,5 мл;

- додати 0,6 об'єму изопропилового  спирту, перемішати;

- центрифугировати 10 хвилин при 13000 о./хв.;

- видалити супернатант;

- додати 500 мкл 70% -го  розчину етилового спирту і  перемішати на вортекс; 

- центрифугировать 10 хвилин  при 13000 о./хв.;

- видалити супернатант;

- підсушити осад не  більше 5 хвилин при 65 °C для  видалення крапель спирту;

- розчинити осад в  100 мкл деіонізованої води, обережно  струшуючи, отриманий розчин ДНК  готовий для проведення полімеразної  ланцюгової реакції (ПЛР);

- зберігати при мінус 20 °C. 4.2. Сорбційний метод виділення ДНК :

- в центрифужні пробірки типу Эппендорф на 1,5 мл внести 300 міліграм бісеру і 70 - 80 міліграм аналізованого матеріалу, додати 0,5 мл 5 мМ Na2 -соль ЕДТА і термостатувать 30 - 60 хвилин при 65 °C;

- до вмісту пробірки  додати 400 мкл реагенту, що лізирує,  перемішати на вортекс до максимально  однорідного стану, термостатувать при 65 °C 60 - 120 хвилин;

- перемішати на вортекс,  додати 500 мкл бідистильованої води, перемішати на вортекс; 

- центрифугировати 1 хвилину при 12000 о./хв., прозорий супернатант перенести в чисту пробірку;

- додати 20 мкл сорбенту, пробірку помістити на ротатора або перемішувати на вортекс 10 хвилин при 10 - 20 о./хв.;

- центрифугировать 10 секунд  при 12000 о./хв.;

- видалити супернатант, до осаду додати 200 мкл реагенту, що лізирує, перемішати на вортекс до однорідного стану, центрифугировать 10 секунд при 12000 о./хв.;

- видалити супернатант,  до осаду додати 1 мл робочого  розчину сольового буфера, перемішати  вміст пробірки перевертанням 5 - 10 разів, центрифугировать 10 секунд при 12000 о./хв.;

- видалити супернатант,  не зачіпаючи осаду; 

- до осаду додати 1 мл робочого розчину сольового  буфера, перемішати на вортекс,  центрифугировать 10 секунд при 12000 о./хв., видалити супернатант;

- повторити попередній  пункт ще раз; 

- підсушити осад при  65 °C впродовж 4 - 5 хвилин: - до осаду  додати 50 мкл екстракційного розчину,  відбір розчину з початкового  флакона проводити при постійному  помішуванні, не допускаючи випадання в осад гранул іонообмінної смоли;

- суспендувати вміст  пробірки на вортекс 5 - 10 секунд  до гомогенного стану, потім  термостатировать 10 хвилин при 65 °C;

- повторно суспендувати  пробу на вортекс, центрифугировать 1 хвилину при 12000 о./хв.;

- розчин ДНК перенести в чисту пробірку, зберігати при мінус 20 °C.

 

ІV. ПРОВЕДЕННЯ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ В АГАРОЗНОМ ГЕЛІ

 

4.1. Приготування 2% -ного агарозного гелю :

- до 1 г агарозы додати 50 мл 1х буфера ТВЕ, ретельно  перемішати;

- отриманий розчин  помістити в мікрохвильову піч на 2 - 5 мін або прокип'ятити на водяній лазні 15 мін до повного розплавлення агарозы;

- розплавлену агарозу  охолодити до 56 °C, додати 5 мкл бромистого  этидия, ретельно перемішати, розлити  в підготовлену форму, товщина  гелю 0,5 - 0,7 см, через 30 - 40 хвилин видалити гребінку;

- готовий гель використати  відразу або зберігати в 1х  ТВЕ буфері в холодильнику  при 4 °C.

4.2. Проведення електрофорезу :

- 10 мкл реакційної  суміші після аплификации внести  в лунку гелю, в одну з лунок  внести маркер молекулярної маси :

-помістити заповнений гель в камеру для електрофорезу з буфером 1х ТБЕ, товщина шару буфера над поверхнею гелю ~ 2 - 3 мм;

- провести електрофорез  в режимі постійної напруги  100V 70 - 90 хвилин;

- гель (без форми) помістити  на екран трансиллюминатора; - документувати результат фореза за допомогою гель-документирующей системи, фотокопію гелю прикласти до звіту по ідентифікації.

 

V. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ МЕТОДОМ ПЛР З ДЕТЕКЦІЄЮ РЕЗУЛЬТАТІВ МЕТОДОМ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

 

5.1. Необхідність проведення лабораторних досліджень для конкретних видів харчової продукції, отриманої з використанням ГММ і МГМА, визначається експертом з урахуванням аналізу представленої заявником документації, переліку мікроорганізмів, що використовуваних в харчовій промисловості і мають генно-инженерно-модифицированные аналоги. Експертні дослідження включають підтвердження даних, наданих заявником, а при необхідності - перевірку на наявність можливих генетичних модифікацій, що не декларують.  
5.2. Для виявлення ГММ проводять дослідження на наявність трансгенів (сторонніх генів), регуляторних або маркерних векторних послідовностей. Наявність таких послідовностей свідчить про зроблені генетичні модифікації. Виявлення послідовностей таких генів роблять за допомогою специфічного і високочутливого методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

 5.3. Рекомендовані стратегії міжнародних організацій (ФАО/ВООЗ) для виявлення генетичних модифікацій передбачають визначення найчастіше вживаних послідовностей векторів - плазмид, за допомогою яких генетична інформація вводиться в клітину. В якості маркерів використовують гени, по яких проводять селекцію модифікованих клітин (гени антибиотикорезистентности, бактериоцинов), послідовності регуляторних векторних генів (полилинкеры, промотори або термінатори), а також послідовності мігруючих елементів. Виявлення таких послідовностей свідчить про можливі недокументовані генетичні модифікації і вимагає проведення додаткових досліджень штамів і/або продуктів.

   5.4. Проведення додаткових досліджень здійснюють з використанням методів гибридизационного і рестрикционного аналізу, секвенування, аналізу функціонування цільової вставки (вивчення РНК і білка, продукованих сторонньою ДНК) відповідно до офіційно затверджених методів аналізу.  
5.5. Для якісного визначення ДНК генно-інженерно-модифікованных мікроорганізмів в харчових продуктах і біологічно активних добавках до їжі (БАД) методом ПЦР використовують тест-системи, що включають багатокомпонентні набори реагентів і праймерів (штучно синтезованих олигонуклеотидов, комплементу відповідним ділянкам ДНК-мішені), призначені для виявлення селективних маркерних генів, найчастіше вживаних при конструюванні ГММ. Виявлення маркерних генів у штамів мікроорганізмів, використовуваних при виробництві харчових продуктів, свідчить про зроблених генетичних модифікаціях.

    У тест-системи  входять праймери, фланкирующие  наступні послідовності:  
1) гена ermC, що кодує стійкість до еритроміцину, плазмиды pE194 Staphylococcus aureus (розмір фрагмента 349 п.н.);  
2) гени tetO, що кодує стійкість до тетрацикліну хромосоми Streptococcus pneumoniae (розмір фрагмента 242 п.н.);  
3) гени amp, що кодує стійкість до ампіциліну, плазмиды pBR322 Esherichia coli (розмір фрагмента 321 п.н.);  
4) гени lacZ, що кодує фермент бета-галактозидазу, хромосоми Esherichia coli (розмір фрагмента 158 п.н.);  
5) гена ori, що кодує ориджин реплікації, плазмиды p15A Esherichia coli (розмір фрагмента 382 н.п.);  
6) гена hph, що кодує стійкість до гігроміцину, хромосоми Streptomyces hygroscopicus (розмір фрагмента 288 н.п);  
7) гена Sh ble, що кодує стійкість до блеомицину, хромосоми Streptomyces verticillus (розмір фрагмента 301н.п.).

    5.6. Вибраний відповідно до правил молекулярного дизайну і міжнародних баз даних (із застосуванням програм "Oligo 4.0", "Blast" і їх аналогів) набір праймерів забезпечує проведення багатофакторного аналізу вибраних послідовностей.  
5.7. Для кожної конкретної пари праймерів ПЛР проводять з використанням оптимального співвідношення компонентів реакційної суміші, структури програми ампліфікації (тимчасових і температурних характеристик кожного етапу ампліфікації) і адекватного методу детекции результатів, для виключення перехресних реакцій з неспецифічною ДНК і забезпечення необхідного рівня чутливості і специфічності реакції.

5.8. Специфічність і чутливість наборів праймерів і реагентів (позитивні результати ПЛР в пробах з контролями ДНК селективних маркерів при концентрації не менше 5 x 10(4) ГЭ/мл, відсутність перехресних реакцій з неспецифічною ДНК при концентрації не менше 1 x 10(3) ГЕ/мл) підтверджують на препаратах ДНК, виділених з штамів мікроорганізмів, вказаних в таблиці 1.

 

Таблиця 1

N/N	Мікроорганізм	Номер штама
1	Escherichia coli	M-17
2	Lactobacillus acidophilus	Шт. Биобактон
3	Lactobacillus acidophilus	Шт. 1К В-2991
4	Bifidobacterium animalis (lactis)	Bb-12
5	Bifidobacterium bifidum	Шт. N 1
6	Lactobacillus acidophilus	E.P. 317/402
7	Lactobacillus casei	Шт. 163
8	Laclobacillus acidophilus	R K/A - 08
9	Saccharomyces cerevisiae	Шт. АлкоИст
10	Композиция бифідобактерій Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium longum	B. bifidum, N ВКПМ Ac 1248(8-3); B. longum, N Ac 1531 (ДВА-13), B. bifidum 791 БАГ
12	Lactobacillus paracasei, subsp. paracasei	Шт. Dalton
14	Композиція Lactobacillus planlarum + Lactobacillus fermentum	Шт. 8P-A3 La + шт. 90ТС-4
15	Lactobacillus casei	Шт.-01
16	Lactococcus cremoris	Шт. 322
17	Streptococcus thermophilus	Шт. KTc 3 E.A.

 

 

 

5.9. Для виявлення ДНК генно-інженерно-модифікованих мікроорганізмів в пробах з різними рівнями змісту мікробної ДНК і ДНК харчового субстрату використовують два види тест-систем :  
- комплект N 1А для виділення ДНК з ферментних препаратів, культур стартерів і заквашувальних, БАД;  
- комплект N 1Б для виділення ДНК з харчових продуктів.  
5.10. Виділення ДНК з бактерійних культур за допомогою комплекту N 1А включає лізис бактерійних клітин з подальшим осадженням ДНК на двоокисі кремнію. Виділення ДНК із зразків харчових продуктів за допомогою комплекту N 1Б включає попередню обробку проби гомогенізованих зразків протеиназой До, лізис, додаткову обробку депротеинизирующим розчином і осадження ДНК на двоокисі кремнію.

 5.11. Для виявлення ГММ і МГМА в харчових продуктах використовують наступні матеріали, устаткування, реактиви:  
1) програмований термостат (ДНК-амплификатор) типу "Терцик МС2" або інші типи амплификаторов, зареєстровані в Російській Федерації в установленому порядку;  
2) термостат, що підтримує температуру 45 °C, для пробірок об'ємом 1,5 мл;  
3) центрифуга із швидкістю обертання ротора до 12 000 о./хв. для пробірок місткістю 1,5 і 0,5 мл типу "эппендорф";  
4) підтрушувач вібраційний типу "вортекс" із швидкістю обертання до 3 000 о./хв.;  
5) прилад для горизонтального електрофорезу;  
6) джерело постійного струму;  
7) водяна лазня з підігріванням до 95 °C або СВЧ-печь;  
8) ультрафіолетовий трансиллюминатор;  
9) очок/маска захисні;  
10) холодильник побутовий електричний;

11) морозильна камера, що забезпечує температуру (- 20) °C або нижче;  
12) гомогенізатор типу "SilentCrusher" або інших моделей;  
13) ступка фарфорова з товкачиком;  
14) пінцет медичний;  
15) ножиць медичних;  
16) скальпель медичний;  
17) вагів лабораторні загального призначення 2-го класу точності;  
18) дистилятор;  
19) аналізатор потенціометр;  
20) опромінювач бактерицидний настінний;  
21) дозатори зі змінним об'ємом дозування : 0,2 - 2,0 мм3 з кроком 0,01 мм3, 0,5 - 10,0 мм3 з кроком 0,01 мм3, 2 - 20 мм3 з кроком 0,01 мм3, 20 - 200 мм3 з кроком 0,1 мм3, 100 - 1000 мм3 з кроком 1 мм3, 2 - 10 см3 з кроком 0,1 см3;  
22) пробірки типу "эппендорф" місткістю 1,5 мл;  
23) пробірки типу "эппендорф" для ПЦР місткістю 0,5 мл;  
24) наконечники полімерні об'ємом 1 - 200 мкл;  
25) наконечників полімерні об'ємом 200 – 1000 мкл;

26) рукавичок гумових;  
27) колб плоскодонні конічні різній місткості;  
28) циліндрів скляні мірні лабораторні місткістю 25, 100, 1000 см3;  
29) воронок скляних;  
30) штативів для пробірок об'ємом 1,5 і 0,5 мл;  
31) комплект N 1А для виділення ДНК з ферментних препаратів, культур стартерів і заквашувальних, БАД до їжі;  
32) комплект N 1Б для виділення ДНК з харчових продуктів;  
33) комплект N 2 "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованих мікроорганізмів";  
34) комплект N 3 "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованих мікроорганізмів";  
35) реактивів:  
- тритон X - 100,  
- гуанідину гидрохлорид,  
- ЕДТА (етилендиамінтетраоцетова кислота),  
- додецилсульфат натрію,  
- суспензія двоокису кремнію,  
- фенол водонасичений,  
- хлороформ водонасичений,  
- спирт етиловий ректифікований,  
- ацетат амонія,  
- протеиназа До,

- магнію хлорид,  
- калію хлорид,  
- водний розчин дезоксинуклетидтрифосфатів (0,1 М),  
- креозоловий червоний,  
- термостабільна ДНК-полімераза,  
- олія вазелінова,  
- трис-ацетат,  
- крижана оцтова кислота,  
- агароза для електрофорезу,  
- бромистий етидій,  
- вода деіонізована.  
5.12. Допускаються до використання тест-системи, комплекти (набори) реагентів і матеріали аналогічного призначення інших типів, дозволені до застосування в установленому порядку і з характеристиками, що забезпечують проведення досліджень відповідно до справжніх Методичних вказівкок.

5.13. Відібрані згідно зі встановленим порядком і нормами відбору проб (відповідно до офіційно ухвалених нормативних і технічних документів) зразки готують до процедури виділення ДНК ГММ і МГМА двома способами, залежно від їх приналежності до груп харчової продукції :  
- із зразків проб ферментних препаратів, заквашувальних і стартерів культур, БАД готують розчини 30% -ої концентрації в стерильній деіонізованій воді. Для цього вносять 300 міліграм (мкл) порошку або суспензії початкового зразка в 700 мкл стерильної деіонізованої води і перемішують на вихровому змішувачі впродовж 3 - 5 с. При необхідності зразок заздалегідь змізерніють до гомогенного стану в ступці або з допомогою гомогенізатора;

- із зразків інших  харчових продуктів готують розчини  50% -ої концентрації, для чого до 500 міліграма (мкл) проби додають  500 мкл стерильної деіонізованої води і перемішують на вихровому змішувачі впродовж 3 - 5 с. Твердий зразок заздалегідь змізерніють до гомогенного стану в ступці або за допомогою гомогенізатора.  
Підготовлені зразки використовують для аналізу того ж дня. Допускається зберігання зразків при температурі мінус 20 °C не більше 2-х тижнів.  
5.14. Виділення ДНК ГММ і МГМА із зразків досліджуваної харчової продукції проводять з використанням комплектів (наборовши) реагентів для виявлення селективних маркерів генно-инженерно-модифицированных мікроорганізмів. Допускається застосування фенол-хлороформного або іншого адекватного методу екстракції ДНК.  
5.15. Виділення ДНК із заквашувальних і стартерів культур, БАД до їжі, ферментних препаратів проводять з використанням комплекту N 1А "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованихмодифікованих мікроорганізмів".  
Комплект N 1А для виділення ДНК включає:  
- розчин, що лізирує, гуанидинтиоцианат (розчин 1), що містить, - 1 фл. (30 мл);  
- розчин для відмивання, гуанидинтиоцианат (розчин 2), що містить, - 1 фл. (15 мл);  
- розчин для відмивання (розчин 3) - 2 фл. (по 70 мл);  
- суспензія двоокису кремнію - 1 пробірки (0,5 мл).

 5.16. Виділення ДНК комплектом N 1А включає наступні етапи:  
- досліджуваний матеріал в об'ємі 700 мкл центрифугируют впродовж 10 хвилин при кімнатній температурі ( 18 - 25 °C) при 12000 о./хв.;  
- видаляють 600 мкл надосадочної рідини; матеріал (100 - 110 мкл), що залишився, ретельно перемішують в пробірці на вортексі і додають до суспензії 300 мкл розчину 1 і 5 мкл суспензії двоокису кремнію;  
- проби інкубують впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі, періодично перемішуючи на вортексі;  
- проби центрифугують впродовж 30 сек., при кімнатній температурі при 12000 о./хв., супернатант видаляють;  
- до осаду додають 150 мкл розчину 2, струшують його на вортексе і центрифугируют впродовж 30 сек. при кімнатній температурі при 12000 о./хв., супернатант видаляють;  
- до осаду додають 700 мкл розчину 3, струшують його на вортексе і центрифугируют впродовж 30 сек. при кімнатній температурі при 12000 о./хв., супернатант видаляють; проводять повторну процедуру відмивання;

- додатковим центрифугуванням  з подальшим видаленням супернатанту  прибирають залишки розчину 3, проби підсушують впродовж 5 хв. при  температурі 45 °C, залишаючи пробірки відкритими;  
- додають в кожну пробірку 50 мкл деіонізованої води, перемішують на вортексе і інкубують впродовж 5 хв. при температурі 45 °C;  
- проби центрифугируют при кімнатній температурі впродовж 30 сек. при 12000 о./хв., водну фазу відбирають в іншу пробірку і використовують як досліджуваний зразок ДНК для постановки реакції ампліфікації або зберігають при температурі - 20 °C не більше двох тижнів.

5.17. Виділення ДНК ГММ і МГМА з харчових продуктів проводять з використанням комплекту N 1Б "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованих мікроорганізмів". При підвищеному вмісті жирів проводиться додаткова екстракція суспензією неполярних розчинників з водою для перекладу ДНК, що міститься в харчовому продукті, у водну фазу, в якій і робиться подальше очищення.

Комплект N 1Б для виділення ДНК  з харчових продуктів включає:

- розчин 1 (буфер, що лізирує, pH 8,0) - 1 фл. (15 мл);

- розчин 2 (суміш фенолу з хлороформом, 1:1) - 1 фл. (20 мл);

- розчин 2 (суміш фенолу з хлороформом, 1:1) - 1 фл. (20 мл);

- розчин 3 (хлороформ) - 1 фл. (20 мл);

- розчин 4 (ацетат амонія 5 М) - 1 фл. (5,0 мл);

- розчин 5 (спирт етиловий 96%) - 4 фл. (по 20 мл);

- розчин 6 (спирт етиловий 75%) - 1 фл. (12 мл);

- розчин 7 (ТЕ-буфер, pH 8,0) - 1 фл. (6,0 мл);

- протеиназу До - 1 пробірки (3,0 міліграми).

3.18. Виділення ДНК комплектом N 1Б включає наступні етапи:

- розчин 1 прогрівають при температурі  25 °C до повного розчинення  осаду, безпосередньо перед застосуванням  до розчину 1 додають протеиназу До до концентрації 200 мкг/мл (0,001 г на 5,0 мл);