Химические основы строения ДНК

Министерство  образования российской федерации

Южно-уральский  государственный университет

Кафедра «Экономики и Управления»

Дисциплина  «Концепция современного естествознания» 
 
 

Реферат

«Химические основы строения ДНК» 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Выполнил: студент  ЭиУ-232

Седракян  Игорь

Проверил: Сенин А.В. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Челябинск

2005г.

Содержание 
 
 

1. Введение
2. Структура ДНК
3. Состав ДНК
4. Макромолекулярная структура ДНК

     4.1 Выделение дезоксирибонуклеиновых  кислот

     4.2 Фракционирование

5. Функции ДНК
6. Межнуклеотидные связи

     6.1 Межнуклеотидная связь в ДНК

   7.  Матричный синтез ДНК

     7.1 ДНК-полимеразы

     7.2 Инициация цепей  ДНК

     7.3 Расплетение двойной спирали  ДНК

     7.4Прерывистый  синтез ДНК

     7.5 Кооперативное действие белков  репликационной вилки

8. Заключение

9. Использованные источники

1. Введение

Наследуемые признаки заложены в материальных единицах, генах, которые располагаются в  хромосомах клеточного ядра. Химическая природа генов известна с 1944 г.: речь идет о дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК). Физическая структура была выяснена в 1953 г.  Двойная спираль этой макромолекулы объясняет механизм наследственной передачи признаков.

Присматриваясь  к окружающему нас миру, мы отмечаем великое разнообразие живых существ  – от растений до животных. Под этим кажущимся разнообразием в действительности скрывается удивительное единство живых клеток – элементов, из которых собран любой организм и взаимодействием которых определяется  его гармоничное существование. С позиции вида сходство между отдельными особями велико, и все-таки не существует двух абсолютно идентичных организмов (не считая однояйцовых близнецов). В конце XIX века в работах Грегора Менделя были сформулированы основные законы, определившие наследственную передачу признаков из поколения в поколение. В начале ХХ века в опытах Т.Моргана было показано, что элементарные наследуемые признаки обусловлены материальными единицами (генами), локализованными в хромосомах, где они располагаются последовательно друг за другом.

В 1944 г. работы Эвери, Мак-Леода и Мак-Карти определили химическую природу генов: они состоят из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Через 10 лет Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили модель физической структуры молекулы ДНК. Длинная молекула образована двойной спиралью, а комплиментарное взаимодействие между двумя нитями этой спирали позволяет понять, каким образом генетическая информация точно копируется (реплицируется) и передается последующим поколениям.

Одновременно  с этими открытиями ученые пытались проанализировать и «продукты» генов, т.е. те молекулы, которые синтезируются в клетках под их контролем. Работы Эфрусси, Бидла и Татума накануне второй мировой войны выдвинули идею о том, что гены «продуцируют» белки. Итак, ген хранит информацию для синтеза белка (фермента), необходимого для успешного осуществления в клетке определенной реакции. Но пришлось подождать до 60-х годов, прежде чем был разгадан сложный механизм расшифровки информации, заключенной в ДНК, и ее перевода в форму белка. В конце концов, во многом благодаря трудам Ниренберга (США), был открыт закон соответствия между ДНК и белками – генетический код. 
 
 
 
 
 

2. Структура ДНК.

   В 1869 году швейцарский биохимик Фридрих Мишер обнаружил в ядре клеток соединения с кислотными свойствами и с еще большей молекулярной массой, чем белки. Альтман назвал их нуклеиновыми кислотами, от латинского слова «нуклеус» - ядро. Так же, как и белки, нуклеиновые кислоты являются полимерами. Мономерами их служат нуклеотиды, в связи с чем нуклеиновые кислоты можно еще назвать полинуклеотидами.

Нуклеиновые кислоты  были найдены в клетках всех организмов, начиная от простейших и кончая высшими. Самое удивительное, что химический состав, структура и основные свойства этих веществ оказались сходными у разнообразных живых организмов. Но если в построении белков принимают участие около 20 видов аминокислот, то разных нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот, всего четыре.

     Нуклеиновые кислоты различают на две разновидности — дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). В состав ДНК входят азотистые основания (аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), цитозин (Ц)), дезоксирибоза С₅Н₁₀О₄ и остаток фосфорной кислоты. В состав РНК вместо тимина входит урацил (У), а вместо дезоксирибозы — рибоза (С5Н10О5). Мономерами ДНК и РНК являются нуклеотиды, которые состоят из азотистых, пуриновых (аденин и гуанин) и пиримидиновых (урацил, тимин и цитозин) оснований, остатка фосфорной кислоты и углеводов (рибозы и дезоксирибозы).

     Молекулы  ДНК содержатся в хромосомах ядра клетки живых организмов, в эквивалентных  структурах митохондрий, хлоропластов, в прокариотных клетках и во многих вирусах. По своей структуре молекула ДНК похожа на двойную спираль. Структурная модель ДНК в 
виде двойной спирали впервые предложена в 1953 г. американским биохимиком Дж. Уотсоном и английским биофизиком и генетиком Ф. Криком, удостоенными вместе с английским биофизиком М. Уилкинсоном, получившим рентгенограмму ДНК, Нобелевской премии 1962 г. Нуклеиновые кислоты - это биополимеры, макромолекулы которых состоят из многократно повторяющихся звеньев - нуклеотидов. Поэтому их называют также полинуклеотидами. Важнейшей характеристикой нуклеиновых кислот является их нуклеотидный состав. В состав нуклеотида - структурного звена нуклеиновых кислот - входят три составные части:

азотистое основание - пиримидиновое или пуриновое. В нуклеиновых кислотах содержатся основания 4-х разных видов: два из них относятся к классу пуринов и два – к классу пиримидинов. Азот, содержащийся в кольцах, придает молекулам основные свойства.

моносахарид - рибоза или 2-дезоксирибоза. Сахар, входящий в состав нуклеотида, содержит пять углеродных атомов, т.е. представляет собой пентозу. В зависимости от вида пентозы, присутствующей в нуклеотиде, различают два вида нуклеиновых кислот – рибонуклеиновые кислоты (РНК), которые содержат рибозу, и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), содержащие дизоксирибозу.

остаток фосфорной  кислоты. Нуклеиновые кислоты являются кислотами потому, что в их молекулах  содержится фосфорная кислота.

Нуклеотид - фосфорный  эфир нуклеозида. В состав нуклеозида входят два компонента: моносахарид (рибоза или дезоксирибоза) и азотистое основание.

.

Метод определения  состава ПК основан на анализе  гидролизатов, образующихся при их ферментативном или химическом расщеплении. Обычно используются три способа химического расщепления НК. Кислотный гидролиз в жестких условиях (70%-ная хлорная кислота, 100°С, 1ч или 100%-ная муравьиная кислота, 175 °C, 2 ч), применяемый для анализа как ДНК, так и РНК, приводит к разрыву всех N-гликозидных связей и образованию смеси пуриновых и пиримидиновых оснований.

     Нуклеотиды  соединяются в цепь посредством  ковалентных связей. Образованные таким  образом цепи нуклеотидов объединяется в одну молекулу ДНК по всей длине  водородными связями: адениновый нуклео-тид  одной цепи соединяется с тиминовым нуклеотидом другой цепи, а гуаниновый — с цитозиновым . При этом аденин всегда распознает только тимин и связывается с ним и наоборот. Подобную пару образуют гуанин и цитозин. Такие пары оснований, как и нуклеотиды, называются комплементарными, а сам принцип формирования двухцепочной молекулы ДНК — принципом комплементарности. Число нуклеотидных пар, например, в организме человека составляет 3 — 3,5 млрд.

ДНК — материальный носитель наследственной информации, которая кодируется последовательностью нуклеотидов. Расположение четырех типов нуклеотидов в цепях ДНК определяет последовательность аминокислот в молекулах белка, т.е. их первичную структуру. От набора белков зависят свойства клеток и индивидуальные признаки организмов. Определенное сочетание нуклеотидов, несущих информацию о структуре белка, и последовательность их расположения в молекуле ДНК образуют генетический код. Ген (от греч. genos — род, происхождение) — единица наследственного материала, ответственная за формирование какого-либо признака. Он занимает участок молекулы ДНК, определяющий структуру одной молекулы белка. Совокупность генов, содержащихся в одинарном наборе хромосом данного организма, называется геномом, а генетическая конституция организма (совокупность всех его генов) — генотипом. Нарушение последовательности нуклеотидов в цепи ДНК, а следовательно, в генотипе приводит к наследственным изменениям в организме—мутациям.

Для молекул  ДНК характерно важное свойство удвоения — образования двух одинаковых двойных  спиралей, каждая из которых идентична исходной молекуле. Такой процесс удвоения молекулы ДНК называется репликацией. Репликация включает в себя разрыв старых и формирование новых водородных связей, объединяющих цепи нуклеотидов. В начале репликации две старые цепи начинают раскручиваться и отделяться друг от друга. Затем по принципу комплементарности к двум старым цепям пристраиваются новые. Так образуются две идентичные двойные спирали. Репликация обеспечивает точное копирование генетической информации, заключенной в молекулах ДНК, и передает ее по наследству от поколения к поколению. 
 
 
 

3. Состав  ДНК

   ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) - биологический полимер, состоящий из двух полинуклеотидных цепей, соединенных друг с другом. Мономеры, составляющие каждую из цепей ДНК, представляют собой сложные органические соединения, включающие одно из четырех азотистых оснований: аденин (А) или тимин (Т), цитозин (Ц) или гуанин (Г); пятиатомный сахар пентозу - дезоксирибозу, по имени которой получила название и сама ДНК, а также остаток фосфорной кислоты. Эти соединения носят название нуклеотидов. В каждой цепи нуклеотиды соединяются путем образования ковалентных связей между дезоксирибозой одного и остатком фосфорной кислоты последующего нуклеотида. Объединяются две цепи в одну молекулу при помощи водородных связей, возникающих между азотистыми основаниями, входящими в состав нуклеотидов, образующих разные цепи.

Исследуя нуклеотидный состав ДНК различного происхождения, Чаргафф обнаружил следующие  закономерности.

1. Все ДНК  независимо от их происхождения содержат одинаковое число пуриновых и пиримидиновых оснований. Следовательно, в любой ДНК на каждый пуриновый нуклеотид приходится один пиримидиновый.

2. Любая ДНК  всегда содержит в равных количествах  попарно аденин и тимин, гуанин и цитозин, что обычно обозначают как А=Т и G=C. Из этих закономерностей вытекает третья.

3. Количество  оснований, содержащих аминогруппы  в положении 4 пиримидинового  ядра и 6 пуринового (цитозин и  аденин), равно количеству оснований,  содержащих оксо-группу в тех же положениях (гуанин и тимин), т. е. A+C=G+T. Эти закономерности получили название правил Чаргаффа. Наряду с этим было установлено, что для каждого типа ДНК суммарное содержание гуанина и цитозина не равно суммарному содержанию аденина и тимина, т. е. что (G+C)/(A+T), как правило, отличается от единицы (может быть как больше, так и меньше ее). По этому признаку различают два основных типа ДНК: А Т-тип с преимущественным содержанием аденина и тимина и G C-тип с преимущественным содержанием гуанина и цитозина.

Величину отношения  содержания суммы гуанина и цитозина к сумме содержания аденина и  тимина, характеризующую нуклеотидный состав данного вида ДНК, принято  называть коэффициентом специфичности. Каждая ДНК имеет характерный коэффициент специфичности, который может изменяться в пределах от 0,3 до 2,8. При подсчете коэффициента специфичности учитывается содержание минорных оснований, а также замены основных оснований их производными. Например, при подсчете коэффициента специфичности для ЭДНК зародышей пшеницы, в которой содержится 6% 5-метилцитозина, последний входит в сумму содержания гуанина (22,7%) и цитозина (16,8%). Смысл правил Чаргаффа для ДНК стал понятным после установления ее пространственной структуры. 
 

4. Макромолекулярная структура ДНК

В 1953 г. Уотсон и  Крик, опираясь на известные данные о конформаци нуклеозидных остатков, о характере межнуклеотидной  связи в ДНК и закономерности нуклеотидного состава ДНК (правила  Чаргаффа), расшифровали рентгенограммы паракристаллической формы ДНК [так называемой В-формы, образующейся при влажности выше 80% и при высокой концентрации противоионов (Li+) в образце]. Согласно их модели, молекула ДНК представляет собой правильную спираль, образованную двумя полидезоксирибонуклеотидными цепями, закрученными относительно друг друга и вокруг общей оси. Диаметр спирали практически постоянен вдоль всей ее длины и равен 1,8 нм (18 А).

Макромолекулярная структура ДНК.

(а)—Модель Уотсона — Крика;

(6)—параметры спиралей В-, С- и Т-форм ДНК (проекции перпендикулярно оси спирали);

(в)—поперечный разрез спирали ДНК в В-форме (заштрихованные прямоугольники изображают пары оснований);

(г)—параметры спирали ДНК в А-форме;

(д)—поперечный разрез спирали ДНК в А-форме. 

Длина витка  спирали, который соответствует  ее периоду идентичности, составляет 3,37 нм (33,7 А). На один виток спирали приходится 10 остатков оснований в одной цепи. Расстояние между плоскостями оснований равно, таким образом, примерно 0,34 нм (3,4 А). Плоскости остатков оснований перпендикулярны длинной оси спирали. Плоскости углеводных остатков несколько отклоняются от этой оси (первоначально Уотсон и .Крик предположили, что они параллельны ей).

Из рисунка  видно, что углеводофосфатный остов  молекулы обращен наружу. Спираль  закручена таким образом, что  на ее поверхности можно выделить две различные по размерам бороздки (их часто называют также желобками) — большую, шириной примерно 2,2 нм (22 А), и малую —шириной около 1,2 нм (12А). Спираль — правовращающая. Полидезоксирибонуклеотидные цепи в ней антипараллельны: это означает, что если мы будем двигаться вдоль длинной оси спирали от одного ее конца к другому, то в одной цепи мы будем проходить фосфодиэфирные связи в направлении 3'à5', а в другой — в направлении 5'à3'. Иными словами, на каждом из концов линейной молекулы ДНК расположены     5'-конец одной и 3'-конец другой цепи.

Регулярность  спирали требует, чтобы против остатка  пуринового основания в одной  цепи находился остаток пиримидинового основания в другой цепи. Как уже  подчеркивалось, это требование реализуется в виде принципа образования комплементарных пар оснований, т. е. остаткам аденина и гуанина в одной цепи соответствуют остатки тимина и цитозина в другой цепи (и наоборот).

Таким образом, последовательность нуклеотидов в  одной цепи молекулы ДНК предопределяет нуклеотидную последовательность другой цепи.

Этот принцип  является главным следствием модели Уотсона и Крика, поскольку он в удивительно простых химических терминах объясняет основное функциональное назначение ДНК — быть хранителем генетической информации.

Заканчивая рассмотрение модели Уотсона и Крика, остается добавить, что соседние пары остатков оснований в ДНК, находящейся  в В-форме, повернуты друг относительно друга на 36° (угол между прямыми, соединяющими атомы С¹' в соседних комплементарных парах). 

4.1 Выделение дезоксирибонуклеиновых кислот 

Живые клетки, за исключением сперматозоидов, в норме  содержат значительно больше рибонуклеиновой, чем дезоксирибонуклеиновой кислоты. На методы выделения дезоксирибонуклеиновых кислот оказало большое влияние то обстоятельство, что, тогда как рибонуклеопротеиды и рибонуклеиновые кислоты растворимы в разбавленном (0,15 М) растворе хлористого натрия, дезоксирибонуклеопротеидные комплексы фактически в нем нерастворимы. Поэтому гомогенизированный орган или организм тщательно промывают разбавленным солевым раствором, из остатка с помощью крепкого солевого раствора экстрагируют дезоксирибонуклеиновую кислоту, которую осаждают затем добавлением этанола. С другой стороны, элюирование того же остатка водой дает раствор, из которого при добавлении соли выпадает дезоксирибонуклеопротеид. Расщепление нуклеопротеида, который в основном представляет собой солеподобный комплекс между полиосновными и поликислотными электролитами, легко достигается растворением в крепком солевом растворе или обработкой тиоцианатом калия. Большую часть белка можно удалить либо добавлением этанола, либо эмульгированием с помощью хлороформа и амилового спирта (белок образует с хлороформом гель). Широко применялась также обработка детергентами. Позднее дезоксирибонуклеиновые кислоты выделяли с помощью экстракции водными n-аминосалицилат — фенольными растворами. При использовании этого метода были получены препараты дезоксирибонуклеиновой кислоты, из которых одни содержали остаточный белок, тогда как другие были фактически свободны от белка, что указывает на то, что характер связи белок — нуклеиновая кислота различен в различных тканях. Удобная модификация состоит в гомогенизировании животной ткани в 0,15 М растворе фенолфталеиндифосфата с последующим добавлением фенола для осаждения ДНК (свободной от РНК) с хорошим выходом.

Дезоксирибонуклеиновые  кислоты, каким бы способом они не выделялись, представляют собой смеси  полимеров различного молекулярного  веса, за исключением образцов, полученных из некоторых видов бактериофагов. 

4.2 Фракционирование 

Ранний метод  разделения заключался в фракционной  диссоциации гелей дезоксирибонуклеопротеида (например, нуклеогистона) посредством  экстракции водными растворами хлористого натрия увеличивающейся молярности. Таким путем препараты дезоксирибонуклеиновой кислоты были разделены на ряд фракций, характеризующихся различным отношением содержания аденина с тимином к сумме гуанина с цитозином, причем более легко выделялись фракции, обогащенные гуанином и цитозином. Сходные результаты были получены при хроматографическом отделении дезоксирибонуклеиновой кислоты от гистона, адсорбированного на кизельгуре, с применением градиентного элюирования растворами хлористого натрия. В улучшенном варианте этого метода очищенные фракции гистона сочетались с n-аминобензилцеллюлозой с образованием диазомостиков от тирозиновых и гистидиновых групп белка. Описано также фракционирование нуклеиновых кислот на метилированном сывороточном альбумине (с кизельгуром в качестве носителя). Скорость элюирования с колонки солевыми растворами увеличивающейся концентрации зависит от молекулярного веса, состава (нуклеиновые кислоты с высоким содержанием гуанина с цитозином элюируются легче) и вторичной структуры (денатурированная ДНК прочнее удерживается колонкой, чем нативная). Таким способом из ДНК морского краба Cancer borealis выделен природный компонент — полидезоксиадениловая-тимидиловая кислота. Фракционирование дезоксирибонуклеиновых кислот проводилось также посредством градиентного элюирования с колонки, наполненной фосфатом кальция.

5. Функции ДНК

      В молекуле ДНК с помощью биологического кода зашифрована последовательность аминокислот в пептидах. Каждая аминокислота кодируется сочетанием трех нуклеотидов, в этом случае образуется 64 триплета, из которых 61 кодируют аминокислоты, а 3 являются бессмысленными и выполняют функцию знаков препинания (АТТ, АЦТ, АТЦ). Шифрование одной аминокислоты несколькими триплетами получило название как вырожденность триплетного кода. Важными свойствами генетического кода является его специфичность (каждый триплет способен кодировать только одну аминокислоту), универсальность (свидетельствует о единстве происхождения всего живого на Земле) и неперекрываемость кодонов при считывании.

        ДНК выполняет следующие функции:

хранение наследственной информации происходит с помощью  гистонов. Молекула ДНК сворачивается, образуя вначале нуклеосому, а  после гетерохроматин, из которого состоят хромосомы;

передача наследственного  материала происходит путем репликации ДНК;

реализация наследственной информации в процессе синтеза белка. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

6. Межнуклеотидные связи

Работы по определению  способа соединения нуклеотидов  в полимерных молекулах НК были успешно  завершены в начале 50-х годов  сразу после того, как была установлена структура нуклеотидов и изучены некоторые свойства их производных (главным образом эфиров). К этому же времени были разработаны методы выделения и очистки ДНК и РНК, так что исследование природы межмономерных связей проводилось с использованием чистых, хотя и сильно деградированных препаратов НК.

Первые сведения о типе межмономерной, или, как ее принято называть, межнуклеотидной  связи были получены с помощью  потенциометрического титрования. Эти  сведения свидетельствовали о наличие  как в РНК, так и в ДНК только одной гидроксильной группы у каждой фосфатной группы. На основании этого было сделано заключение, что НК содержит структурную единицу дизамещенной фосфорной кислоты.

Естественно было предположить, что фосфатные остатки  «сшивают» нуклеозиды за счет двух своих гидроксилов, а один остается свободным. Оставалось выяснить, какие части нуклеозидных фрагментов участвуют в образовании связи с фосфатными группами.

Поскольку НК могут  быть дезаминированы действием азотистой  кислоты, очевидно, что аминогруппы  пиримидиновых и пуриновых оснований  не принимают участия в образовании  межнуклеотидной связи. Помимо этого  потенциометрическое титрование указывало, что и оксо(окси)-группы остатков гуанина и урацила, входящих в состав НК, свободны. На основании этих данных было сделано заключение о том, что межнуклеотидные связи образованы фосфатной группой и гидроксильными группами углеводных остатков (т. е. что они являются фосфодиэфирными), которые, следовательно, и являются ответственными за образование полимерной цепи (НК). Таким образом, то, что принято обычно называть межнуклеотидной связью, представляет собой по существу узел, включающий систему связей: 

(где С —  первичный или вторичный атомы углерода остатка углевода). При гидролизе ДНК и РНК в зависимости от условий реакции, образуются нуклеотиды с разным положением фосфатного остатка:

Если предположить, что в НК все межнуклеотидные  связи идентичны, то, очевидно, что они могут включать помимо фосфатного остатка только З'-гидроксильную группу одного нуклеозидного звена и 5'-гидроксильную группу другого нуклеозидного звена (3'—У-связь). В случае же их неравноценности в полимерной цепи ДНК могли бы одновременно существовать три типа связей: 3'—5', 3'—3' и 5'—5'. Для РНК за счет участия 2^/-гидpoкcилыIoй группы число типов связи должно было быть еще больше.

Установить истинную природу межнуклеотидных связей в нативных ДНК и РНК удалось  в результате направленного расщепления биополимеров с помощью химического и ферментативного гидролиза и последующего выделения и идентификации полученных при этом фрагментов. 

6.1 Межнуклеотидная связь в ДНК 

Химический гидролиз ДНК с целью установления природы  межнуклеотидной связи оказался практически непригодным. ДНК не расщепляется при щелочных значениях рН, что хорошо согласуется с предположением о фосфодиэфирной природе межнуклеотидной связи. При обработке кислотой даже в мягких условиях ДНК расщепляется как по фосфодиэфирным, так и по N-гликозидным связям, образованным пуриновыми основаниями. Вследствие этого расщепление полимера протекает неоднозначно, но из продуктов кислотного гидролиза ДНК все же удалось выделить дифосфаты пиримидиновых дезоксинуклеозидов, которые оказались идентичными синтетическим 3',5'-дифосфатам дезоксицитидина и дезокситимидина:

Здесь же важно  отметить, что наличие этих соединений в продуктах деградации ДНК указывает  на участие обеих гидроксильных  групп, по крайней мере пиримидиновых  мономерных компонентов, в образовании межнуклеотидной связи.

Более специфическим  оказалось ферментативное расщепление  ДНК. При обработке препаратов ДНК  фосфодиэстеразой  (ФДЭ) змеиного яда  полимер практически полностью  гидролизуется до дезоксинуклеозид-5'-фосфатов, структура которых была установлена сравнением с соответствующими нуклеотидами, полученными встречным синтезом.

Эти данные свидетельствуют  об участии 5'-гидроксильных групп  всех четырех дезоксинуклеозидов, входящих в состав ДНК, в образовании межнуклеотидной  связи. Аналогично, но до 3'-фосфатов дезоксинуклеозидов расщепляется ДНК в присутствии ФДЭ, выделенной из микрококков или из селезенки.