Хроматография, как метод анализа лекарственного растительного сырья

Введение.

Фитотерапия и фитопрофилактика сегодня все шире и прочнее внедряются в медицинскую практику. Целесообразно применение лекарственных растений при первичной профилактике ряда заболеваний, поддерживающей или курсовой терапии. В настоящее время ассортимент лекарственных средств растительного происхождения, применяемых в отечественном здравоохранении, составляет более 40%. Не противопоставляя препараты, созданные на основе химического синтеза, лекарственным средствам, созданным на основе лекарственных растений, отметим, что последние обладают в ряде случаев менее выраженными побочными эффектами, обладая, однако несомненной эффективностью. Практикующие врачи должны иметь базовую информацию о современной научной трактовке традиционных подходов к лечению лекарственными растениями для определения их места в комплексном лечении. Это делает проблему изучения химического состава растений чрезвычайно важной и современные хроматографические методы здесь незаменимы. Выявление биологически активных соединений, присутствующих в том или ином лекарственном растении (или группе растений), помогает решению данной задачи, а также позволяет прогнозировать взаимосочетаемость и взаимодополняемость лекарственных растений для составления многокомпонентных сборов.

 В ГФ XI включены 83 статьи  на лекарственное растительное  сырье. Одним из обязательных  разделов при определении подлинности  лекарственного растительного сырья  является раздел «Качественные  реакции», который в настоящее  время включает как собственно  качественные и гистохимические  реакции, так и проведение хроматографического  анализа. Однако качественные реакции  не позволяют с уверенностью  говорить об идентификации сырья, а лишь о присутствии в сырье  определенной группы или ряда  групп биологически активных  веществ, часто не специфических  для данного вида сырья. Только  хроматографическая методика анализа  с использованием стандартных образцов и стандартных хроматограмм позволяет уверенно говорить об идентификации сырья.

Цели данного исследования:

1. изучить хроматографичесике методы в анализе лекарственного растительного сырья;
2. изучить газоадсорбционную хроматографию в анализе лекарственных и ядовитых растений;
3. изучить и дать характеристику хроматографических методов лекарственного растительного сырья.

Задачей данной курсовой является - изучение современного состояния хроматографических методов, внедренных в фармацевтическую практику.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обзор литературы:

1. Хроматография, как метод анализа лекарственного растительного сырья.

Хроматографический метод анализа был впервые разработан в 1903 г. ботаником М. Цветом для разделения пигментов растений. С тех пор разработаны различные варианты этого метода. Хроматографический метод разделения смеси веществ на компоненты основан на различиях в их физических и химических свойствах, влияющих на скорость распределения веществ из смесей между двумя фазами в условиях направленного относительного движения этих фаз.

При исследовании растений используют различные варианты метода хроматографии, имеющие самостоятельное значение.

Большое значение при исследовании растений приобрела распределительная хроматография, которую в зависимости от способа получения хроматограмм разделяют на бумажную, в тонком слое сорбента и колоночную.

Пользуясь методами хроматографии, можно разделить извлечения из растений на компоненты активных веществ, установить их подлинность, провести количественное определение компонентов, определить степень чистоты растительных препаратов.

 Хроматографические методы.

В соответствии с общей фармакопейной статье Хроматографией называется метод разделения смесей веществ, основанный на их многократном перераспределении между двумя контактирующими фазами, одна из которых неподвижна, а другая имеет постоянной направление движения.

Хроматографические методы анализа используются для разделения смеси веществ или частиц (например, ионов) и основаны на различии в скорости их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. Поэтому хроматография применяется как на этапе пробоподготовки (очистки анализируемого компонента или смеси компонентов от сопутствующих примесей), так и в ходе непосредственного качественного и количественного анализов. При этом идентификация компонентов проводится по параметрам их удерживания в сравнении со стандартными образцами (свидетелями). Определение содержания искомых соединений или их групп в исходной смеси после хроматографического разделения проводится другими физико-химическими методами в зависимости от способа детекции.

Хроматограмма и хроматографические параметры.

В соответствии с фармакопейной статьёй на хроматографию хроматограмма представляет собой графическое или иное представление сигнала детектора, концентрации веществ в элюате или другой количественной величины, используемой для измерения концентрации веществ в элюате, от времени или объема подвижной фазы. В планарной (плоскостной) хроматографии хроматограммой называют также зафиксированную на бумаге (бумажная хроматография) или ТСХ-пластинке (тонкослойная хроматография) последовательность зон адсорбции веществ

исходной (анализируемой) смеси.

Виды хроматографии.

По механизму разделения различают следующие виды хроматографии, применяемые в анализе лекарственного растительного сырья.

1. Адсорбционная хроматография, в основе которой лежит непрерывный обмен хроматографируемым веществом между неподвижной (твёрдой или жидкой) и подвижной фазами, обусловленный существованием на поверхности раздела фаз динамического равновесия между процессами адсорбции и десорбции хроматографируемого вещества, растворённого в подвижной фазе.

2. Распределительная хроматография, в основе которой лежит процесс непрерывного перераспределения хроматографируемого вещества между подвижной и неподвижной фазами, причём это вещество растворимо в каждой из фаз.

3. Ионообменная хроматография, в основе которой лежит обратимая хемосорбция ионов анализируемого раствора ионогенными группами сорбента. В зависимости от характера ионогенных групп ионообменные сорбенты (иониты) подразделяются на катионообменные (катиониты) и анионообменные (аниониты). Ионообменная хроматография в современном фармакогностическом анализе применяется весьма ограниченно, главным образом для очистки анализируемых компонентов от сопутствующих примесей.

Методы хроматографии.

В анализе лекарственного растительного сырья применяется несколько методов хроматографического разделения, подразумевающих соответствующее аппаратурное оформление.

1. Адсорбционная хроматография на колонках используется главным образом для очистки анализируемых компонентов от сопутствующих примесей. Классическая хроматографическая колонка представляет собой стеклянную трубку, заполненную сорбентом. Для разделения и очистки соединений растительного происхождения чаще всего используют полиамидный сорбент и силикагель, реже применяют колоночную хроматографию на сефадексе и алюминия оксиде. Так, очистку суммы флавоноидов травы сушеницы топяной и плодов боярышника, суммы ксантонов в траве золототысячника проводят с помощью адсорбционной хроматографии на полиамидном сорбенте. Затем в полученном элюате спектрофотометрическим методом определяют содержание действующих веществ.

2. Как вариант адсорбционной и/или распределительной колоночной хроматографии для очистки многокомпонентных смесей растительного происхождения в последнее время всё чаще применяется метод твёрдо-фазной экстракции (ТФЭ). ТФЭ отличается от классической колоночной хроматографии прежде всего принудительной подачей элюента под действием вакуума на выходе из хроматографической системы. Для получения разрежения определенной величины используют специальное герметичное устройство-приёмник (манифолд), в верхней части которого крепятся хроматографические «колонки» (патроны и/или картриджи), а к нижней подключен вакуум-насос с электроприводом.

3. Тонкослойная хроматография, или ТСХ (адсорбционная хроматография в тонком слое сорбента), чаще всего применяется при качественном анализе лекарственного растительного сырья или на стадии пробоподготовки для очистки анализируемых компонентов.

Используют хроматографические пластины с закреплённым или незакрепленным слоем сорбента. Наиболее распространены сорбенты на основе силикагеля, реже применяют алюминия оксид, целлюлозу или полиамидный сорбент. Качественный анализ компонентов лекарственного растительного сырья с применением ТСХ проводят путём детекции невооруженным глазом флуоресценции или окраски пятен в УФ и видимом свете при сравнении со свидетелями. Основным параметром при этом, наряду с характерным окрашиванием или флуоресценцией пятен, является относительное удерживание компонентов, или Rf. Использование метода ТСХ на стадии пробоподготовки в количественном анализе лекарственного растительного сырья предусматривает элюирование действующих веществ с хроматографической пластины и последующий анализ элюата другими методами. Например, разделение суммы флавоноидов цветков боярышника проводят на пластинах «Силуфол» или «Сорбфил», после чего пятно гиперозида элюируют с пластины, а его содержание в элюате определяют спектрофотометрическим методом.

 

На рисунке изображена хроматограмма на пластине гинсенозидов экстракта женьшеня.

 

В последнее время активно развивается метод количественной ТСХ с использованием специального прибора — денситометра, работа которого основана на измерении плотности флуоресценции или окраски пятна анализируемого компонента непосредственно на пластине. Для этого денситометр снабжён цифровой видеокамерой или сканером, а обработка полученных результатов производится с помощью специальной программы на компьютере. Применение денситометрии позволяет проводить экспресс-анализ компонентов сырья без их элюирования с пластины. Производство денситометров активно развивается как в России, так и за рубежом.

4. Использование хроматографии на бумаге (БХ), имеющей как распределительный, так и адсорбционный механизмы разделения компонентов, в настоящее время ограничено и применяется для качественного анализа лекарственного растительного сырья. По способу перемещения подвижной фазы различают восходящую, нисходящую и круговую БХ. Детекцию осуществляют сходным с ТСХ образом. Так, качественный анализ флавонолов листьев вахты трёхлистной проводят с помощью восходящей БХ с последующим проявлением хроматограммы раствором алюминия хлорида.

В самом общем виде все перечисленные методы хроматографии не требуют специального аппаратурного оформления, за исключением количественной ТСХ и твёрдо-фазной экстракции. К строго приборным методам хроматографического анализа относятся газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография.

Пример качественного анализа травы термопсиса ланцетовидного, семян термопсиса ланцетовидного методом хроматографии на бумаге.

На полоске хроматографической бумаги (длина 30—40 см, ширина 12 см) на стартовую линию, находящуюся на расстоянии 2—3 см от нижнего края, капилляром или специальной пипеткой наносят около 0,1 мл извлечения В из

травы термопсиса и из семян термопсиса, растворы цитизина, метилцитизина и пахикарпина. Расстояние от бокового края полоски хроматографической бумаги и между пятнами — 2 см. Диаметр пятен не должен превышать 5 мм.

Полоску хроматографической бумаги с нанесенными на нее растворами (после высушивания) помещают в хроматографическую камеру, в которую предварительно (за сутки) налита разделительная система: н-бутанол -уксусная кислота - вода (5 : 1 : 4).

Нижний край хроматограммы погружают в жидкость примерно на 3—5 мм (экспозиция — 14—15 ч).

Посл высушивания хроматограмму обрабатывают (опрыскивают из пульверизатора) реактивом Драгендорфа. На желтом фоне проявляются оранжевые или оранжево-красные пятна (алкалоиды).

5. Газовая хроматография (ГХ) - это хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара. В фармацевтическом анализе находят применение газожидкостная (ГЖХ) и газоадсорбционная хроматографии. В газожидкостной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость, нанесённая на твёрдый носитель, т.е. используется распределительный механизм разделения компонентов. В газоадсорбционной хроматографии неподвижной фазой является твёрдый адсорбент.

Достоинствами газовой хроматографии являются:

• сравнительная простота аппаратурного оформления;
• весьма широкие границы применимости (можно определять соединения, для которых достигается давление насыщенного пара 0,001-1 мм рт.ст.);
• возможность определения с высокой точностью малых количеств газов органических соединений с высокой точностью;
• быстрота анализа;
• широкий выбор сорбентов и неподвижных фаз;
• высокая гибкость изменения условий разделения;
• возможность осуществления химических реакций в хроматографической колонке или детекторе, что расширяет круг анализируемых соединений (реакционная газовая хроматография);
• повышение информативности при сочетании с различными инструментальными методами (масс-спектрометрией и ИК (Фурье) спектрометрией).

Характерные химические вещества, выступающие в роли маркеров для конкретных видов лекарственного растительного сырья, часто содержатся в растениях в весьма небольших концентрациях, поэтому чрезвычайно важно выбрать подходящий растворитель, на основе которого будут готовиться растительные экстракты для газохроматографического анализа. Извлечение должно быть по возможности максимальным.

Метод газовой хроматографии применяется для анализа летучих веществ, в том числе компонентов эфирных масел, например ледола и палюстрола в эфирном масле побегов багульника болотного.

Багульник болотный - Ledum palustre - являет собой пример растения с присущими ему весьма специфическими соединениями. Это, прежде всего, производное азулена ледол, получивший свое название от латинского наименования данного растения, а также его изомер палюстрол. Относительное содержание ледола и палюстрола в экстракте на основе ацетонитрила составляет, соответственно, 10,69±0,53 % и 12,52±0,56 % . Относительное содержание ледола и палюстрола составляет в экстракте на основе этилового спирта 0,46±0,02 % и 0,52±0,02 %.

Также возможно проведение химической модификации (дериватизации) компонентов анализируемой смеси с целью получения летучих производных и их последующий анализ методом ГХ. В качестве примера газохроматографического анализа с использованием дериватизации можно привести анализ летучих производных карбоновых кислот и моносахаридов, в том числе и растительного происхождения.

6. На базе колоночной хроматографии возникла высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). От классической колоночной хроматографии ВЭЖХ отличается использованием сорбентов с размером частиц 3-10 мкм, что обеспечивает быстрый массоперенос при очень высокой эффективности разделения. Для обеспечения беспрепятственного прохождения элюента через колонку с ультрамелким сорбентом на входе в хроматографическую систему создается высокое давление. Поэтому другим названием ВЭЖХ является «жидкостная хроматография высокого давления».

Лидирующее положение занимает обращённо-фазовая ВЭЖХ, в которой используются сорбенты на основе силикагеля с привитыми на его поверхности молекулами неполярных соединений, таких как высокомолекулярные углеводороды, фенолы и их производные. При этом хроматографическое разделение происходит за счёт распределительного (главным образом) и адсорбционного (в меньшей степени) механизмов, детектирование в ВЭЖХ осуществляется с помощью фотометрических и электрохимических методов анализа. Основное значение имеет спектрофотометрическая детекция в УФ области.

Преимуществом ВЭЖХ (особенно обращённо-фазовой) перед газовой хроматографией является возможность исследования практически любых объектов без каких-либо ограничений по их физико-химическим свойствам. Поэтому подавляющее большинство действующих веществ лекарственного растительного сырья может быть проанализировано этим методом (рис. 6). В фармацевтическом анализе метод ВЭЖХ в настоящее время используется главным образом при анализе препаратов на основе лекарственного растительного сырья, такого как женьшень, родиола розовая, шиповник и др.

 

 

 

2. Газоадсорбционная хроматография

Особенность метода газоадсорбционной хроматографии (ГАХ) в том, что в качестве неподвижной фазы применяют адсорбенты с высокой удельной поверхностью, и распределение веществ между неподвижной и подвижной фазами определяется процессом адсорбции. Адсорбция молекул из газовой фазы, т.е. концентрированных на поверхности раздела твердой и газообразной фаз, происходит за счет межмолекулярных взаимодействий (дисперсионных, ориентационных, индукционных), имеющих электростатическую природу. Адсорбционная активность зависит от удельной поверхности (определяется геометрической структурой носителя) и удельной поверхностной энергии (определяется химической структурой поверхности). Возможно, образование водородной связи, причем вклад этого вида взаимодействия в удерживаемые объемы значительно уменьшается с ростом температуры. Комплексообразование для селективного разделения веществ в ГХ используют редко.

В качестве адсорбентов для ГАХ в основном используют активные угли, силикагели, пористое стекло, оксид алюминия. Неоднородностью поверхности активных адсорбентов обусловлены основные недостатки метода ГАХ и невозможность определения сильно адсорбирующихся полярных молекул. Однако на геометрически и химически однородных макропористых адсорбентах можно проводить анализ смесей сильнополярных веществ. В последние годы выпускают адсорбенты с более или менее однородной поверхностью, такие, как пористые полимеры, макропористые силикагели (силохром, порасил, сферосил), пористые стекла, цеолиты.

Достоинствами адсорбентов в качестве неподвижных фаз являются способность выдерживать высокие температуры, отсутствие фонового сигнала при работе с ионизационными детекторами и высокая селективность.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Для аналитической практики важно, чтобы при постоянной температуре количество адсорбированного вещества на поверхности Сs было пропорционально концентрации этого вещества в газовой фазе Сm:

Cs = к*Сm,

т.е. чтобы распределение происходило в соответствии с линейной изотермой адсорбции (к — константа). В этом случае каждый компонент перемещается вдоль колонки с постоянной скоростью, не зависящей от его концентрации. Разделение веществ обусловлено различной скоростью их перемещения. Поэтому в ГАХ чрезвычайно важен выбор адсорбента, площадь и природа поверхности которого обусловливают селективность (разделение) при заданной температуре.

Если разделяют соединения, сильно различающиеся по летучести при постоянной температуре, то низкокипящие вещества элюируются быстро, высококипящие имеют большее время удерживания, их пики на хроматограмме будут ниже и шире, анализ занимает много времени. Если же в процессе хроматографирования    повышать    температуру  колонки с постоянной скоростью (программирование температуры), то близкие по ширине пики на хроматограмме будут располагаться равномерно.

 

Методика количественного определения каротина в плодах рябины обыкновенной (Fructus Sorbi).

Метод основа на экстракци каротина органическими растворителями (ацетон, бензин), очистку сопутствующих веществ методом хроматографической адсорбции. Количество каротина в очищенном растворе определяют колориметрически по интенсивности желтой окраски раствора сравнением его с раствором азобензола или раствором дихромата калия, который стандартизован по чистому каротину.

5—20 г измельченного сырья тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклянным порошком. Так как каротин в кислой среде неустойчив, то для нейтрализации кислот при растирании добавляют немного карбоната натрия. После растирания в ступку постепенно прибавляют 10 мл ацетона и снова растирают материал. Затем содержимое ступки фильтруют под вакуумом, смывают ступку ацетоном и промывают материал на фильтре небольшим порциями ацетона до исчезновения окраски стекающего фильтрата. Ацетоновый экстракт переносят в делительную воронку. Чтобы перевести пигмент в бензин, к экстракту в делительной воронке добавляют 10—20 мл бензина и смесь тщательно перемешивают. Ацетон из смеси удаляют промыванием водой, добавляя её в делительную воронку небольшими порциями и слегка встряхивая смесь. Промывные воды сливают, они не должны содержать растворимых в бензине пигментов.

Полностью освобожденный от ацетона бензиновый раствор сушат фильтрованием через безводный сульфат натрия. После этого хроматографической адсорбцией в бензиновом растворе отделяют каротин от хлорофилла, ксантофилла, ликопина и других пигментов.

На дно хроматографической колонки (диаметр 1—1,5 см, длина 15—20 см) плотно вставляют ватный тампон толщиной 1 см, который препятствует прохождению адсорбентов в приемник. Затем в колонку вносят небольшими порциями оксид алюминия, слегка уплотняя каждую порцию стеклянной палочкой. Длина столбика адсорбента в колонке должна составлять 5—7 см. Бензиновый раствор пигментов при слабом отсасывании пропускают через хроматографическую колонку (необходимо следить, чтобы на поверхности адсорбента постоянно был слой бензина, так как каротин окисляется под действием воздуха). Затем через колонку пропускают чистый бензин, пока весь каротин, отделяясь о других пигментов в виде желтой полоски, не пройдет в приемник. Каротин адсорбируется оксидом алюминия слабее других пигментов. Конец хроматографирования определяют по исчезновению желтой окраски вытекающего из колонки элюата. Бензиновый раствор каротина переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят бензином до метки. Так как химически чистый каротин нестойкое вещество, то при колориметрировании в качестве стандартного раствора используют раствор азобензола или раствор дихромата калия.

При колориметрировании в одну кювету наливают стандартный раствор, а в другую раствор каротина. Если раствор каротина получается слишком концентрированным, то рекомендуется перед колориметрированием разбавить его бензином.

Процентное содержание суммы каротиноидов вычисляют по формуле

X = ,  где

К – количество каротина в 1 мл стандартного раствора равно 0,00208 мг, если стандартный раствор – дихромата калия, и 0,00235 мг, если стандартный раствор – азобензол; V – объем бензинового раствора каротина, мл; – оптическая плотность стандартного раствора; - оптическая плотность исследуемого раствора каротина; m – масса навески абсолютно сухого сырья, г; w – потеря в массе сырья при высушивании, %. (Химический анализ лекарственных растений, Ладыгина Е.Я.)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение.

Обеспечение надлежащего качества лекарственного растительного сырья во многом зависит от правильной организации контроля, его действенности и эффективности, а также от уровня требований, заложенных в нормативной документации, и используемых методов анализа.

Государственная система контроля качества лекарственных средств охватывает все стадии изыскания, апробации, производства и применения лекарственных средств. В равной степени это относится и к контролю качества лекарственного растительного сырья.

Методы хроматографии включены в ФС к различным лекарственным растениям как главные методы их контроля качества. Так же в ГФ создана ФС «Хроматография», которая стандартизирует метод.

С помощью хроматографии можно стандартизировать и делать оценки подлинности веществ не только в пищевой, парфюмерной и других отраслях промышленности, но и различного лекарственного сырья в медицине, фармакологии, здравоохранении.

Изучив и проанализировав методы хроматографического анализа, можно сделать вывод, что хроматография в анализе лекарственного растительного сырья является одном из точных, быстрых и экономичных методов качественного и количественного анализа лекарственного растительного сырья. С помощью хроматографических методов анализа можно не только качественно обнаружить биологически активные соединения (БАС) в лекарственном растительном сырье, но и их количественное содержание. Так же данным методом возможно разделение БАС перед их количественным и качественным анализом с помощью других методов анализа: потенциометрии, УФ - спектрофорометрии, ИК – сперктрофотометрии и других.

Известны способы и устройства для стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) и фитопрепаратов (ФП) на их основе, основанные на определении биологически активных соединений (БАС) и стандартных образцов сравнения (СО) с использованием различных видов хроматографии и УФ-спектроскопии. Данные методы позволяют быстро и надежно оценить качество сырья по ведущей группе БАС.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованной литературы:

1. Государственная фармакопея СССР. XI издание. – М.: Медицина. - Вып. 1, 1987. – 336 с. - Вып. 2, 1990. – 400 с.
2. Долгова А.А., Ладыгина Е.Я. Руководство к практическим занятиям по фармакогнозии. – М.: Медицина, 1977. – 256 с.
3. Избранные лекции по фармакогнозии: Учебное пособие / Под ред. Г.И. Олешко. – Пермь: ПГФА, 2006. – 305 с.
4. Коноплева М. М. Фармакогнозия : природные биологически активные вещества. Витебск, 2007.273 с.
5. Кузьменко А.Н. Стандартизация лекарственного растительного сырья и растительных сборов хроматографическими методами (монография) / Кузьменко А.Н., Решетняк В.Ю. // Москва, Изд. Моск. ун-та, 2010,

104 с.

6. Кузьменко А.Н. Стандартизация растительного сбора методом газо-жидкостной хроматографии / Кузьменко А.Н. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2 Химия. – 2009. – Т. 50, № 4. – С. 278-281.
7. Кузьменко А.Н. Использование метода газо-жидкостной хроматографии для стандартизации лекарственных растительных сборов / Кузьменко А.Н. // Фармацевтический вестник Узбекистана. – 2009. – № 2. – С. 32-36.
8. Кузьменко А.Н. Использование газо-жидкостной хроматографии для стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе / Кузьменко А.Н. // Рос. хим. ж. (Журн. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). – 2010. – Т. LIV, №6. – С.114-119.
9. ОФС «Хроматография»
10. Химический анализ лекарственных растений: Учеб.пособие для фармацевтических вузов / Ладыгина Е.Я., Сафронич Л.Н. – М.: Высш. Школа, 1983. – 176 с., ил.