Хромотография

Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos - цвет, краска и... графия), физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. 

Метод хроматографии был впервые применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция, для разделения пигментов растительного происхождения. Первое сообщение о разработке метода хроматографии было сделано Цветом 30 декабря 1901 года на XI Съезде естествоиспытателей и врачей в С.-Петербурге. Первая печатная работа по хроматографии была опубликована в 1903 году, в журнале Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Впервые термин хроматография появился в двух печатных работах Цвета в 1906 году, опубликованных в немецком журнале Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. В 1907 году Цвет демонстрирует свой метод Немецкому Ботаническому обществу. 

Классификация хромотографии 

По  агрегатному состоянию фаз

• Газовая хроматография
• Газо-жидкостная хроматография
• Газо-твёрдофазная хроматография
• Жидкостная хроматография
• Жидкостно-жидкостная хроматография
• Жидкостно-твёрдофазная хроматография
• Жидкостно-гелевая хроматография
• Сверхкритическая флюидная хроматография

По  механизму взаимодействия

• Распределительная хроматография
• Ионообменная хроматография
• Адсорбционная хроматография
• Эксклюзионная хроматография
• Аффинная хроматография
• Осадочная хроматография
• Адсорбционно-комплексообразовательная хроматография

По  цели проведения

• Аналитическая хроматография
• Препаративная хроматография
• Промышленная хроматография

По  способу ввода  пробы

• Элюентная хроматография (проявительная, редк. элютивная)

Наиболее часто  используемый вариант проведения аналитической хроматографии. Анализируемую смесь вводят в поток элюента в виде импульса . В колонке смесь разделяется на отдельные компоненты, между которыми находятся зоны подвижной фазы.

• Фронтальная хроматография

Смесь непрерывно подают в колонку, при этом на выходе из колонки только первый, наименее удерживаемый компонент можно выделить в чистом виде. Остальные зоны содержат 2 и более компонентов. Родственный  метод — твердофазная экстракция (сорбционное концентрирование).

• Вытеснительная хроматография

В колонку после  подачи разделяемой смеси вводят специальное вещество-вытеснитель, которое удерживается сильнее любого из компонентов смеси. Образуются примыкающие  друг к другу зоны разделяемых  веществ.

Газовая хроматография (ГХ) - хроматография, в которой подвижная фазанаходится в состоянии газа или пара - инертный газ (газ-носитель).  Неподвижной  фазой  является  высокомолекулярная  жидкость, закрепленная на пористый носитель или на стенки длинной капиллярной трубки, или только твердое пористое вещество, заполняющее колонку , в следствии чего газоваяхроматография подразделяется на газо-жидкостную и газо-твердофазную. Газовая  хроматография - универсальный  метод  разделения  смесей  разнообразных  веществ,  испаряющихся  без  разложения.  При  этом компоненты  разделяемой  смеси  перемещаются  по  хроматографической колонке  с  потоком  газа-носителя. По мере  движения  разделяемая  смесь многократно распределяется между  газом-носителем (подвижной фазой) и неподвижной фазой. Принцип разделения - неодинаковое сродство веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке. Компоненты смеси селективно задерживаются последней,  поскольку  сродство их  к  этой  фазе  различно,  и  таким образом разделяются (компонентам с большим сродством требуется большее время для выхода из неподвижной фазы, чем компонентам с меньшим сродством). Затем вещества выходят из колонки и регистрируются детектором. Сигнал детектора записывается в виде хроматограммы автоматическим  потенциометром (самописцем)  или же  регистрируется  компьютером.

ГАЗОЖИДКОСТНАЯ  ХРОМАТОГРАФИЯ (а. gas-liquid chromatography; н. Gas- Flussigkeits-Chromatographie; ф. Chroma- tographie gaz-liquide; и. cromatografia liquido-gas) — метод разделения и анализа смесей газо- или парообразных веществ, основанный на их различной  растворимости в тонком слое жидкости, нанесённой на твёрдый носитель.

Метод газожидкостной хроматографии предложен английский учёными А. Джеймсом и А. Мартином в 1952. В процессе разделения компоненты смеси распределяются между неподвижной  жидкой и подвижной газовой (газ-носитель) фазами. Коэффициент распределения  — отношение концентраций компонента в двух фазах — для различных  веществ различны. По механизму разделения газожидкостная хроматография относится  к распределительной хроматографии (. По форме проведения процесса газожидкостной хроматографии подразделяют на колоночную и капиллярную. В колоночной газожидкостной хроматографии слой нелетучей в  условиях эксперимента жидкости (трикрезилфосфат, сорбитол, полиэтиленгликоль и др.) наносят на поверхность зёрен  носителя (хромосорб, тефлон, кизельгур  и др.), которым затем наполняют  колонку. В капиллярной газожидкостной хроматографии жидкую фазу наносят  непосредственно на стенки капилляров. Для анализа сложных смесей наиболее широкое распространение получили элюентный и вытеснительный способы  Чувствительность газожидкостной хроматографии  зависит от используемой аппаратуры, условий проведения анализа и  составляет обычно 10-4-10-8%. Относительная  ошибка определений колеблется от 2 до 5%.

Газожидкостную  хроматографию широко применяют  для анализа газов, жидкостей  и твёрдых веществ. При анализе  нелетучих веществ определяемые компоненты предварительно с помощью  химических реакций переводят в  летучие соединения (т.н. реакционная  хроматография). Например, Cu, Cr, Mn, Fe, Co, Ni в горных породах определяют в виде их хелатов; S, Se, Te, As и Bi в природных и сточных водах — после переведения их соединений в летучие гидриды.

Газо-твёрдофазная хроматография — вид газовой хроматографии. Другое название — газоадсорбционная хроматография.

Газо-твёрдофазная хроматография это метод разделения летучих компонентов, при котором подвижной фазой (элюентом) служит поток инертного газа-носителя (водород, гелий, азот,аргон, углекислый газ), а неподвижной — частицы твёрдого тела (адсорбенты с высокой удельной поверхностью (10—1000 м2г-1) — активные угли, силикагели, пористое стекло, оксид алюминия). Газ-носитель не реагирует с неподвижной фазой и разделяемыми веществами. Распределение веществ между неподвижной и подвижной фазами определяется процессомадсорбции.

Применяется для анализа и препаративного разделения газовых и жидких смесей, а также летучих твёрдых тел при проведении физико-химических исследований. Для проведения анализа жидкости и твёрдые вещества переводят в парообразное состояние. В случае анализа твёрдых нелетучих или термически нестабильных веществ анализируют газообразныепродукты их термического распада (пиролитическая хроматография) или летучие и термически стабильные производные (реакционная хроматография).

Жидкостная  хроматография — это хроматография, в которой подвижной фазой  является жидкость.

Жидкостная  хроматография появилась в конце 1960-х гг.

В настоящее  время широко используется как классическая, так и высокоэффективная жидкостная хроматография

С практической точки зрения можно  выделить следующие основные черты  современной ЖХ, отличающие ее от классической ЖХ:

1) применение новых сорбентов в высокой степени однородных по размеру и форме зерен;

2) применение мелкозернистых материалов диаметром 10-80 мкм;

3) применение новых усовершенствованных методик заполнения колонок;

4) использование высоких давлений на входе в колонку (до 120 атм);

5) уменьшение до минимума мертвых объемов в разделительной системе хроматографа;

6) применение высокочувствительных детекторов с измерительными ячейками очень малого объема.

Схематическое описание жидкостного хроматографа

Жидкостный  хроматограф состоит из трех основных функциональных частей.

Источник  потока подвижной фазы состоит из резервуара, насоса и фильтра. В зависимости  от конструкции элементов этого  блока в него могут входить  устройство для формирования градиентов подвижной фазы; дегазатор и устройство для сглаживания пульсаций давления, если этого требуют конструкции  детектора и насоса.

В разделительный блок хроматографа входят устройство для ввода проб, хроматографические колонки, а иногда предварительная  колонка для насыщения и термостат.

Блок  детектирования представляет собой  детектор или систему нескольких детекторов.

Иногда  в этот блок входят сборник фракций  и измеритель потока

Подвижная жидкая фаза находится в резервуаре, и перед подачей в колонку  ее обычно пропускают через дегазатор, с тем чтобы уменьшить содержание в ней растворенных

газов путем временного нагревания. При  работе по методу градиентного элюирования  компоненты подвижной фазы проходят через смеситель, а затем через  фильтр в насос. При использовании  импульсного насоса в систему  вводят устройство для сглаживания  создаваемых этим насосом пульсаций  давления (скорости потока).

В термостатируемом пространстве располагаются предварительная  колонка для насыщения (применяется  только в системах ЖЖХ), устройство для ввода проб в собственно хроматографические колонки, помещенные в термостат (или  без них). С детектором колонка  соединяется капилляром, имеющим  минимальный мертвый объем. При  необходимости детектор помещают в  отдельный термостат. Сигнал детектора  непрерывно регистрируется самописцем. После детектора могут быть установлены  измеритель потока, сборник фракций, а также краны для работы по методу циркуляционной хроматографии.

Жидкостно-жидкостная хроматография ( ЖЖХ), представляющая собой разновидность распределительной хроматографии или растворной хроматографии. Образец распределяется между подвижной жидкостью, обычно водой, и неподвижной жидкостью, обычно органическим растворителем. Подвижная жидкость не должна растворять неподвижную жидкость. [1]

Жидкостно-жидкостная хроматография по сути близка к газожидкостной хроматографии

Жидко-твердофазная хроматография является удобным методом исследования продуктов метаболизма фосфорорганических пестицидов в растениях и в тканях животных. Фосфорор-ганические инсектициды легко превращаются в более полярные и токсичные соединения. Эти соединения разделяют методом колоночной хроматографии, обычно на силикагеле; элюирование проводят растворителями с увеличивающейся полярностью. [1]

В жидко-твердофазной хроматографии относительно трудно следить за активностью сорбента

• Жидкостно-гелевая  хроматография

Была  поставлена задача: выяснить, в каком  виде находится кремний в пульпе и в чем причина его полимеризации. Решить ее можно было с помощью гелевой хроматографии [1], широко применяемой для фракционного разделения органических полимеров по их молекулярным весам. [1]

Надо  отметить, что механизм гелевой хроматографии  представляет собой ряд сложных  явлений, часть которых недостаточно исследована и находится в  процессе изучения. Недавно выяснилось, что вопреки первоначальным наблюдениям  удерживаемые объемы макромолекул зависят  не только от их размеров и пористости геля, но и от скорости элюирования, температуры колонок и величины образца Результаты этих исследований пока не учитываются ни в одной  из теоретических работ по гелевой хроматографии, которые используют распределение пор в геле или различия в коэффициентах диффузии макромолекул. Очевидно, только сочетание этих подходов с учетом зависимости скорости диффузии макромолекул от пористости геля позволит выяснить физическую картину, лежащую в основе процесса гелевой хроматографии, а это в свою очередь дает возможность превратить гелевую хроматографию в абсолютный метод, не требующий калибровки. Тем не менее необходимо отметить полезность работ феноменологического характера, которые позволяют производить коррекцию гелевых хроматограмм с учетом диффузионных факторов размывания и использовать для этих целей вычислительную технику.

Сверхкритическая  флюидная хроматография

Сверхкритическим  флюидом (СКФ) — называют состояние вещества, при котором исчезает различие между жидкой и газовой фазой. Любое вещество, находящееся при температуре и давлении выше критической точки является сверхкритическим флюидом. Свойства вещества в сверхкритическом состоянии промежуточные между его свойствами в газовой и жидкой фазе. Так, СКФ обладает высокой плотностью, близкой к жидкости, и низкой вязкостью, как и газы. Коэффициент диффузии при этом имеет промежуточное между жидкостью и газом значение. Вещества в сверхкритическом состоянии могут применяться в качестве заменителей органических растворителей в лабораторных и промышленных процессах. Наибольший интерес и распространение в связи с определенными свойствами получили сверхкритическая вода и сверхкритический диоксид углерода

Сверхкритическая  флюидная хроматография имеет ряд преимуществ переджидкостной хроматографией и газовой хроматографией.  В ней возможно применение универсальных ПИД-детекторов (в отличие от ЖХ), разделение термически нестабильных веществ и нелетучих веществ (в отличие от ГХ). На данный момент, несмотря на все преимущества, не нашла широкого применения (за исключением некоторых особых областей, таких как разделение энантиомеров и высокомолекулярных углеводородов). Несмотря на высокую чистоту получаемых соединений, высокая стоимость оборудования делает современного СКФ хроматографию применимой только в случае очистки или выделения догорих веществ. Очень перспективна и активно внедряется СКФ хроматография, например, в медицине. 

Распределительная хроматография — хроматографический метод, при котором неподвижная (стационарная) фаза химически связана с поверхностью неподвижного носителя. Подвижной фазой является жидкость (LLC — англ. liquid liquid chromatography), которая служит растворителем, или газ (газовая хроматография). Разделение происходит за счёт различия полярностиразделяемых веществ.

Теория  ионообменной хроматографии сложна вследст вне многообразия химических и физических явлений, характерных для обменного поглощения ионов на ионообменных сорбентах. В соответствии с природой этих явлений она слагается из статики ( равновесия), кинетики и динамики ионообменных процессов. [1]

Теория  равновесной ионообменной хроматографии в наиболее наглядном виде при определенных упрощающих допущениях была разработана Е. Н. Талоном и Т. Б. Гапон в 1948 г. Процесс ионного обмена ими был рассмотрен как прерывистый, состоящий из двух перемежающихся процессов: 1) переноса ионов без поглощения и 2) установления равновесия без переноса. [2]

Из теории ионообменной хроматографии известно, что для эффективного проведения элюирования необходим правильный выбор элюирующего раствора ( высокое сродство вытесняющего иона к иониту), достаточно высокая его концентрация, ограниченная скорость подачи раствора, повышение температуры

Основная  задача теории ионообменной хроматографии состоит в определении оптимальных условий наиболее полного разделения компонентов анализируемой смеси веществ в зависимости от их концентрации в исходном растворе, размеров колонки, продолжительности проявления хроматограммы. Теория ионного обмена должна рассматривать ионообменное равновесие, факторы, усложняющие обмен, избирательность и специфичность ионитов, адсорбцию нейтральных солей, термодинамический аспект вопроса, скорость обмена, условия хрома-тографического разделения, на стадиях поглощения и элюирования, построение выходных кривых, влияние различных факторов ( размера зерен, температуры, концентрации раствора, рН раствора, скорости протекания), влияние химического состава и валентности ионов, химического состава растворителя ( неводные растворы), комплексообразования, адсорбцию и набухание, емкость ионитоз, их электрохимические свойства

Адсорбционная хроматография - вид хроматографии основанный на способности твёрдого вещества — неподвижной фазы — сорбировать примеси, находящиеся в подвижной фазе. При этом эффективность разделения примесей пропорциональна их величинам адсорбции при условиях эксперимента. Процесс взаимодействия может сопровождаться химическим взаимодействием примесей с неподвижной фазой, то есть хемосорбцией.

В этом процессе неподвижная фаза представляет собой твердый сорбент. Равновесие процессов сорбции и десорбции в условиях, достаточно далеких от насыщения емкости сорбента, устанавливается независимо для каждого компонента смеси веществ. Различие в коэффициентах адсорбции обусловливает разницу в распределении этих компонентов между сорбентом и подвижной жидкой фазой. Соответственно чем большим сродством к сорбенту обладает данный компонент смеси, тем медленнее он будет мигрировать вслед за элюен-том вдоль колонки или пластинки. Если сорбция происходит на наружной поверхности сплошных гранул, то имеет место адсорбционная хроматография в чистом виде. Если же материал сорбента имеет пористую структуру и большая часть сорбирующей поверхности находится внутри его гранул, то в задержании молекул вещества в неподвижной фазе участвует еще и процесс их диффузии в неподвижной жидкости внутри пор, подобно тому как это имеет место при гель-фильтрации. Практически, впрочем, связывание вещества    за   счет   сорбции   доминирует

Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная хроматография) — разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшеймолекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует.

Принцип

В колонку вносят раствор образца, объем которого является лимитирующим для качества хроматографии. Для аналитических разделений он не должен превышать 0,1 % от CV (общего объема колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10 % от CV. Колонка упакована порошком, частицы или гранулы которого имеют поры определенного диаметра. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры, проходят между гранулами, поэтому их объем удержания равен объему колонки за вычетом объема стационарной фазы (так называемый, свободный объем). Они элюируются первыми. Молекулы средних размеров помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объем удержания несколько выше свободного объема. Они элюируется вторыми. Самые мелкие молекулы свободно входят в поры вместе с молекулами растворителя. Поэтому их объем удержания в колонке намного выше свободного и приближается к общему объему колонки (то есть 100 % CV). Они элюируются последними.

Сорбенты

Гель — гетерогенная система, в которой подвижная  фаза (обычно водная) всегда находится  внутри пор стационарной или твердой  фазы, называемой гелевой матрицей.

Аффинная  хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалент-ного присоединения к матрице. 

Аффинная  хроматография представляет собой особый метод, предназначенный для выделения биологически активных соединений. Метод основан на исключительном биологическом свойстве присоединять специфически и обратимо другие вещества, для которых Рейнер и Уэлч [78] ввели название аффиннанты или аффинные лиганды. В настоящее время наиболее расцространенным способом получения нерастворимых аффинных сорбентов является их присоединение к носителю путем образования ковалентных связей. Если раствор, содержащий биологически активное соединение, которое следует выделить, фильтруют через колонку, заполненную нерастворимым носителем, связанным с аффинным лигандом, то все соединения, не обладающие сродством к данному аффинному лиганду, беспрепятственно проходят через колонку, тогда как соединения, обладающие таким сродством, удерживаются в колонке, причем прочность их удерживания зависит от степени их сродства и конкретных экспериментальных условий.

Осадочная хроматография — метод хроматографии, основанный на способности разделяемых веществ образовывать малорастворимые соединения с различными произведениями растворимости.

В качестве неподвижной  фазы выступает инертный носитель, покрытый слоем осадителя; разделяемые  вещества, находящиеся в подвижной  фазе, вступают во взаимодействие с  осадителем и образуют малорастворимые  вещества — осадки. При дальнейшем пропускании растворителя происходят поочерёдно: растворение этих осадков, перенос вещества по слою неподвижной фазы, снова осаждение и т. д. При этом скорость перемещения осадка по неподвижной фазе пропорциональна его произведению растворимости (ПР). Хроматограммой в данном случае будет являться распределение осадков по слою носителя.

В качестве примера  можно привести разделение галогенид-ионов  на носителе (силикагель, целлюлоза и т. д.), пропитанном солью серебра.

Можно использовать для разделения осадков их неодинаковую растворимость в различных растворителях  или в растворах с различной ионной силой.

Реализуется как  в колоночном, так и в плоскостном  варианте.