Использование плазмид в генно-инженерных исследованиях

Плазмиды — дополнительные факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или линейные молекулы ДНК.

Плазмиды способны удваиваться (реплицироваться) автономно, но при этом они эксплуатируют репликационную систему клетки хозяина. Большинство плазмид кодирует специальные белки — инициаторы репликации. Эти белки начинают процесс репликации, который затем подхватывается и продолжается репликационной системой клетки.

Для кольцевых плазмид известны несколько механизмов (способов) репликации:

• механизм катящегося кольца (rolling cycle),
• тетта-механизм (механизм «глазка»),
• D-механизм.

Существует несколько систем классификации  плазмид базирующихся на:

• топологии (линейные или кольцевые),
• механизмах репликации (см. выше),
• маркерных генов, содержащихся на плазмидах (например: устойчивость к антибиотикам, гены биодеградации ксенобиотиков, системы рестрикции — модификации, гены синтезабактериоцинов и т. д. — или полному отсутствию оных — криптические плазмиды),
• круге хозяев,
• копийности,
• совместимости,
• конъюгативные (способные к переносу в другие клетки)/неконъюгативные.

Вне зависимости от типа, все плазмиды содержат точку инициации репликации (ori V).

Плазмиды- экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.

Их объединение в одно царство жизни с вирусами связано  с наличием ряда общих свойств- отсутствием собственных систем мобилизации энергии и синтеза белка, саморепликацией генома, абсолютным внутриклеточным паразитизмом.

Их выделение в отдельный  класс определяется существенными  отличиями от вирусов.

1.Среда их обитания- только бактерии (среди вирусов , кроме вирусов бактерий- бактериофагов имеются вирусы растений и животных).

2.Плазмиды сосуществуют  с бактериями, наделяя их дополнительными  свойствами. У вирусов эти свойства  могут быть только у умеренных  фагов при лизогении бактерий, чаще же всего вирусы вызывают отрицательный последствия, лизис клеток.

3.Геном представлен двунитевой ДНК.

4.Плазмиды представляют  собой “голые” геномы, не имеющие  никакой оболочки, их репликация  не требует синтеза структурных  белков и процессов самосборки.

Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали, прежде всего путем конъюгационного переноса. В зависимости от наличия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra- оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий- интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры- автономные плазмиды ( эписомы).

Классификация и биологическая  роль плазмид.

Функциональная классификация  плазмид основана на свойствах, которыми они наделяют бактерии. Среди них- способность продуцировать экзотоксины и ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам, синтез бактериоцинов.

Основные категории плазмид.

1.F- плазмиды - донорские функции, индуцируют деление (от fertility - плодовитость). Интегрированные F - плазмиды-  Hfr- плазмиды (высокой частоты рекомбинаций).

2.R- плазмиды (resistance) - устойчивость к лекарственным препаратам.

3.Col- плазмиды- синтез колицинов (бактериоцинов)- факторов конкуренции близкородственных бактерий (антогонизм). На этом свойстве основано колицинотипирование штаммов.

4.Hly- плазмиды- синтез гемолизинов.

5.Ent- плазмиды- синтез энтеротоксинов.

6.Tox- плазмиды- токсинообразование.

Близкородственные плазмиды не способны стабильно сосуществовать, что позволило объединить их по степени родства в Inc- группы (incompatibility- несовместимость).

Биологическая роль плазмид многообразна, в том числе:

- контроль генетического  обмена бактерий;

- контроль синтеза факторов  патогенности;

- совершенствование защиты  бактерий.

Бактерии для плазмид- среда обитания, плазмиды для них- переносимые между ними дополнительные геномы с наборами генов, благоприятствующих сохранению бактерий в природе.

Мигрирующие генетические элементы - отдельные участки ДНК, способные  определять свой перенос между хромосомами  или хромосомой и плазмидой с помощью фермента рекомбинации транспозазы. Простейшим их типом являются инсерционные последовательности (IS- элементы) или вставочные элементы, несущие только один ген транспозазы, с помощью которой IS- элементы могут встраиваться в различные участки хромосомы. Их функции- координация взаимодействия плазмид, умеренных фагов, транспозонов и генофора для обеспечения репродукции, регуляция активности генов, индукция мутаций. Величина IS- элементов не превышает 1500 пар оснований.

Транспозоны (Tn- элементы) включают до 25 тысяч пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два Is- элемента. Каждый транспозон содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики, как и плазмиды (множественная устойчивость к антибиотикам, токсинообразование и т.д.). Транспозоны- самоинтегрирующиеся фрагменты ДНК, могут встраиваться и перемещаться среди хромосом, плазмид, умеренных фагов, т.е. обладают потенциальной способностью распространяться среди различных видов бактерий.

Структура и репликация 
Мол. масса плазмид составляет от 1*10⁶ до 200*10⁶. Таким образом, самые мелкие плазмиды кодируют один-два белка среднего размера, тогда как более крупные — 300 или более белков. Крупные плазмиды могут кодировать множество ферментов, необходимых для работы целой последовательности биохимических реакций, например для превращения толуола в катехол. Плазмиды с мол. массой более 100-106 обнаружены только у грамотрицательных бактерий, в частности у видов Pseudo-monas и Agrobacterium. Мол. масса плазмид грамположительных бактерий лишь в отдельных случаях превышает 40-10⁶. 
В. бактериальных клетках плазмиды существуют в виде кольцевых двухцепочечных ДНК, которые, кроме того, находятся в сверхспиральном состоянии. Некоторые из плазмид могут существовать лишь в клетках одного или двух близких видов. К числу плазмид с широким кругом хозяев относятся RP4, R68.45, RK2 и сходные с ними плазмиды, несущие маркер устойчивости к лекарственным препаратам (R-плазмиды), которые принадлежат Р-группе несовместимости (члены одной и той же группы несовместимости не могут сосуществовать в бактериальной клетке). Эти плазмиды были перенесены во многие виды грамотрицательных бактерий; создается впечатление, что их хозяевами могут быть все штаммы грамотрицательных бактерий. 
Таким образом, R-плазмиды, относящиеся к группе Р, особенно подходят для генетических экспериментов с грамотрицательными бактериями, используемыми в промышленности. При помощи этих плазмид мы можем осуществлять перенос хромосомных генов между неродственными видами. Небольшие по размеру производные плазмид RP4 и RK2 используются как векторы для клонирования молекул ДНК, которая затем может быть перенесена в клетки самых разных видов.

Репликация некоторых  типов плазмид тщательно изучена, и нам известны сегодня многие детали этого процесса, особенно для небольшой плазмиды ColEl. Эта информация помогает при использовании плазмид для клонирования генов. Чаще всего применяют производные плазмиды pBR322 длиной 4362 пар нуклеотидов, несущей гены устойчивости к пенициллину и тетрациклину. Эти гены были перенесены из R-плазмид (рис. 7.3) в фрагмент небольшой плазмиды рМВ1, которая близка кочень хорошо изученной небольшой плазмиде ColEl. 
Плазмиды pBR322 и ColEl могут реплицироваться в Е. со-U и близких видах Enterobacteriaceae. В бактериальных клетках они представлены несколькими копиями; так,для ColEl число плазмидных копий на хромосому равно примерно 20, а для pBR322 — 40. Это обстоятельство очень важно для клонирования. Чем больше число копий клонированного гена, тем выше выход кодируемого белка. Кроме того, многокопийные плазмиды не так легко утрачиваются при культивировании. С другой; стороны, малое число копий плазмиды иногда имеет свои преимущества, например при клонировании таких генов, продукты которых гибельны для бактериальной клетки в большом количестве. 
Изучению механизмов контроля репликации и числа копий бактериальных плазмид посвящено множество работ. Было обнаружено, что число копий плазмид примерно одинаково в-клетках, размножающихся с разной скоростью. Из этого следует, что репликация плазмид как-то связана с ростом бактерий. Такая координация достигается при участии механизмов,, контролирующих начало репликации. Если уж репликация началась, то она идет с относительно постоянной скоростью при; любом темпе размножения бактерий. При высокой скорости размножения репликация индуцируется чаще в случае много-копийных плазмад, чем малокопийных. 
Начало репликации ColEl и pBR322 контролируется небольшими молекулами РНК, которые взаимодействуют с особым участком плазмиды, расположенным поблизости от точки инициации репликации. Начавшись, репликация идет в одном направлении и заканчивается вблизи точки инициации. Генетики,, стремящиеся максимально увеличить выход белков, кодируемых клонированными в pBR322 генами, получали мутанты с модифицированными РНК. У некоторых таких мутантов числа копий плазмиды составляет более 100, что приводит к существенному увеличению выхода продуктов, кодируемых клонированными генами. Интересная особенность репликации ColEl и pBR322 заключается в том, что она полностью обеспечивается ферментами хозяина. Сами плазмиды не несут информации, нужной для кодирования ферментов репликации. 
Процессы репликации pBR322 и ColEl, с одной стороны, и хромосомы Е. coli — с другой, различаются тем, что первый не подавляется хлорамфениколом, который блокирует синтез белка. В присутствии этого соединения репликация хромосом прекращается по завершении уже начавшегося раунда репликации. Такого подавления репликации pBR322 не происходит, и; плазмиды накапливаются в обработанных хлорамфениколом; 
клетках, так что в конечном счете они составляют до 50% всей ДНК- При выделении плазмид для увеличения выхода плаз-мидной ДНК к культуре за несколько часов до сбора клеток иногда добавляют хлорамфеникол. 
Инициация репликации плазмиды Rl E. coli регулируется белком-репрессором, кодируемым одним из генов R1. Были получены мутантные плазмиды, которые кодируют аномальный репрессор или же имеют несовершенный механизм-регуляции его образования. Некоторые из этих мутантов -т— температуро-чувствительные (репрессор неактивен при 43 °С). При 30 °С репликация идет нормально, и на клетку образуется 1—2 плаз-мидные копии, а при 43 °С репликация инициируется гораздо чаще, так что в клетке накапливается по нескольку сот плазмид. Небольшой сегмент R1, содержащий участок начала репликации и связанные с ними регулирующие элементы, был использован для создания плазмид-векторов, применяемых при клонировании разнообразных генов. -Преимущество таких векторов заключается в том, что при повышенной температуре с их помощью можно получать множества копий клонируемого гена, а следовательно, и много белка, кодируемого этим геном.

 
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, или технология рекомбинантных ДНК, изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала – основного наследственного вещества клеток. Хромосомный материал состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Биологи изолируют те или иные участки ДНК, соединяют их в новых комбинациях и переносят из одной клетки в другую. В результате удается осуществить такие изменения генома, которые естественным путем вряд ли могли бы возникнуть.

Методом генной инженерии  получен уже ряд препаратов, в  том числе инсулин человека и  противовирусный препарат интерферон. И хотя эта технология еще только разрабатывается, она сулит достижение огромных успехов и в медицине, и в сельском хозяйстве. В медицине, например, это весьма перспективный  путь создания и производства вакцин. В сельском хозяйстве с помощью  рекомбинантной ДНК могут быть получены сорта культурных растений, устойчивые к засухе, холоду, болезням, насекомым-вредителям и гербицидам.

Перенос плазмид у бактерий. Большая часть работ по переносу участков ДНК, или генов, проводилась до последнего времени на бактериях. У бактерий генетическая информация заключена в одной большой молекуле ДНК – хромосоме бактерии. Поскольку бактерии размножаются бесполым путем, эта генетическая информация на протяжении многих поколений остается в значительной степени неизменной. В бактериальной клетке имеются, помимо главной ее хромосомы, еще и небольшие кольцевые сегменты ДНК. Эти молекулы ДНК, т.н. плазмиды, часто несут в себе гены, ответственные за устойчивость к антибиотикам.

Плазмиды можно извлечь из одной клетки и перенести в другую. Такие работы проводятся, например, наEsсherichia coli (кишечной палочке), безвредной бактерии, обитающей в желудочно-кишечном тракте человека. Некоторые из клеток E. coli содержат плазмиду с генами устойчивости к антибиотику тетрациклину. Такие плазмиды – их называют факторами устойчивости – легко отделить от главной хромосомной ДНК. Неустойчивые к тетрациклину (разрушаемые им) бактерии можно заставить включить в себя эти плазмиды, подвергнув клетки соответствующей химической обработке, которая сделает оболочку проницаемой для чужих плазмид. Клетки, получившие таким способом фактор устойчивости, выживают на культуральной среде, содержащей тетрациклин, тогда как неустойчивые клетки погибают. Из каждой клетки – в результате многократных делений – возникает клон, т.е. собрание точных копий одной-единственной клетки, полученных путем бесполого размножения. Плазмида воспроизводится в каждой клетке клона, и ее воспроизведение называют молекулярным клонированием.

Соединение разных плазмид. Плазмиды можно разрезать, фрагменты сращивать друг с другом, а затем такие комбинированные плазмиды вводить в клетки. Можно соединять фрагменты ДНК одного и того же вида или же разных видов.

Поскольку плазмидная ДНК представляет собой замкнутую кольцевую молекулу, кольцо нужно сперва разорвать таким образом, чтобы свободные концы были в химическом отношении реакционноспособными, пригодными для последующего соединения. Достичь этого удается либо простым механическим путем (например, сильным встряхиванием), либо с помощью различных ферментов, называемых нуклеазами (рестриктазами). Затем фрагменты ДНК соединяют с помощью лигаз – ферментов, исправляющих повреждения в ДНК и сшивающих концы ее разорванных нитей. Именно таким путем плазмиды из штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину, и плазмиды из штамма, устойчивого к другому антибиотику, каномицину, можно соединить и получить штамм E. coli, устойчивый к обоим антибиотикам.

Эксперименты  с двумя видами. Плазмиды другого вида бактерий, например Staphylococcus aureus (золотистого стафилококка), сами по себе не способны размножаться в клетках E. coli. Однако в них могут размножаться гибридные плазмиды, составленные искусственным путем из куска плазмиды S. aureus и фрагмента плазмиды E. coli. Был проведен эксперимент, в котором соединили плазмиды S. aureus, устойчивого к пенициллину, и плазмиды штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину. Когда затем гибридные плазмиды были введены в клетки E. coli, полученный штамм оказался устойчивым и к пенициллину, и к тетрациклину. Этот эксперимент, в котором был осуществлен перенос генетической информации между неродственными организмами, позволил предположить, что в клетки бактерии можно вводить молекулы ДНК и высших организмов и что они будут в этих клетках реплицироваться (копироваться).

Перенос генов  животных. Из генов животных первыми были введены в бактерию гены шпорцевой лягушкиXenopus laevis. Эти гены хорошо изучены и легко поддаются идентификации. Их ввели в клетки штамма E. coli, устойчивого к тетрациклину, и они здесь реплицировались. У полученных клонов состав ДНК соединял в себе характеристики X. laevis и E. coli.

В настоящее время научились  уже переносить гены от одного животного  к другому и от животного к  растениям. Получены «трансгенные» мыши, свиньи, овцы, коровы и рыбы. ДНК можно прямо инъецировать в оплодотворенное яйцо вида-реципиента, или можно использовать в качестве переносчика вирус, который, проникнув в клетку, внесет с собой и нужный ген. Третий метод связан с использованием неспециализированных стволовых (т.е. родоначальных) клеток эмбриона. Гены вводят в стволовые клетки путем инъекции или с помощью вируса, и полученные в результате трансгенные клетки инъецируют другому зародышу, который включает эти чужие клетки в свои ткани. Гены человека вводили и в растения, например в табак, в надежде получить таким способом большие количества нужных белков, в частности антител и ферментов. В этих экспериментах перенос генов оказался довольно простым делом. Была придумана специальная «генная пушка», выстреливающая ДНК прямо в листья растений.

Практическое  применение. Теперь умеют уже синтезировать гены, и с помощью таких синтезированных генов, введенных в бактерии, получают ряд веществ, в частности гормоны и интерферон. Их производство составило важную отрасль биотехнологии.

Интерферон – белок, синтезируемый  организмом в ответ на вирусную инфекцию, изучают сейчас как возможное  средство лечения рака и СПИДа. Понадобились бы тысячи литров крови человека, чтобы получить такое количество интерферона, какое дает всего один литр бактериальной культуры. Ясно, что выигрыш от массового производства этого вещества очень велик. Очень важную роль играет также получаемый на основе микробиологического синтеза инсулин, необходимый для лечения диабета. Методами генной инженерии удалось создать и ряд вакцин, которые испытываются сейчас для проверки их эффективности против вызывающего СПИД вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). С помощью рекомбинантной ДНК получают в достаточных количествах и человеческий гормон роста, единственное средство лечения редкой детской болезни – гипофизарной карликовости.

Еще одно перспективное направление  в медицине, связанное с рекомбинантной ДНК, – т.н. генная терапия. В этих работах, которые пока еще не вышли из экспериментальной стадии, в организм для борьбы с опухолью вводится сконструированная по методу генной инженерии копия гена, кодирующего мощный противоопухолевый фермент. Генную терапию начали применять также для борьбы с наследственными нарушениями в иммунной системе.

В сельском хозяйстве удалось  генетически изменить десятки продовольственных  и кормовых культур. В животноводстве использование гормона роста, полученного  биотехнологическим путем, позволило повысить удои молока; с помощью генетически измененного вируса создана вакцина против герпеса у свиней.

Общественное  мнение. Несмотря на явную пользу от генетических исследований и экспериментов, само понятие «генная инженерия» породило различные подозрения и страхи, стало предметом озабоченности и даже политических споров. Многие опасаются, например, что какой-нибудь вирус, вызывающий рак у человека, будет введен в бактерию, обычно живущую в теле или на коже человека, и тогда эта бактерия будет вызывать рак. Возможно также, что плазмиду, несущую ген устойчивости к лекарственным препаратам, введут в пневмококк, в результате чего пневмококк станет устойчивым к антибиотикам и пневмония не будет поддаваться лечению. Такого рода опасности, несомненно, существуют.

Генетические исследования ведутся серьезными и ответственными учеными, а методы, позволяющие свести к минимуму возможность случайного распространения потенциально опасных  микробов, все время совершенствуются. Оценивая возможные опасности, которые  эти исследования в себе таят, следует  сопоставлять их с подлинными трагедиями, вызванными недоеданием и болезнями, губящими и калечащими людей.

Методы генной инженерии

Для получения рекомбинантной плазмиды ДНК одной из плазмид расщепляется выбранной рестриктазой. Ген, который нужно ввести в бактериальную клетку, выщепляют из ДНК хромосом человека с помощью той же рестрикционной эндонуклеазы, поэтому его "липкие концы" являются комплементарными нуклеотидным последовательностям на концах плазмиды. Ферментом лигазой"сшивают" оба куска ДНК (гена и плазмиды), в результате получается рекомбинантная кольцевая плазмида, которую вводят в бактерию Е. coli. ( рис. 53 ). Все потомки этой бактерии, называемые клоном, содержат в плазмидах чужеродный ген и способны вырабатывать белок, кодируемый этим геном. Весь процесс получения таких бактерий, называемый клонированием, состоит из последовательных стадий:

1. Рестрикция - разрезание ДНК человека  рестрикционной эндонуклеазой (рестриктазой) на множество различных фрагментов, но с одинаковыми липкими концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.

2. Лигирование - включение фрагментов ДНК человека в плазмиды благодаря сшиванию липких концов ферментом лигазой.

3. Трансформация - введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет их отделить от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высевают на студнеобразную питательную среду, предварительно разведя их так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.

4. Скрининг - отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченным зондом. Зонд - это полинуклеотид, комплементарный части искомого гена. Он гибридизуется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку и через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке, образовавшихся из-за радиоактивной метки зонда, позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном ( рис. 54 ).

Не  всегда удается точно вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей, некоторые гены не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктазами. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают не с вырезания из хромосом случайных фрагментов ДНК, а с целенаправленного получения нужного гена.

Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, являющуюся транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента -обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК. Затем и-РНК, служившая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается РНК-азой Н - специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК, спаренную с цепью ДНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой комплементарной второй цепи ДНК. Получившаяся двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого была считана и-РНК, запущенная в систему с обратной транскриптазой. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены человека ( рис. 55 ). С помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого фрагмента ДНК человека или другого высшего организма. Это позволяет изучить первичную структуру клонированного фрагмента, что приближает нас к пониманию организации структуры хромосомы. Если клонированный фрагмент кодирует белок, то экспериментально можно изучить механизм, регулирующий транскрипцию этого гена, а также наработать нужный белок в том количестве, которое требуется для медицинских или исследовательских целей. Кроме того, клонированный фрагмент ДНК одного организма можно ввести в клетки другого организма. Уже предпринимаются попытки вводить в те или иные культурные растения гены, обеспечивающие устойчивость к ряду болезней. Не за горами вмешательство в наследственную программу, полученную ребенком от родителя. Станет возможным введение в зародыш на ранних этапах его развития каких-либо недостающих генов и тем самым избавление людей от страданий, вызываемых генетическими болезнями .