Культуральные и тинкториальные свойства бактерий

 

РЕФЕРАТ

 

По дисциплине: «Ветеринарная микробиология»

 

 

На тему:

«Культуральные и тинкториальные свойства бактерий»

 

 

 

Оглавление

 

 

 

1. Введение

 

     Бактерии — домен (надцарство) прокариотных (безъядерных) микроорганизмов, чаще всего одноклеточных.

     До конца 1970-х годов термин «бактерия» был синонимом прокариотов, но в 1977 году на основании данных молекулярной биологии прокариоты были разделены на домены архебактерий и эубактерий. Впоследствии, чтобы подчеркнуть различия между ними, они были переименованы в архей и бактерий соответственно. Хотя до сих пор под бактериями часто понимают всех прокариотов, в данной статье описаны лишь эубактерии. Однако, эти две группы схожи, и многие положения статьи справедливы также для архей — в подобных случаях используется термин «прокариоты» или сочетание «бактерии и археи».

     В экологических и микробиоценотических исследованиях под бактериями часто понимают лишь нефотосинтезирующие немицелиальные прокариоты, противопоставляя их по функциям актиномицетам и цианобактериям.

 

 

2. Морфологические свойства  бактерий

 

     Характеристику  микроорганизмов, как правило, начинают  с их морфологических свойств. К морфологическим свойствам бактерий принадлежат: величина, форма, характер размещения в препарате, наличие дифференцированных структурных элементов - спор, капсул, включений, жгутов.

 

Размеры бактерий измеряются в микрометрах (мкм, 10-6 м), размеры внутренних структур бактериальных клеток - в нанометрах (нм, 10-9 м). Размеры бактерий, которые вызывают патологию человека, конечно колеблются в пределах 0,1 - 10 мкм. Типические кокки имеют около 1 мкм в диаметре, микоплазми могут иметь размеры 0,1 - 0,3 мкм, большинство палочек 2 - 5 мкм длиной и 0,5 - 1,0 мкм толщиной, спирохеты может быть 3 - 20 мкм в длину и 0,1- 0,5 мкм толщины.

 

Форма бактерий может быть разнообразной. Бактерии по форме делят на шаровидные, палочкоподобные, спиралеподобные, нитевидные и те, что разветвляются.

 

      Шаровидные (сферические) бактерии, или кокки (грец. kokkos - зерно, косточка) имеют округлую форму. Они могут иметь правильную сферическую форму, овальную, бобовоподобную (один из краев сплющенный или даже вогнутый, второй – выпуклый), ланцетовидную (один из краев округлый, второй — заостренный, имеет вид ланцету или пламя свечи). В зависимости от размещения клеток после их деления кокки подразделяются на группы: стафилококки ( беспорядочно расположенные клетки, иногда образующие скопления в виде «грозди винограда»), диплококки ( кокки, располагающиеся попарно), тетракокки (результат деления клетки в двух взаимно перпендикулярных направления -  сохраняются вместе по четыре кокка), стрептококки ( клетки, располагающиеся в виде цепочек различной длины) и сарцины (скопления кокков после их деления в виде «тюков», «пакетов»)

 

     Цилиндрические или палочковидные бактерии делят на две группы: собственно бактерии и бациллы. Последние в определенных условиях обитания образуют устойчивую форму существования – спору (бациллы сибирской язвы, столбняка, сенная палочка и др.) Бациллы, образующие спору, диаметр который больше бациллярной клетки, получили название клостридий из-за своей веретенообразной формы. Споры могут располагаться в центре микробной клетки, ближе к концу клетки (субтерминально) или на конце микробной клетки (терминально). Палочковидные бактерии разных видов располагаются одиночно, беспорядочно или в виде цепочек, нитей (стрептобактрии, стрептобациллы). Среди палочковидных имеются бактерии, которые в старых культурах приобретают разветвленную форму, например микобактерии (возбудители туберкулеза, паратуберкулеза). К одноклеточным ветвящимся бактериям относят также актиномицеты.

     Извитые бактерии также неоднородны. По внешнему виду различают: вибрионы, тело которых представляет один неполный завиток в виде запятой (холерный вибрион); спириллы -  микроорганизмы, тело которых представляет несколько крупных завитков ( по спирали) Наиболее характерный представитель этой группы -  возбудитель болезни содоку (распространенной в Юго-Восточной Азии); спирохеты – бактерии, тело которых представлено множеством спиралевидных завитков вдоль осевой нити. К группе извитых микроорганизмов относится род лептоспир.

 

Рис: Основные формы бактерий:

1 — микрококки; 2 — диплококки; 3 — стрептококки; 4 — тетракокки; 5 -сарцины; 6 — стафилококки; 7 — бациллы; 8 — бактерии; 9 — стрептобактерии; 10 — вибрионы; 11 — спириллы; 12 — спирохеты

Полиморфизм ,или плеоморфизм -это разнообразие морфологии бактерий. Бактерии очень пластичны и легко изменяются под действием различных неблагоприятных факторов - антибиотиков, солей лития, высокой концентрации хлорида натрию, низкого рН, изменения температуры, старение культуры. В результате реакций бактерий на действие этих факторов образуются различные по форме и величиной клетки: очень увеличенные, раздутые, шаровидные, кругообразные или нитевидные формы. Такие изменения морфологии бактерий связаны с нарушением синтеза бактериальной стены или механизма регуляции клеточного разделения.

     Ярко выраженный полиморфизм свойственный бактериям, лишенным клеточной стены - микоплазмам и L-формам, а также нокардиоподобным и коринебактериям, в которых в цикли развития наблюдается изменение форм клеток: кок- палочка- кок, могут быть также и формы, которые слабо разветвляются.

     Полиморфизм бактерий часто вызывает трудности при диагностике, его необходимо учитывать при идентификации возбудителей как в материале от больных, так и в чистых культурах. 
3. Культуральные свойства бактерий.

 

     К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.

Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.

                       

 

 

3.1. Поверхностные колонии.

 

     Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием: они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.

Описывая колонии различных бактерии, учитывают ряд общих критериев: величину, форму, контур края, рельеф, поверхность, цвет, структуру и консистенцию.

 

Величина колонии определяется ее диаметром. В зависимости от диаметра различают колонии:

1. точечные (диаметр меньше 1 мм);

2. мелкие (диаметр 1—2 мм);

3. средние (диаметр 2—4 мм);

4. крупные (диаметр 4—6 мм и более).

 

Форма колонии бывает:

1.правильная — круглая;

2. неправильная — амебовидная;

3.ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев.

 

Рис.1. Форма колоний:

 а – круглая; б – круглая с фестончатым краем;

в – круглая с валиком по краю; г; д – ризоидная; е – с ризоидным краем; ж –амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая; к – неправильная; л – концентрическая; м – сложная

 

 

Поверхность колонии изучают с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность колоний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная.

Профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т. д.

 

Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку. Различают:

1) каплеобразные и куполообразные  колонии правильной круглой формы  с различно выраженной степенью  выпуклости, которые в вертикальном  разрезе представляют собой сегмент  шара и отличаются только длиной  радиуса. Колонии слабовыпуклые  имеют большую длину радиуса; куполообразные — меньшую;

2) колонии плосковыпуклые  с плоским верхом, пологими или  круто обрывающимися краями; имеют  в вертикальном разрезе форму  трапеции;

3) колонии конусообразные, имеющие в вертикальном разрезе  форму треугольника;

4) колонии с приподнятой  в виде соска серединой и  валиком по периферии;

5) колонии с вдавленным  центром;

6) колонии плоские, стелющиеся  по поверхности среды.

 

 

Рис.3: Профиль колоний:

а – изогнутый; б – кратерообразный; в – бугристый;  г – врастающий в агар; д – плоский; е –выпуклый; ж – каплевидный; з – конусовидный.

 

Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной линии и неровные. Последние делят на:

1. фестончатый край, состоящий  из крупных, слегка округлых или  уплощенных зубцов правильной  формы;

2. волнистый край, который  несколько отличается от фестончатого  тем, что крупные зубцы его  выражены нечетко;

3. эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;

4. бахромчатый край, имеющий  нежные ворсинки.

В некоторых случаях четко выраженная линия, отграничивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым.

 

Рис.4: Край колоний:

а - гладкий; б – волнистый; в – зубчатый; г – лопастный; д – неправильный; е – реснитчатый; ж – нитчатый; з – ворсинчатый; и - ветвистый

 

Цвет колонии определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

Прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая.

 

Структура колоний определяется в проходящем свете при слабом увеличении микроскопа, суженной диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. У пигментированных колоний и колоний, не пропускающих света, она не определяется.

По характеру структуры различают следующие виды колоний:

1) гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной  структуры;

2) зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко - и грубозернистые

3) нитевидные или волокнистые, характеризующиеся наличием длинных, густо переплетающихся нитей  в толще колонии

Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой

 

Консистенцию колонии, определяющую ее физическое состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии бывают:

1) пастообразные, легко снимающиеся  и размывающиеся по поверхности  питательной среды наподобие  сливочного масла;

2) вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за  петлей;

3) волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности  питательной среды в виде упругой  пленки, соответствующей величине  и форме колонии;

4) хрупкие, сухие, рассыпающиеся  при прикосновении петли.

 

Рис.5: Морфологическое и структурное разнообразие колоний:

1. Формы выпуклости колоний над  поверхностью питательной среды;

2. Очертания колоний;

3. Характер края колоний;

4. Внутренняя структура колоний. 

3.2. Глубинные колонии.

 

     Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.

 

 

3.3. Донные колонии.

 

     Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

Особенности колонии: могут изменяться с возрастом, они зависят от состава среды и температуры культивирования.

 

 

 

• Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают используя четырех-семисуточные культуры, выращенные в стационарных условиях.
• В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.
• При росте на полужидких (0,5-0,7 % агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду.
• Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтилового, уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.
• Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды, антоцианы, меланины. Если пигмент нерастворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов.
• В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются главным образом в речной или морской воде. К светящимся бактериям - фотобактериям -относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки).

 

 

4.Тинкториальные свойства бактерий.

 

     Бактериальные клетки являются полупрозрачными, слабо преломляют свет, оттого при обычных методах микроскопии в неокрашенном состоянии их тяжело выявить. Для выявления бактерий в нативных препаратах используют микроскопию в темном поле зрения, фазово-контрастную и аноптральную микроскопию, а также микроскопию в обычном световом микроскопе с опущенным конденсором. Однако эти методы исследования недостаточно информативные и имеют ограниченное применение при микробиологической диагностике. Намного больше значение имеет микроскопическое изучение предварительно убитых, а затем окрашенных бактерий. В микробиологии более часто применяют для окраски микроскопических препаратов анилиновые красители. При простой окраске используют один краситель, сложные методы окраски проводятся с применением ряда красителей и других веществ в несколько этапов. Простая окраска является удобной для обзорной микроскопии, выявления формы и взаиморасположения бактерий. Сложные методы окраски позволяют выявить тонкие детали строения бактерий и провести цитохимическое исследование для выявления химических компонентов бактериальной клетки.

     Разработка и использование методов окраски позволили подробно изучить морфологию бактерий, выявить структурные элементы, которые имеют дифференциальное значение и важные для идентификации бактерий, изучить отличия между бактериями в способности воспринимать красители, которая определяет так называемые тинкториальные свойства бактерий.

 

     Тинкториальные свойства бактерий (лат. tinctura, от tingo - окрашиваю) способность к окраске: восприимчивость к окраске, кислото-спирто-щелочеустойчивость, равномерность окраски, метахроматичность, отношение к окраске по методу Грама.

 

Восприимчивость к окраске у большинства видов бактерий является высокой, они легко и быстро воспринимают окраску. Как правило, перед окраской бактерии фиксируют в пламени или химическими фиксаторами, в результате чего бактерии погибают и лучше воспринимают красители. При окраске в живом состоянии ферментные системы бактерий могут разрушать и обесцвечивать краситель, оттого прижизненное (витальное) окрашивание редко применяется в микробиологии.

 

     Отдельные структурные элементы бактериальной клетки по-разному воспринимают красители. Споры и капсулы, которые имеют дифференциальное значение плохо воспринимают красители и не окрашиваются при обычных методах окраски. Но, их можно заметить в обычных окрашенных препаратах: спора видна как светлое тельце на фоне окрашенной цитоплазмы или ее остатков, капсула в виде светлого ореола на окрашенном фоне препарата вокруг интенсивно окрашенного тела бактерий. Разработаны и используются в диагностической практике специальные сложные методы окраски спор и капсул, с которыми студенты знакомятся на практических занятиях.

 

     Не воспринимают окраски в обычных условиях некоторые бактерии, которые являются кислото-спирто-щелочеустойчивыми, то есть не погибают при действии растворенных кислот, щелочей и спирта. К ним относятся микобактерии туберкулеза, проказы, некоторых актиномицеты. Кислотоустойчивость этих бактерий обусловлена высоким содержанием липидов, наличием миколовых кислот и физико-химическими особенностями их клеточной стенки. У микобактерий до 40 % сухого остатка составляют липиды. Выявленные три фракции липидов:

фосфатидная (растворимая в эфире);

жировая (растворимая в эфире и ацетоне);

 восковая (растворимая в эфире и хлороформе).

      В составе липидов есть различные кислотоустойчивые жирные кислоты: миколовая, туберкулостеариновая, фтионовая и др. Липиды и миколовые кислоты определяют гидрофобность клеточной поверхности, которая добавляет клетке стойкость к действию растворенных в воде токсических веществ. Ненасыщенные кислоты, которые составляют 50 % от всего количества миколовых кислот, остаются жидкими даже при низких температурах и обеспечивают эластичность оболочки, необходимую для транспорта гидрофобного субстрата. Поэтому некоторые свободноживущие сапрофитные микобактерии способны использовать гидрофобные субстраты, в частности парафины нефти. Существует зависимость между количественным содержанием миколовых кислот и степенью кислотоустойчивости. Кислотоустойчивость сохраняется только при целостности клеточной стены, появление даже небольшого дефекта стенки приводит к потере кислотоустойчивости.

     Кислотоустойчивость является дифференциально-диагностическим признаком и используется для выявления и идентификации бактерий. Кислотоустойчивость бактерии окрашивают интенсивным методом – концентрированным раствором карболового фуксина при подогревании. Восприняв красную окраску, кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются при обработке кислотой, щелочью или спиртом. Поэтому после окраски фуксином препарат дифференцируют 5 - 10 % серной кислотой или подкисленным спиртом и после промывания водой дополнительно окрашивают обесцвеченные кислоточувствительные микроорганизмы контрастным красителем, например метиленовым синим.

 

Равномерность окраски. Большинство патогенных бактерий окрашивается равномерно, причем детали внутренней структуры бактериальной клетки не оказываются. Часто видимая гомогенность окраски обусловлена тем, что краситель интенсивно связывается с оболочками клетки и маскирует окраску внутренних структур. Например, только при использовании очень разбавленных растворов кристаллвиолета удается получить избирательное окрашивание гранул волютина, в то время, как краситель в обычной концентрации дает равномерную окраску клетки. Однако, некоторые бактерии (палочки чумы) и при обычных методах окраски могут окрашиваться биполярно, в виде «английской булавки», то есть более интенсивно по полюсам, а центр остается слабоокрашенным. Неравномерно окрашиваются также спороносные палочки, поскольку спора не прокрашивается.

 

Метахроматичность (греч. meta - изменение, chroma - цвет) способность окрашиваться в другой цвет, чем цвет основного красителя. Диагностическое значение имеет метахроматичность зерен волютина у коринебактерий дифтерии. При окраске метиленовым синим, толуидиновым синим гранулы волютина окрашиваются в фиолетово-красный, вишневый цвет. Обычно для выявления зерен волютина окраски проводят щелочным метиленовым синим, при этом волютин окрашивается в темно-синий, а тело клетки - в голубой цвет.

 

Отношение к окраске по Граму. В 1884 г. Х. Грам предложил метод окраски для выявления некоторых бактерий в тканях животных. В дальнейшем этот метод окраски распространился в микробиологии, и на отношении к окраске за Граммом основанное разделение подавляющего большинства бактерий на грациликуты (грамотрицательные) и фирмикуты (грамположительные).

     Окраска по Граму заключается в том, что сначала препарат окрашивают генцианвиолетом (кристалвиолетом, метилвиолетом и др.), потом обрабатывают водным раствором йода (в виде раствора Люголя) и дифференцируют этиловым спиртом. Одни бактерии, грамположительные, сохраняют при этом темно-фиолетовую окраску, другие, грамотрицательные, обесцвечиваются спиртом и затем окрашиваются раствором фуксину в контрастный красный цвет.

 

 

     Клеточная  стена грамположительных бактерий характеризуется высоким содержанием пептидогликана (муреина), который образует толстый многослойный мешок, наличием частых поперечных пептидных связей между нитями гликана, присутствием в муреиновом слое тейхоевых кислот, малым содержанием липидов. В результате обработки спиртом происходит разбухание муреинового слоя и уменьшение диаметра пор клеточной стенки, которая приводит к снижению ее проницаемости. Поэтому комплексное соединение генцианвиолета с веществом цитоплазмы и йодом у грамположительных бактерий хоть и растворяется в спирте, но не может выйти через клеточную стенку, и клетка сохраняет первичную окраску.

     Клеточная  стена грамотрицательных бактерий имеет тонкий крупноячеистый слой муреина с редкими поперечными связями и содержит много липидов, которые растворяются и вымываются при обработке спиртом. Поэтому проницаемость клеточной стены, и так более высокая, чем у грамположительных бактерий, увеличивается еще больше, и краситель легко вымывается спиртом, наступает обесцвечение грамотрицательных бактерий.

     Доказательством того, что в окраске по Граму основную роль играет клеточная стенка, является тот факт, что при нарушении целостности клеточной стены после обработки лизоцимом, под действием пенициллина или в результате дегенерации бактерий при старении культуры грамположительных бактерии окрашиваются грамотрицательно.

 

5. Выделение чистых культур  микроорганизмов.

 

     Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий -обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной практике, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и в целом при любой работе с микроорганизмами.

     Исследуемый материал (вода, почва, воздух, пищевые продукты или другие объекты) обычно содержит ассоциации микробов. Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, т. е. производится его идентификация.

     Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп:

 

1. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

 

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и в дальнейшем при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

 

3. Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов, обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу, на месте посева. Пересевая верхние края культуры, можно получить чистую культуру.

 

4. Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках.

     С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 суток выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

 

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведение исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 оС агаризированной питательной среде.

     Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды.

     Для извлечения изолированных колоний анаэробов пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

 

6. Метод Хангейта. Когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку; среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

 

7. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.