Микрофлора полости рта. 2

Введение. 

Нормальная микрофлора сложилась эволюционным путем как  результат взаимного действия множества  факторов, связанных с взаимодействием  внешней среды и состоянием макроорганизма, а также в зависимости от взаимоотношений  разных видов микробов, входящих в биоценоз.

Полость рта  представляет собой уникальную открытую экосистему для самых разнообразных  микроорганизмов. С первых дней жизни  ротовая полость обсеменяется микробами, численность и разнообразие которых  определяется множеством факторов внутренней среды организма и внешнего окружения. Несмотря на это, существует индивидуальная и анатомическая специфичность состава микроорганизмов, населяющих конкретный биотип. 
 

  Микрофлора полости рта здоровых лиц. 

В настоящее  время описано несколько сотен  видов микроорганизмов, входящих в нормальную микрофлору полости рта. Среди микробов полости рта встречаются аутохтонные и аллохтонные виды. Аутохтонная микрофлора подразделяется на облигатную, постоянно обитающая в полости рта и транзиторную или временную. 

Микробный пейзаж полости рта здоровых лиц. 

К облигатной флоре  относится основная масса грамположительных  кокков, которая представлена гетерогенной группой стрептококков. В эту группу входят Streptococcus salivarius, Str. sanquis, Str. mutans. Они отличаются друг от друга по способности ферментировать углеводы и образовывать перекись водорода. Сдвиг рН в кислую сторону приводит к декальцинации эмали. Важна также способность стрептококков синтезировать из сахарозы полисахариды. При этом глюкозная часть молекулы превращается в нерастворимый декстран, который способствует образованию зубных бляшек. Зеленящие стрептококки встречаются в полости рта в различных количественных соотношениях, которые зависят от диеты, гигиены полости рта, возраста и других факторов.

Грамотрицательные анаэробные кокки представлены родом Veilonella. Они достаточно хорошо разлагают лактат, пируват, ацетат и другие углеводы до углекислоты и воды. За счет катаболизма молочной кислоты, образуемой зеленящими стрептококками, вейлонеллы могут оказывать противокариозное действие.

Грамположительные палочки представлены в полости рта родом Lactobacillus. Они разлагают углеводы с образованием молочной кислоты, сохраняя жизнеспособность при низких значениях рН среды. Наиболее часто в полости рта здоровых лиц встречаются L. casei , L.acidophylius L.salivarius.

Грамотрицательные анаэробные и микроаэрофильные бактерии чаще всего относятся к семейству  Bacteroidaceae. Они ферментируют сахара до газа, а пептоны - с образованием аминокислот. К данному семейству относятся три рода: Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia .Наиболее часто встречаются B.melaninogenicus и B.gingivalis. . Они характеризуются низкой сахаролитической активностью, однако глюкозу разлагают с образованием смеси кислот, причем рН среды остается достаточно высоким. Данные виды являются постоянными обитателями десневых карманов. Наличие протеолитических ферментов у бактероидов имеет большое патогенетическое значение в развитии заболеваний пародонта.

Род Fusobacterium представлен палочками веретенообразной формы. Они образуют из пептона или глюкозы молочную кислоту. Фузобактерии обитают в десневых карманах в ассоциациях со спирохетами.

Представители рода Leptotrichia (L.buccalis) имеет вид попарно расположенных зернистых палочек, часто нитевидной формы. Они не образуют индол и сероводород, ферментируют глюкозу с образованием большого количества молочной кислоты, что приводит к понижению рН среды до 4,5. При заболеваниях пародонта количество этих бактерий возрастает. Семейство Propionibacteriaceae включает в себя анаэробные бактерии, которые при разложении глюкозы образуют пропионовую и уксусную кислоты.

Из семейства  Actinomycetaceae полости рта чаще всего встречаются роды Actinomyces и Bifidobacterium. Первые ферментируют углеводы с образованием кислых продуктов без выделения газа. Конечными продуктами расщепления глюкозы являются уксусная, молочная, муравьиная и янтарная кислоты. Обладают слабой протеолитической активностью. Актиномицеты находятся на слизистой оболочке рта, составляют строму зубного камня и входят в состав зубного налета. Наряду с этим, они содержатся в кариозных полостях зубов, в патологических десневых карманах, в протоках слюнных желез.

В полости рта  встречаются бактерии рода Corynebacterium. Характерной особенностью их является способность снижать окислительно-восстановительный потенциал, создавая тем самым условия для роста анаэробов. При заболеваниях пародонта они встречаются в ассоциациях с фузобактериями и спирохетами.

Спирохеты, обитающие  в полости рта, относятся к  трем родам: Трепонемы полости рта  представлены видами T. macrodentium, T. denticola и T. orale Они отличаются друг от друга по образованию молочной, уксусной и других киолот и сбраживанию углеводов. Боррелии полости рта представлены B. buccalis, чаще встречающиеся в ассоциациях с фузиформными бактериями. Основным местом обитания боррелий являются десневые карманы.

В полости рта  встречаются микоплазмы - М. rale и M. salivarius. Они гидролизуют аргинин, не ферментируют глюкозу и отличаются друг от друга по некоторым биохимическим признакам.

Постоянное сосуществование микроорганизмов самых различных видов предполагает различные формы взаимодействия микробов на метаболическом и генетическом уровнях. Бактерии могут угнетать рост других видов за счет более высокого биологического потенциала путем изменения рН среды, благодаря продукции молочной кислоты, спиртов, перекиси водорода и других веществ. Из всех факторов, определяющих природу и состояние флоры полости рта, решающим является слюна. Важнейшими в этом отношении факторами слюны являются интенсивность ее образования, вязкость, содержание минеральных компонентов, ионная потенция, буферные свойства, рН, основные метаболиты, присутствие или отсутствие слюнных газов, органический состав (особенно аминокислоты, полисахариды, витамины, пурины, пиримидины), антибактериальные свойства (лизоцим, секреторные антитела, лейкоциты).

В 1 мг. зубного  налета, по данным разных авторов, содержится от 5 до 800 млн. микроорганизмов. Микроорганизмы зубного налета делят на две большие  группы: 1 - бактерии ацидофильные, к  которым относятся виды, способные развиваться в кислой среде; 2 -протеолитические микроорганизмы, вырабатывающие протеиназы.

В первую группу входят молочно - кислые стрептококки, лактобациллы, актиномицеты, лептотрихии  и коринебактерии. Стрептококки, коринебактерии и

актиномицеты  могут развиваться и в основной среде. В этом случае из-за своей  способности синтезировать молочную кислоту они быстро нейтрализуют среду. Среди ацидофильных бактерий имеются ацидогенные, которые способны синтезировать из сахарозы большое количество молочной кислоты (иногда уксусной).

Все стрептококки зубного налета делятся на 4 группы: Str.  salivarius, mitis, mutans. Str. salivarius легко определяются морфологически по форме колоний, образующихся на желатине, содержащим 5% сахарозы: крупные слизистые колонии, содержащие большое количество леванов. Эти стрептококки встречаются в зубном налете в малых количествах, но их достаточно много на слизистых оболочках и в слюне.

Str. mitis составляют основную массу стрептококков, выделенных из зубного налета. Они очень гетерогенны, относятся к группе зеленящих стрептококков и обладают слабой биохимической активностью. Всего лишь несколько штаммов Str. mitis способны синтезировать экстрацеллюлярные полисахариды.

Str. sanguis занимает второе место по количественному содержанию в зубном налете.

Наиболее интересным видом молочно - кислых стрептококков  является Str. mutans в связи с его резко выраженными кариесогенными свойствами.

Среди ацидофильных бактерий зубной бляшки, 15% составляют нитевидные формы (актиномицеты, лактобациллы и лептотрихии). Актиномицеты образуют леваны; лактобациллы не образуют внеклеточных полисахаридов, за исключением Lactobacillus casei, которые могут образовывать некоторые капсульные полисахариды; лептотрихии вообще не вырабатывают полисахаридов; вторую группу бактерий зубного налета составляют анаэробы, которые используют пищевые протеины и аминокислоты. Количество анаэробов в зубном налете уменьшается при употреблении сахарозы и увеличивается при употреблении мальтозы.

В некариозной зубной бляшке большую часть составляют вейллонеллы, нейссерии и наименьшую -спирохеты. В кариозной зубной бляшке главными протеолитическими бактериями являются ристеллы.

Кроме упомянутой выше микрофлоры, в зубной бляшке обнаружены и другие виды микроорганизмов, в частности дрожжеподобные грибы, дифтероиды, стафилококки.

На всех этапах развития зубной бляшки в ней преобладают  стрептококки.

Бактерии находятся  в основном в трех зонах:

      1) в зубных бляшках на коронках  зубов, а в случае кариеса  - в кариозной полости;

      2)  в гингивальных бороздах;

      3)  на спинке языка, особенно в задних ее отделах.

По данным разных авторов, количество бактерий в слюне  колеблется от 43 млн. до 5,5 млрд. в 1 мл, т.е. в среднем 750 млн. в 1 мл. Микробная  же концентрация в бляшках и десневой (гингивальной) борозде почти в 100 раз выше - примерно 200 млн. клеток на 1 г. Около половины резидентов является факультативными и облигатно анаэробными стрептококками, которые включают в свой состав Str. mutans, Str. mitis, Str. sanguis пептострептококки. R-гемолитические стрептококки не являются составной частью резидентной флоры. Различные виды стрептококков занимают определенную нишу, например наибольшее количество энтерококков было обнаружено на спинке языка и в гингивальной бороздке, Str. mutans обычно локализуются в бляшке на коронке.

Другая половина резидентной флоры состоит из вейллонелл (около 25%) и дифтероидов (около 25%). Стафилококки, лактобациллы, жгутиковые микроорганизмы, спирохеты, лептоспиры, фузобактерии, бактероиды, нейссерии, спиралевидные формы, дрожжи, другие грибы, простейшие находятся в полости рта в гораздо меньшем количестве. Хотя эти микроорганизмы постоянно присутствуют в полости рта, Они никогда не бывают так широко представлены, как стрептококки, вейллонеллы, дифтероиды. Эти данные свидетельствуют о том, что необходимо различать главных и второстепенных представителей резидентной микрофлоры. 

Возрастные  изменения микрофлоры полости рта. 

Полость рта  эмбриона обычно стерильна. Первичное  инфицирование происходит при прохождении через родовые пути. Сначала полость рта колонизируют бифидобактерии, кишечная палочка, энтерококки, зеленящие стрептококки,Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium pseudodifhtericum и Candidi albicans. Через несколько недель полость рта колонизируют анаэробные бактерии, спирохеты, гемофилы и нейссерии.

У младенцев, на спинке языка наиболее часто выделяют стафилококки и стрептококки (особенно Streptococcus salivarius). На слизистой оболочке щек преобладают стрептококки. На твердом небе около сагиттальной линии у младенцев преобладают грамположительные кокки. При формировании молочных зубов появляются условия для колонизации полости рта другими микроорганизмами, в том числе анаэробами. У взрослых с полным прикусом преобладают грамотрицательные кокки. В 10,5% случаев выделяют грамотрицательные палочки. Аналогичные соотношения на вестибулярной поверхности верхнего альвеолярного отростка. На миндалинах у младенцев преобладают кокки (в 58% случаев грамположительные; в 39,6% - грамотрицательные). У детей с молочным прикусом на миндалинах обнаруживают практически все виды микроорганизмов; в 12,1% случаев выделяют грамотрицательные палочки.

Обильный рост анаэробов, а также появление  простейших наблюдают при прорезывании зубов. Содержание стафилококков вариабельно: их выделяют у 70-80% младенцев, у 30-50% детей младшего возраста; у подростков их содержание снижается, а позднее оно вновь повышается. С возрастом повышается содержание анаэробных бактерий, лактобацилл, стафилококков, кандид и простейших.

Потеря зубов  в пожилом возрасте приводит к  значительному уменьшению содержанию облигатных анаэробов. Наличие съемных  протезов приводит к развитию хронического воспаления под основой (базисом) протеза с нарушением слюноотделения и орошения слизистой оболочки. В подобных ситуациях резко возрастает колонизация грибами Candida, а также бактериями, происходящими из ЖКТ, - эшерихиями, энтерококками, и др.

В первые месяцы жизни ребенка в полости рта  преобладают аэробы и факультативные анаэробы. Это связано с отсутствием  у детей зубного ряда, необходимого для существования строгих анаэробов. Среди микроорганизмов, обитающих  в этот период в полости рта, преобладают стрептококки, преимущественно S. salivarius, лактобактерии, нейссерии, гемофиллы и грибы рода Candida, максимум которых приходится на 4 месяце жизни. В складках слизистой оболочки полости рта могут вегетировать незначительные количества анаэробов -вейлонеллы и фузобактерии. Прорезывание зубов способствует резкому изменению качественного состава микроорганизмов, которое характеризуется появлением и быстрым нарастанием количества строгих анаэробов. Одновременно происходит распределение микроорганизмов и "заселение" ими полости рта в соответствии с особенностями анатомического строения. При этом образуются многочисленные микроэкосистемы с относительно стабильными микробными популяциями. Спирохеты и бактероиды появляются в полости рта лишь к

14   годам,   что   связано   с   возрастными   сдвигами   в гормональном фоне организма. 

Идентификация представителей нормофлоры полости рта. 

ЛАКТОБАКТЕРИИ. Род Lactobacillus Палочковидные бактерии, неподвижные, спор не образуют, грамположительны, факультативные анаэробы, хемоорганотрофы.

На кровяном агаре образуют серые колонии, или  мелкие, окруженные зоной альфа - гемолиза колонии. Биохимические свойства: ферментируют глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, сорбит с образованием молочной кислоты. Нитраты не восстанавливают, желатин не разжижает, индол и сероводород на образует.

В полости рта: L. casei, L. acidophilus, L. yermentum, L. salivarius.

СТРЕПТОКОККИ.   Семейство   Streptococcaceae,   род Streptococcus.

Грамположительные кокки, располагающиеся в мазках короткими или длинными цепочками.

По виду гемолиза на 5% кровяном агаре стрептококки делятся  на 3 группы:

           1.  Гемолитические стрептококки, вызывающие полный лизис эритроцитов с                прозрачной зоной гемолиза. Колонии могут быть:

           а) мукоидные, крупные, блестящие в диаметре 1,5 -2,5мм., напоминающие капельки росы. Данный вид колоний характерен для капсульных штаммов S. pyogenus.

           б) шероховатые, до 2,5 мм. в диаметре серо-белого цвета с приподнятым центром. Этот вид колоний характерен для штаммов, содержащих М - протеин.

           в) гладкие, мелкие, до 1,5 мм. в диаметре сферической формы, блестящие.

           2. Зеленящие стрептококки - образуют на 55 кровяном агаре полупрозрачную, зеленоватого цвета зону гемолиза. Колонии мелкие, до 1,5 мм. в диаметре, серовато-зеленоватого цвета с гладкой, либо шероховатой

поверхностью.   Этот   тип   колоний   характерен   для S. salivarius, S. sanguis.

           3. Негемолитические стрептококки - не реагируют с эритроцитами, не вызывают гемолиза.

После микроскопического  изучения, производят пересев колоний  в питательный бульон с сывороткой (10%) или глюкозой (0,2%). Инкубируют при  температуре 37 °С , 24 часа.

На следующий  день учитывают характер роста стрептококков  в жидкой питательной среде, делают мазки, окрашивают по Граму. Характер роста может быть различным:

а) придонно-пристеночный рост с образованием мелко-крошковатого осадка и сохранением прозрачности среды. Микроскопически выявляются длинные цепочки грамположительных  кокков.

б) придонный  рост в виде пушистого, рыхлого осадка с сохранением прозрачности среды  или помутнением надосадочного  слоя. Микроскопически выявляются цепочки  грамположительных кокков, с уменьшением  длины цепочек возрастает наклонность  к диффузному росту.

в) диффузный  рост с интенсивным помутнением  бульона и образованием гомогенного  осадка. Идентификацию культур гемолитического  стрептококка осуществляют на третий день исследования по методу Ленсфильда. Принцип метода: образование видимого преципитата в результате взаимодействия группоспецифического полисахарида "С" с соответствующими ему антителами группоспецифической антистрептококковой сыворотки. 

Дифференциальные признаки стрептококков. 

СТАФИЛОКОККИ.   Семейство  Micrococcaceae,  род Staphylococcus Грамположительные кокки, располагаются в мазках скоплениями. Колонии гладкие, блестящие, от белого до ярко-желтого цвета. При росте на 5% кровяном агаре большинство штаммов S. aureus и некоторые штаммы S. epidermidis образуют вокруг колоний зону гемолиза.

На следующих  этапах выделяют чистую культуру и  проводят видовую идентификацию  выделенных стафилококков.

Для установления принадлежности культур к семейству Micrococcaceae используют тест на каталазу. Представители данного семейства имеют фермент каталазу и способны расщеплять 3% перекись водорода на воду и газообразный кислород.

Установление  принадлежности культуры к роду Staphylococcus проводят по культуральным (колонии на ЖСА от белого до ярко-желтого цвета, на кровяном агаре зона гемолиза), морфологическим (грамположительные кокки, располагающиеся одиночно, парами, но чаще скоплениями в виде " гроздьев винограда"), биохимическим (ферментация глюкозы в анаэробных условиях) свойствам. На последнем этапе устанавливают видовую принадлежность стафилококков.

Штаммы S. aureus вырабатывают плазмокоагулазу, ДНК-азу, способны ферментировать маннит в анаэробных условиях. В большинстве случаев штаммы S. aureus обладают ферментом, лецитиназой, гемолизином.

Для штаммов  S. epidermidis характерны: чувствительность к новобиоцину, наличие фосфатазы, неспособность окислять маннит. Некоторые штаммы обладают пигментом, лецитиназой, гемолизином.

Штаммы S. saprophyticus обладают противоположными свойствами: нечувствительны к новобиоцину, не имеют фосфатазы, способны окислять маннит.

Поскольку не все  стафилококки по своим характеристикам  укладываются в указанную схему, такие штаммы следует обозначать Staphylococcus spp.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ. Колонии грибов рода Candida- белые, блестящие, выпуклые с гладкой или морщинистой поверхностью. Могут иметь розовый или кремовый цвет. Микроскопически обнаруживаются крупные овальные почкующиеся клетки, грамположительные. Для выявления филаментации грибов рода Candida производят посев чистой культуры на картофельный агар. Биохимическую идентификацию проводят на основании способности штаммов ферментировать глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу.

Семейство     Bacteriodaceae    включает     три     рода: Bacterioides, Fusobacterium, Leptotrichia.

БАКТЕРИОИДЫ. К  роду Bacterioides относятся полиморфные, мелкие, грамотрицательные палочки, чаще с биполярной окраской. Спор не образуют, строгие анаэробы. Внешне колонии бактероидов бывают различными: мелкие, плоские, непрозрачные, серовато-белые с ровными краями, светло-коричневые средних размеров, желтовато-белые, непрозрачные, выпуклые, с

зазубренными  краями. Нередко обращает на себя внимание отвратительный запах при росте  бактериоидов на питательных средах. На кровяном агаре образуют колонии черного цвета растут в 20% желчи. В сахарном бульоне образует помутнение,

Наиболее часто  в полости рта встречается  В. oralis. Штаммы В. oralis на среде с кровью образуют колонии полупрозрачные, гладкие, гемолиз отсутствует. Интенсивно сбраживает углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу) с образованием янтарной кислоты. Не обладают уреазой, выделяют индол, не образуют сероводород.

ФУЗОБАКТЕРИИ. К  роду Fusobacterium относятся грамотрицательные, тонкие, нитевидные палочки с заостренными концами, могут располагаться цепочками, облигатные анаэробы. Хемоорганотрофы. Растут на кровяном агаре. Колонии мелкие, желтые, окруженные зоной альфа-гемолиза. Ферментируют глюкозу, образуют сероводород, индол, обычно каталазоотрицательны. Типовой вид – F. nucleatum, обитатели ротовой полости.

ЛЕПТОТРИХИИ - род  Leptotrichia. Прямые и слегка изогнутые палочки, располагающиеся цепочками, грамотрицательные. Неподвижны. Строгие анаэробы, гетеротрофы. Растут на средах с добавлением сыворотки, асцитической жидкости, крахмала, в атмосфере 55 СО2. Ферментируют глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу до кислоты. В полости рта наиболее часто встречается L. buccalis.

ВЕЙЛОНЕЛЛЫ - относятся  к роду Veillonella. Мелкие грамотрицательные кокки, неподвижны, спор не образуют, располагаются в мазках парами или короткими цепочками. Строгие анаэробы. Хемоорганотрофы. Растут на средах содержащих лактат, рН 6,5-8,0. Колонии мелкие, гладкие, маслянистые, серовато-белого цвета. Углеводы не

ферментируют, желатин  не разжижают, индол не образуют, гемолитическими свойствами не обладают, восстанавливают нитраты в нитриты.

НЕЙССЕРИИ - род  Neisseria. Бобовидные кокки, грамотрицательные, располагаются парами или небольшими скоплениями. Неподвижны. Аэробы или факультативные анаэробы. Растут на МПА с добавлением крови или сыворотки. Колонии светлые, полупрозрачные. Биохимически малоактивны (расщепляют глюкозу и мальтозу). Обладают цитохромоксидазой и каталазой.

КОРИНЕБАКТЕРИИ - относятся к роду Corynebacterium. Прямые или слегка изогнутые, грамположительные палочки, располагаются в виде частокола. Спор не образуют, не подвижны. Факультативные анаэробы. На питательных средах с теллуритом калия образуют серовато-белые и колонии. Растут на кровяных и сывороточных средах. В полости рта встречается C. hofmani..

Семейство Spirochaetaceae - в полости рта обнаружены:

1.Treponema denticola - тонкие спиральные клетки, на концах изогнуты, подвижны. Растут на средах с пептоном, дрожжевым экстрактом, сывороткой - в анаэробных условиях 2 недели. Колонии белые, диффузные. Стимулирует рост добавление в среду кокарбоксилазы. Углеводы не ферментируют, сероводород, индол образуют. Гидролизируют крахмал, гликоген, эскулен, желатин. Обнаружены в полости рта людей и шимпанзе а также в местах соединения зубов с деснами.

2. Treponema orale- тонкие, спиральные клетки, образующие цепочки. Подвижны. Растут на средах с пептоном и дрожжевым экстрактом. Среда также должна содержать глюкозу, цистеин, кокарбоксилазу, кроличью

сыворотку. В  жидкой среде вызывают равномерное помутнение. Углеводы не ферментируют, но ферментируют аминокислоты, образуют индол и сероводород. Обнаруживаются в десневых карманах людей.

3. Treponema macrodentinum - тонкие спиральные клетки с заостренными концами. Подвижны. Растут на средах, содержащих пептон, дрожжевой экстракт, 10% кокарбоксилазу, глюкозу, цистеин. Углеводы ферментируют и используют как источники энергии. Расщепляют глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу до кислоты. Не образуют индола, образуют сероводород. Обнаруживаются в десневых карманах людей.  

Микробная обремененность полости  рта, КО-Е/ед.суб.