Понятие о буферных растворах, буферной ёмкости, рН растворов

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

Волгоградский государственный медицинский университет

Министерства Здравоохранения Российской Федерации

 

Кафедра  клинической лабораторной диагностики с курсом клинической лабораторной диагностики ФУВ

 

 

Реферат

на тему:

«Понятие о буферных растворах, буферной ёмкости, рН растворов.

Уравнение Гендерсона- Хассельбаха. Основные показатели кислотно-основного равновесия крови. Буферные системы крови»

 

 

 

 

Выполнила: студентка 2 курса

лечебного факультета 19 группы

Рюмина Екатерина Андреевна

Проверила:

Матохина Ульяна Борисовна 

 

 

 

 

Волгоград 2014

Содержание:

 

1. Введение
2. Понятие о буферных растворах
3. Буферная ёмкость
4. Уравнение Гендерсона- Хассельбаха. Вычисление рН и рОН буферных систем
5. Основные показатели кислотно-основного равновесия крови
6. Буферные системы крови
7. Заключение
8. Список литературы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

 

Многие реакции в растворе протекают в нужном направлении только при определенной концентрации ионов Н+. Изменение её в ту или иную сторону от соответствующего оптимального значения приводит к появлению новых, часто нежелательных продуктов. В связи с этим, поддержание постоянного значения рН на протяжении всего времени осуществления реакции часто является важным условием ее успешного завершения.

Особенно актуально это для биохимических процессов, протекающих в живых организмах. Большинство из них катализируется различными ферментами или гормонами, проявляющими свою биологическую активность только в строго определенном и достаточно узком интервале значений рН.

Важную роль в поддержании постоянного рН играют буферные растворы или буферные системы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Понятие о буферных растворах

 

Растворы, способные сохранять постоянной концентрацию ионов Н+ при добавлении к ним небольших количеств сильной кислоты или щелочи, а также при разбавлении, называются буферными растворами или буферными системами.

Свойство данных растворов сохранять неизменным присущее им значение рН при вышеперечисленных обстоятельствах, называется иначе буферным действием.

Кислотно-основная пара буферного раствора представляет собой слабую кислоту и ее соль, образованную сильным основанием (например, уксусная кислота СН3СООН и ацетат натрия CH3COONa) или слабое основание и его соль, образованную сильной кислотой (например, гидроокись аммония NH4OH и хлористый аммоний NH4CI). При разведении раствора или добавлении к нему некоторого количества кислоты или щелочи кислотно-основная пара способна соответственно быть донором либо акцептором водородных ионов, поддерживая т.о. величину водородного показателя рН на относительно постоянном уровне.

Значение рН кислотно-основного буферного раствора зависит от концентраций компонентов буферной смеси, находящихся в химическом равновесии, и мало меняется при концентрировании и разбавлении раствора, введении относительно небольших количеств веществ, взаимодействующих с одним из компонентов буферного раствора. Наиб. распространены водные кислотно-основные буферные растворы. Они содержат слабую кислоту НА и сопряженное с ней основание А -, напр. СН3СООН и СН3СОО-, NH4+ и NH3. В таких системах осуществляется равновесие:

По данным о константе диссоциации кислоты Ка = — [Н3О+] [А- ] /[НА] определяют значение рН раствора:  

где [НА] и [А-] -равновесные концентрации соответствующей кислоты и основания, рКа= —lgКа. Это значение рН остается практически постоянным, т.к. при добавлении небольших количеств сильных кислот или оснований ионы Н3О+ или ОН- связываются основанием (кислотой) с образованием сопряженной кислоты (основания).

Тканевая жидкость, кровь, моча и другие биологические жидкости являются буферными растворами. Благодаря действию их буферных систем поддерживается относительное постоянство водородного показателя внутренней среды, обеспечивающее полноценность метаболических процессов. Наиболее важной буферной системой является бикарбонатная система крови. Концентрация в крови бикарбонатов служит одним из основных показателей кислотно-щелочного состояния организма. Этот показатель позволяет установить характер нарушения кислотно-щелочного равновесия  при ряде патологических процессов.

В лабораторной практике буферные растворы используют в тех случаях, когда то или иное исследование может быть проведено лишь при постоянном значении рН (например, определение активности ферментов, изучение кинетики ферментативных реакций, электрофоретическое разделение белковых смесей и др.) и в качестве стандартов при определении рН различных растворов, в т.ч. биологических жидкостей.

Буферные растворы готовят обычно путем растворения в воде взятых в соответствующих пропорциях слабой кислоты и ее соли, образованной щелочным металлом, частичной нейтрализации слабой кислоты сильной щелочью или слабого основания сильной кислотой, растворения смеси солей многоосновной кислоты.

 

Буферная емкость

 

Способность буферных систем противодействовать резкому изменению рН при добавлении к ним сильной кислоты или основания является ограниченной. Буферная смесь поддерживает рН постоянным только при условии, что количество вносимых в раствор сильной кислоты или щелочи не превышает определенной величины. В противном случае наблюдается резкое изменение рН, т.е. буферное действие раствора прекращается.

Это связано с тем, что в результате протекающей реакции изменяется соотношение молярных концентраций компонентов буферной системы: С кислоты/С соли или С основания/С соли.

При этом концентрация компонента, реагирующего с добавленной кислотой или щелочью, уменьшается, а концентрация второго компонента возрастает, т.к. он дополнительно образуется в ходе реакции.

Количественно буферное действие раствора характеризуется с помощью буферной емкости (В). При этом различают буферную емкость по кислоте (Вк.) и буферную емкость по основанию или щелочи (Во.).

Буферной емкостью по кислоте является то количество химического эквивалента сильной кислоты, которое нужно добавить к 1 литру (1 дм3) буферной системы, чтобы уменьшить её рН на единицу.

Буферной емкостью по основанию является то количество химического эквивалента сильного основания (щелочи), которое нужно добавить к 1 литру (1 дм3) буферной системы, чтобы вызвать увеличение ее рН на единицу.

Величина буферной емкости зависит от концентраций компонентов буферной системы и от их соотношения.

Чем более концентрированным является буферный раствор, тем выше его буферная емкость, т.к. в этом случае добавление небольших количеств сильной кислоты или щелочи не вызовет существенного изменения концентраций его компонентов, а значит и их соотношения.

Из буферных растворов с одинаковым суммарным содержанием химического количества их компонентов наибольшей емкостью будут обладать те, которые составлены из равного числа молей слабой кислоты и её соли или слабого основания и его соли (рис. 35). В таких растворах молярные концентрации компонентов будут одинаковые, а значит соотношение Скислоты/Ссоли = 1 и Соснования/ Ссоли.= 1.

Среди всех буферных систем организма наибольшей буферной емкостью обладает бикарбонатная кислотно-основная буферная система крови.

 

Уравнение Гендерсона- Хассельбаха.

Вычисление рН и рОН буферных систем

 

Каждая из буферных систем характеризуется определенной присущей ей концентрацией ионов Н+(активной кислотностью), которую система и стремится сохранить на неизменном уровне при добавлении к ней сильной кислоты либо щелочи.

Установим на примере ацетатного буфера факторы, влияющие на величину активной кислотности.

В растворе данной буферной системы происходят следующие реакции электролитической диссоциации:

CH3COOH D CH3COO– + H+

CH3COONa → CH3COO– + Na+

(Гидролиз соли, т.е. взаимодействие ацетат-ионов  с Н2О

CH3COO– + HOH D CH3COOH + OH–

учитывать не будем.)

Таким образом, ионы Н+ образуются только за счет диссоциации некоторого числа молекул уксусной кислоты. Этот процесс является обратимым и количественно характеризуется константой кислотности Kа:

где  (или  ),  и  равновесные молярные концентрации ионов Н+, СН3СОО– и непродиссоциированных молекул кислоты.

Из данного уравнения можно выразить  (активную кислотность буферной системы):

Кроме уксусной кислоты, в растворе присутствует ее соль CH3COONa. Она является сильным электролитом и полностью распадается на ионы. В результате этого концентрация анионов СН3СОО– резко возрастает, и согласно принципу Ле-Шателье, равновесие реакции диссоциации уксусной кислоты смещается влево, т.е. в сторону образования ее молекул. Причем диссоциация уксусной кислоты в присутствии собственной соли может быть настолько подавленной, что равновесную концентрацию ее нераспавшихся молекул в растворе можно считать равной концентрации СН3СООН, а равновесную концентрацию ацетат-ионов – исходной концентрации соли. В связи с этим выражение, по которому рассчитывается концентрация ионов Н+, можно записать иначе:

где Скислоты и Ссоли – исходные концентрации компонентов буферной системы.

Прологорифмируем полученное уравнение (с учетом того, что логарифм произведения равен сумме логарифмов сомножителей):

и умножим обе его части на –1:

Как было показано нами ранее 

 

, a 

В связи с этим запишем уравнение для расчета концентрации ионов Н+ в окончательном виде: 

 

Данное выражение называется иначе уравнением Гендерсона-Хассельбаха. Его можно использовать для вычисления рН любой кислотной буферной системы. Например, для фосфатного буфера уравнение Гендерсона-Хассельбаха запишется следующим образом:

(в данной системе роль слабой  кислоты играет анион Н2РО4–, то  .

В водных растворах рН и рОН являются сопряженными величинами. Их сумма всегда равна 14, т.е.:

рН + рОН = 14

Зная концентрацию ионов Н+ или рН, можно вычислить концентрацию гидроксильных ионов или рОН.

Уравнения Гендерсона-Хассельбаха для расчета рОН и рН в оснóвных буферных системах выглядят следующим образом:

где pKb = –lg Kb (основания), Соснования и Ссоли – исходные молярные концентрации компонентов данных буферных систем, т.е. слабого основания и его соли с сильной кислотой.

 

Основные показатели кислотно-основного равновесия крови

 

Огромное значение для организма имеет такая гомеостатическая постоянная, как активная реакция крови, которая обеспечивает выполнение окислительно-восстановительных процессов, деятельность ферментов, а также направление и интенсивность всевозможных видов обмена.

Неразрывно с понятием кислотно-основного состояния связаны кислотность и щелочность раствора. Причем будет ли раствор щелочным или кислотным, напрямую зависит от содержащихся в нем свободных ионов водорода.

Что касается крови, то активная реакция характеризуется отрицательным десятичным логарифмом концентрации водородных ионов, или водородным показателем (pH).

Так, разработана шкала pH от 0 до 14, в которой в зависимости от содержания ионов водорода среду делят на кислую при pH от 0 до 7, щелочную – от 7 до 14, а также нейтральную, если pH равняется 7.

Что же обеспечивает постоянство кислотно-основного состояния?!

Этому способствует целый ряд физико-химических (буферные системы) и физиологических (легкие, печень, почки и др.) механизмов компенсации.

Так, буферные системы – это растворы, которые обладают способностью достаточно стойко поддерживать постоянную концентрацию ионов водорода даже при условии разбавления, а также добавления кислот и щелочей.

Различают следующие буферные системы:

• Бикарбонатная буферная система (смесь H2CO3 и HCO3+), которая является самой мощной из систем и составляет 53 % буферной емкости крови.

• Гемоглобин-оксигемоглобин буферная система – 35 %.

• Белковая буферная система – 7 %.

• Фосфатная – 5 %.

Теперь пришло время узнать, какое влияние на поддержание кислотно-основного состояния оказывают внутренние органы человека.

Например, большой вклад в этот жизненно необходимый процесс вносят легкие. А все из-за того, что в сутки легкими выделяется из организма примерно 15 000 моль углекислого газа, что соответствует удалению из крови приблизительно такого же количества ионов водорода. Кроме того, одним из самых важных показателей кислотно-основного состояния и его дыхательной составляющей является напряжение углекислого газа в крови (РаСО2).

Респираторные сдвиги кислотно-основного состояния принимают активное участие в регуляции дыхания. Причем именно легочный механизм компенсации является очень чувствительным и быстрым. Так, посредством легких коррекция изменений pH происходит в течение 1–3 мин.

Следующим органом, участвующим в поддержании кислотно-основного равновесия, являются почки. С их помощью происходит связывание или выведение ионов водорода, а также возвращение в кровь ионов натрия и бикарбоната. Важной деталью является то, что почечные механизмы регуляции кислотно-основного равновесия имеют тесную связь с водно-солевым обменом. По сравнению же с легочной компенсацией развитие метаболической почечной компенсации происходит намного медленнее, т. е. за 6-12 часов.

Кроме легких и почек, постоянство кислотно-основного равновесия обеспечивается работой печени и желудочно-кишечного тракта. Так, печенью окисляются органические кислоты до образования продуктов, не имеющих кислого характера, а также вместе с желчью выводятся неорганические кислоты. Что касается желудочно-кишечного тракта, то значение в регуляции кислотно-основного равновесия имеют выделение кислого желудочного сока, а также щелочных кишечных и панкреатических соков.

Однако при определенных патологических состояниях не всегда механизмы регуляции кислотно-основного состояния способны поддерживать pH на постоянном уровне. Причем в зависимости от того, в какую сторону (кислую или щелочную) сдвинется pH, соответственно зависит развитие ацидоза или алкалоза.

С другой стороны, если исходить из причин, вызвавших смещение pH, выделяют дыхательные, или респираторные, и метаболические, или обменные, нарушения кислотно-основного состояния. При этом развивается, дыхательный ацидоз или дыхательный алкалоз, и соответственно – метаболический ацидоз или метаболический алкалоз.

Показатели кислотно-основного состояния

А как оценивается кислотно-основное состояние крови?

Ответ на самом деле прост. Для этого используется ряд показателей, среди которых необходимо особо выделить следующие:

• pH-основной показатель;

• показатель напряжения углекислого газа (PaCO2);

• буферные основания;

• стандартные бикарбонаты;

• истинные бикарбонаты.

Основным показателем кислотно-основного состояния, бесспорно, является показатель pH. Так, в норме pH крови имеет слабощелочную реакцию и равен 7,4 или может находиться в пределах 7,35-7,45, т. е. в зоне полной компенсации. При pH<7,35 говорят о сдвиге в кислую сторону и называют это состояние ацидозом. Если pH>7,45, это указывает на сдвиг в щелочную сторону и называется алкалозом.

Ацидоз, как и алкалоз, бывает трех видов:

• компенсированный (ацидоз при pH 7,35-7,4, алкалоз при pH 7,4–7,45);

• субкомпенсированный (ацидоз при pH 7,25-7,35, алкалоз при pH 7,45-7,55);

• декомпенсированный (ацидоз при pH<7,25, алкалоз при pH>7,55).

Важно знать, что сдвиг pH в обе стороны более чем на 0,4, т. е. когда pH<7 или >7,8, является несовместимым с жизнью.

В норме напряжение в крови углекислого газа (PaCO2) колеблется в пределах от 35 до 45 мм рт. ст. Если же происходит снижение или повышение этого показателя, то это свидетельствует о имеющихся у человека респираторных нарушениях.

Недостаточная вентиляция легких, которая приводит к повышению парциального давления CO2 в альвеолярном воздухе (альвеолярная гиперкапния), а также к росту PaCO2(артериальная гиперкапния), вызывает развитие респираторного ацидоза, соответственно при гипервентиляции и артериальной гипокапнии развивается респираторный алкалоз.

Еще одним показателем кислотно-основного состояния является показатель буферных оснований, который отражает общее количество всех анионов крови, и по его величине судят о метаболических нарушениях кислотно-основного состояния. Особенностью же буферных оснований является то, что они не зависят от напряжения CO2. У здорового человека их содержание находится на уровне 48+2 ммоль/л.

Повышение содержания буферных оснований свидетельствует о наличии метаболического алкалоза, а снижение – о наличии метаболического ацидоза.

Что касается стандартных и истинных бикарбонатов, то они прекрасно характеризуют бикарбонатную буферную систему крови.

Так, стандартные бикарбонаты представляют собой концентрацию бикарбонатов в крови при стандартных условиях, т. е. при рН = 7,40, РаCO2 = 40 мм рт. ст., t = 37 °C, SO2 = 100 %.

За истинные бикарбонаты принимают их концентрацию в крови при соответствующих конкретных условиях в крови.

У здорового человека значения показателей как стандартных, так и истинных бикарбонатов совпадают и находятся на уровне 24+2 ммоль/л. При уменьшении развивается метаболический ацидоз, при увеличении – метаболический алкалоз.

Нарушения кислотно-основного состояния

Развитие метаболического ацидоза происходит при чрезмерном накоплении в крови нелетучих кислот. Наблюдаться же данный вид ацидоза может в следующих случаях:

• при гипоксии тканей;

• при почечной и печеночной недостаточности;

• при нарушениях микроциркуляции;

• при кетоацидозе, обусловленном развитием сахарного диабета;

• при шоке и других патологических состояниях.

Признаками метаболического ацидоза является снижение уровня как показателя pH, так и содержания буферных оснований, а также стандартных и истинных бикарбонатов.

К причинам развития метаболического алкалоза относят тяжелые нарушения обмена электролитов, избыточное потребление с пищей щелочных веществ, а также потерю кислого содержимого желудка, которое наблюдается при неукротимой рвоте. Что касается показателей кислотно-основного состояния, то наблюдается увеличение значения pH, стандартных и истинных бикарбонатов, а также буферных оснований.

При респираторных (дыхательных) нарушениях кислотно-основного состояния их непосредственной причиной служит неадекватная вентиляция.

Так, к причинам респираторного алкалоза относят произвольную и непроизвольную гипервентиляцию. В норме этот вид алкалоза может встречаться:

• при нахождении человека в условиях высокогорья;

• при беге на длинные дистанции;

• при психоэмоциональном возбуждении.

Кроме того, развитие респираторного алкалоза возможно при одышке больного с сердечной или легочной патологией, когда отсутствуют условия для задержки CO2 в альвеолах, а также при проведении искусственной вентиляции легких. В данном случае наблюдается рост показателя pH, снижение напряжения углекислого газа в артериальной крови и компенсаторное снижение буферных оснований и бикарбонатов.

Важно помнить, что при развитии ярко выраженной гипокапнии, когда PaCO2<20–25 мм рт. ст., и респираторного алкалоза возможно появление судорог и потери сознания.

В отличие от алкалоза, причиной развития респираторного ацидоза является гиповентиляция, следствием которой может быть угнетение дыхательного центра. При этом происходит рост как pH, так и увеличение напряжения углекислого газа в крови.

Если же происходит быстрое и значительное увеличение PaCO2, когда PaCO2>70мм рт. ст., то возникает вероятность развития гиперкапнической комы.

Важной деталью является то, что и гиперкапния, и респираторный ацидоз могут развиться у человека при его нахождении в среде с высоким содержанием углекислоты.

Когда же развитие дыхательного ацидоза принимает хронический характер, вместе с увеличением PaCO2 и уменьшением показателя pH происходит компенсаторное повышение содержания бикарбонатов и буферных оснований.

Кроме того, при наличии хронических заболеваний легких, помимо дыхательного, возможно развитие и метаболического ацидоза, т. е. возникновение так называемого смешанного ацидоза.

Необходимо также помнить, что во избежание диагностических ошибок при исследовании нарушений кислотно-основного состояния необходимо, кроме главных его составляющих, также проводить оценку клинической картины болезни и PaO2.

 

Буферные системы крови

 

Концентрация водородных ионов в крови, которая определяется как рН крови, является одним из параметров гомеостаза, колебания в норме возможны в очень узких пределах от 7,35 до 7,45. Стоит отметить, что смещение рН за указанные пределы приводит к развитию ацидоза (смещение в кислую сторону) или алколоза (в щелочную сторону). Организм способен сохранять жизнедеятельность, если рН крови не выходит за пределы 7,0-7,8. В отличие от крови, параметры кислотно-основного состояния для различных органов и тканей колеблются в более широких пределах. Например, рН желудочного сока составляет в норме 2,0, простаты – 4,5, а в остеобластах среда щелочная, и значение рН достигает отметки в 8,5.

Регуляция кислотно-основного состояния в крови осуществляется за счет специальных буферных систем, которые реагируют на изменение рН достаточно быстро, посредством дыхательной системы и почек, а также пищеварительного канала и кожи, через которые выводятся кислые и щелочные продукты. Для изменения рН крови легким потребуется около 1-3 минут (за счет уменьшения или увеличения частоты дыхания и выведения углекислого газа), а почкам – около 10-20 часов.

Таким образом, буферные системы крови являются наиболее быстро реагирующим механизмом регуляции рН крови. К буферным системам относят белки плазмы крови, гемоглобиновый, бикарбонатный и фосфатный буферы.

Белковый буфер. Способность белков плазмы крови играть роль буфера определяется так называемыми амфотерными свойствами, т.е. способностью проявлять свойства кислот или оснований в зависимости от среды. В кислой среде белок проявляется свойства основания, СООН группа диссоциирует, ионы водорода присоединяются к NH2-группе, при этом они заряжаются отрицательно, и белки проявляют основные свойства. В щелочной среде диссоциирует только карбоксильная группа, а освободившиеся ионы водорода связываются с ОН– остатками и тем самым стабилизируют кислотно-основное состояние.

Гемоглобиновый буфер является одним из самых мощных, в его состав входит свободный, восстановленный, окисленный гемоглобин, а также карбоксигемоглобин и калиевая соль гемоглобина. Считается, что на этот буфер приходится порядка 75% всех буферных свойств крови, а в его основе лежит способность глобиновой части молекулы изменять свою конформацию и, как следствие, кислотные свойства при переходе из одной формы в другую. Так, восстановленный гемоглобин по сравнению с угольной кислотой является более слабой кислотой, а окисленный – более сильной кислотой. Поэтому, когда в крови повышается содержание угольной кислоты, и рН смещается в кислую сторону, происходит присоединение иона водорода к свободному гемоглобину, при этом образуется восстановленный гемоглобин. В капиллярах легких из крови удаляется углекислый газ, рН смещается в щелочную сторону, и окисленный гемоглобин становится донором протона, что стабилизирует рН, препятствуя его смещению в щелочную сторону.

Бикарбонатный буфер считается следующим по важности после гемоглобинового, он также связан с актом дыхания. Так, в крови всегда имеется довольно большое количество слабой угольной кислоты и гидрокарбоната натрия, поэтому поступление в кровь более сильных кислот приводит к тому, что они взаимодействуют с гидрокарбонатом натрия с образованием соответствующей соли и угольной кислоты. Последняя быстро расщепляется ферментом карбоангидразой на воду и углекислый газ, которые выводятся из организма.

Поступление в кровоток щелочи приводит к тому, что образуются карбонаты – соли угольной кислоты и вода. Дефицит угольной кислоты, который возникает при этом, может достаточно быстро компенсироваться за счет уменьшения выделения углекислого газа легкими.

Состояние бикарбонатной буферной системы оценивается по равновесию следующей реакции:

H2O + CO2 = H2CO3 = H+ + HCO3 

В клинической практике для оценки состояния бикарбонатной буферной системы используют следующие показатели:

1. Стандартные бикарбонаты. Это концентрация в крови аниона  гидрокарбоната при стандартных  условиях (парциальное давление  углекислого газа 40 мм.рт.ст., полное насыщение крови кислородом, равновесие с газовой смесью при температуре в 38 градусов по Цельсию).

2. Актуальные бикарбонаты  – концентрация аниона гидрокарбоната  в крови при 38 градусах и реальных  значениях парциального давления  углекислого газа и рН.

3. Способность крови  связывать углекислый газ –  показатель, отражающий концентрацию  бикарбонатов в плазме. Раньше  активно определяли газометрическим  методом, на сегодняшний день  метод утратил свою значимость  ввиду развития электрохимических  методов.

4. Щелочной запас  – способность крови нейтрализовать  кислоты за счет щелочных соединений, определялся методом титрования, на сегодня метод утратил свое  практическое значение.

5. Парциальное давление  углекислого газа. Давление в  газе, который уравновешен при  температуре в 38 градусов с плазмой  артериальной крови. Зависит от  диффузии углекислого газа через  альвеолярную мембрану и дыхания, а потому может нарушаться  при изменении проницаемости  альвеолярной мембраны или нарушении  вентиляции легких.

Фосфатная буферная система. В состав этой системы входит гидрофосфатнатрия и дигидрофосфатнатрия. Гидрофосфат обладает щелочными свойствами, тогда как дигидрофосфат проявляет свойства слабой кислоты. При поступлении в кровь кислоты, она реагирует со слабым основанием – гидрофосфатом, свободные ионы водорода при этом связываются с образованием дигидрофосфата, а рН крови стабилизируется (не происходит смещения в кислую сторону). Если в кровь поступают основания, то их гидроксид анионы связываются со свободными ионами водорода, источником которых является слабая кислота – дигидрофосфат.