Сомаклональная изменчивость как альтернатива мутагенезу

Министерство  сельского хозяйства РФ

Новосибирский Государственный

Аграрный  Университет

Кафедра селекции и генетики  
 

Реферат

 по дисциплине «Биотехнология» 

Сомаклональная изменчивость как альтернатива мутагенезу 
 

Выполнила: студентка 

144 (1402) группы

 агротехнологического 

факультета

Налимова Дарья

Проверила: доцент

Кондратьева И. В. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Новосибирск 2010 г. 

    Содержание  

1. Введение………………………………………………………….3.

2. Генетические  основы применения культуры клеток растений в селекционных целях. Сомаклональная изменчивость (вариабельность)…………………………………………………..4.
3. Клеточная селекция……………………………………………….9.
4. Мутагенез и клеточная селекция………………………….…..….10.
5. Заключение…………………………………………………….…15.
6. Список использованной литературы…………………………...16.

Введение  

    С дальнейшим ростом численности человечества возросла и потребность во многих особенно ценных на данном периоде  развития видов и сортов растений. Природа не успевала восполнять их ресурсы, что побудило человека к необходимости выведения новых более продуктивных сортов, тем самым подняв его на новую ступень развития. Другие растения не так часто требовались человеку или были представлены в природе в изобилии, и поэтому он предпочитал использовать их в естественном дикорастущем виде.

      В настоящее время селекция новых сортов достигла новой ступени развития. Это получение растений-регенерантов из каллусных тканей на питательных средах, генная инженерия, различные методики клеточной селекции. Например, значительный интерес представляет вопрос об использовании сомаклонов.

    Сомаклональные  варианты имеют практическое применение в сельскохозяйственной практике в  силу появления форм, отличающихся от родительских по различным биохимическим, качественным и количественным признакам, а также цитогенетическим характеристикам.

    Например, получены сомаклоны картофеля сорта  Зарево, отличающиеся высокой урожайностью, повышенной устойчивостью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях белка и крахмала.

    В настоящее время метод культуры тканей начал широко использоваться в селекции  не только кормовых и  технических культур, но и декоративных и лекарственных растений. Примером тому может служить новый сорт пеларгонии Velvet Rose, полученный через каллусную культуру.

    Таким образом, полученные положительные  результаты свидетельствуют о необходимости  более эффективного внедрения различных  приемов получения сомаклональных вариантов в практику селекционной работы, и наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий по отдельным недостающим признакам.

1. Генетические основы применения культуры клеток растений в селекционных целях

    1.1 Сомаклональная изменчивость (вариабельность)  

    Сомаклональная изменчивость  - размах колебаний в различии признаков у растений, регенерированных из культивируемых  соматических клеток [4].

Рисунок 1. Лаборатория с растениями - регенератами

     С разработкой техники получения  растений-регенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений. Такое разнообразие среди клеточных линий и растений-регенерантов получило название «сомаклоны», хотя еще в 70—80-е годы нашего столетия было принято называть растения, регенерировавшие из каллусной ткани, «калликлонами», а из протопластов — «протоклонами» [4].

       Клетки в культуре in vitro отличаются по морфологии, по биохимическим свойствам, по физиологическому состоянию и генетически. Разнообразие (вариабельность) среди клеточных линий или растений-регенерантов называют сомаклональной вариабельностью. Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости пока мало изучены. Однако четко можно выделить зависимость возникновения сомаклональных вариантов, прежде всего, от генетической гетерогенности соматических клеток исходного экспланта, генетической и эпигенетической изменчивости, индуцируемой условиями культивирования in vitro , а также от генотипа и исходного экспланта [4,5].

    Полиморфизм культивируемых клеток можно объяснить  видовыми и возрастными особенностями, уровнем плоидности, влиянием состава  питательной среды и условий  культивирования, отсутствием коррелятивных  связей. Последний фактор, ведущий к нарушению жесткой регуляции, существовавшей в целом растении, видимо, является основной причиной спонтанной изменчивости клеток in vitro .

Рисунок 2. Изменение формы листьев у сомаклональных вариантов картофеля сорта Смена

Любой фрагмент растения представляет собой мозаику  различных тканей, и в зависимости  от того, какая ткань  даст начало каллусу, возникшие даже из одинаковых эксплантов каллусы будут гетерогенными и отличающимися друг от друга. Одинаковых, в полном смысле, эксплантов в природе быть не может, следовательно, неоднородность исходного материала (видовая, возрастная, физиологическая) предопределяет разнокачественность клеток в культуре [4,5,7].

    Физиологическая гетерогенность состоит в том, что клетки в популяции находятся в разном физиологическом состоянии, т. е. делятся, растут, стареют, погибают. Такая культура называется асинхронной.

    Заставить популяцию клеток высших растений проходить  фазы клеточного цикла одновременно, т. е. синхронизировать их почти невозможно. Потому что та часть клеток, которая способна в данный момент к делению, составляет 2—4%. Неблагоприятные условия (низкая температура, исключение важных компонентов питания), задерживающие деление, в какой-то степени способствуют накоплению числа клеток, готовых к делению. Более эффективны некоторые химические вещества, блокирующие определенные стадии подготовки к делению. В лучших случаях синхронизация может быть достигнута у 10—30% клеток, но при последующих делениях популяция опять быстро утрачивает синхронность.

Следует подчеркнуть, что физиологическая  вариабельность клеток в суспензионной  культуре меньше по сравнению с культурой  каллусной ткани на агаре, что связано с более однородными условиями питания, аэрации и удаления токсических метаболитов из клеточного окружения в жидкой перемешиваемой среде [4,7].

Рисунок 3. Гаплопаппус.

То, что условия выращивания  играют важную роль в формировании цитогенетической гетерогенности, хорошо видно из опытов с  тканью гаплопаппуса. В лаборатории Р.Г. Бутенко в течение двух лет культивировались меристематические клетки этого растения, пассажи проводились раз в месяц. В итоге исходные диплоидные клетки на 95% приобрели другие уровни плоидности. Шведский исследователь Т. Эриксон, работая с этой же тканью, пересаживал ее на свежую питательную среду через каждые 2 дня. При этом штамм сохранил стабильную диплоидную характеристику. Однако способ выращивания не может полностью гарантировать генетическую стабильность в популяции клеток, так как генетической гетерогенностью может обладать сам исходный материал. У многих растений дифференцированные ткани имеют клетки разной плоидности. Специализированные клетки, например клетки зеленой ассимилирующей паренхимы листа, запасающих тканей мясистых корней, клубней, зачастую являются полиплоидными [4,6].

     Как было отмечено, клетки in vitro становятся разнокачественными также благодаря эпигенетическим изменениям, т е. изменениям в программе считки генов или потенции к их активации. Эти изменения генной активности являются наследуемыми.

     К ненаследуемым изменениям у клеток в культуре относятся модификационные изменения, которые в большинстве носят адаптивный, приспособительный характер. Эти изменения не затрагивают генетических структур клетки, они соответствуют физиологической адаптации, при которой границы изменений не превышают норму реакции, обусловленной генотипом.

     Гетерогенность  клеток in vitro возрастает с увеличением продолжительности их культивирования. Различные типы морфогенеза — соматический эмбриогенез или органогенез - также могут по-разному сказываться на генетических изменениях и, соответственно, на фенотипе растений. Экспериментально установлено, что при соматическом эмбриогенезе время прохождения цикла клетка — растение значительно короче, чем при органогенезе, поэтому степень сходства получаемого материала и исходного родительского генотипа может быть значительно выше.

Наиболее  подробно исследована хромосомная  изменчивость клеток in vitro. Даже клетки одной и той же ткани, выращиваемые в одном сосуде, могут значительно различаться между собой по хромосомным наборам (диплоидные, полиплоидные, анеуплоидные). Причины генетической изменчивости многообразны: 1) нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения, т. е. отсутствие организменного контроля; 2) действие компонентов среды; 3) влияние продуктов метаболизма, накапливающихся в среде; 4) гетерогенность исходного материала и селекция клеток определенного типа. 

    Хромосомная изменчивость является результатом  нарушений митоза, называемых эндомитозом  и эндоредупликацией [4,5]. При эндомитозе происходит спирализация хромосом и начинается митоз, но нарушается веретено деления, сохраняется оболочка ядра, хромосомы не расходятся и деспирализуются внутри ядерной оболочки. Это приводит к возрастанию числа хромосом, увеличению размеров ядра и клеток. Эндоредупликация не сопровождается образованием хромосом и делением ядра, хотя содержание ДНК в ядре тоже увеличивается. К образованию полиплоидных и анеуплоидных клеток также приводят нарушения в митозе, связанные с неправильным распределением хромосом. 

    Дифференцированные  клетки в нормальном растении могут  иметь разную степень плоидности, но для отдельных видов характерно наличие только диплоидных клеток [4]. Однако в процессе онтогенеза могут возникать клетки с разной плоидностью. Например, экспериментально доказано, что в меристемных тканях, наряду с фактором видового постоянства числа хромосом, почти у 80% покрытосеменных растений в процессе дифференцировки в соматических клетках может происходить эндоредупликация хромосом и формирование тканей различного уровня плоидности. Для вегетативно размножаемых и апомиктичных растений характерно образование с высокой частотой анеуплоидных клеток. Усиление хромосомных перестроек, приводящих к появлению химерности и миксоплоидии у растений, наблюдается при изменении условий произрастания, особенно при их резком ухудшении: засоление почв, повышенные или пониженные температуры, применение гербицидов или пестицидов, минеральных удобрений в повышенных дозах и др. Эти и другие часто встречающиеся в практике факторы могут приводить к физиологическим нарушениям, связанным, в первую очередь, с появлением аномальных митозов и формированием клеток с числом хромосом, отличающимся от такового в материнской ткани.

    Высокая степень разнообразия сомаклонов зависит  от исходного генотипа, природы и  стадии развития экспланта. Например, у различных злаков степень изменчивости среди сомаклонов может значительно различаться: у пшеницы (2n=6х=42) из 192 исследованных растений-регенерантов 29% были анеуплоидами, у гексаплоидного овса (2n=6х=42) выявлены цитогенетические изменения с такой же частотой, а для кукурузы частота возникновения анеуплоидных растений не превышала 2—3%. Образование полиплоидных и анеуплоидных растений может наблюдаться и у других видов, например, на картофеле. Причем частота появления новых вариантов у диких видов значительно ниже, чем у дигаплоидных линий культивируемого картофеля [4].

     Тип исходного экспланта также влияет на появление сомаклональных вариантов, отличающихся количественными и качественными признаками. Для картофеля, например, аномальные растения получены в 12% случаев при использовании в качестве первичного экспланта мезофильных тканей листа, а в случае использования лепестков или оси соцветий частота формирования растений с фенотипическими отклонениями от нормы составила 50%. 

    Клеточная селекция 

    Клетки  различного уровня плоидности различаются  по скорости деления и роста, по устойчивости к неблагоприятным воздействиям, начинают конкурировать, и одни из них  начинают преобладать. Такой процесс  возрастающего доминирования в  популяции клеток определенного  типа называется клеточной селекцией. Доминирование может быть вызвано  преимущественной пролиферацией одних  клеток или успешной элиминацией (удалением) других. Такую селекцию правильнее называть автоселекцией, потому что она протекает спонтанно, без специального воздействия какими-либо стрессовыми факторами. В процессе автоселекции формируется наиболее приспособленный к данным условиям кариотип. Вероятно, клетки приспосабливаются к новым условиям существования путем отбора более жизнеспособных полиплоидных клеток. Интересно, что изменение условий выращивания меняет направление отбора. Показано, например, что высокие концентрации 2,4-Д и кинетина увеличивают возможность полиплоидизации. 

Мутагенез и клеточная селекция 

     Мутации могут быть полезными, вредными и  нейтральными для организма. Большинство  из них — вредные, даже летальные, например многие хлорофильные мутации.

     Мутационная изменчивость — это процесс, закономерно  протекающий в природе. Отдельные  естественные мутации сыграли выдающуюся роль в создании ценных современных  сортов и гибридов растений. Так, возникшие  в результате естественного мутагенеза гены карликовости японского сорта  озимой пшеницы норин-10 переданы сотням короткостебельных сортов интенсивного типа, которые занимают в мире огромные площади [6].

     Выявление карликового мутанта риса стало  поворотным пунктом в истории  селекции этой культуры. Мутации кукурузы, обеспечивающие улучшение качества белка в зерне за счет увеличения доли незаменимых аминокислот лизина и метионина, также относятся  к естественным. Они включены в популяции кукурузы всего мира.

     Вследствие  низкой частоты естественного  мутирования и трудностей обнаружения измененных форм этот метод не может быть положен в основу современной плановой селекционной работы [6,7].

     Все более важным в  селекции растений становится метод искусственного получения жизнеспособных полезных мутаций. Известно много примеров создания практически ценных индуцированных мутаций путем воздействия на организмы различными физическими и химическими факторами. При этом могут возникать мутации разных типов, селекционная ценность которых неодинакова.

     В зависимости от характера изменения  наследственных структур мутации делятся  на два основных типа: генные, или точковые, и хромосомные перестройки. Первые обусловлены изменениями молекулярной структуры мутировавшего гена, т. е. нарушением специфической последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК. Второй тип мутаций характеризуется разрывами и различными последующими структурными перестройками хромосом. Любое из этих изменений обычно сопровождается проявлением какого-либо нового признака или свойства.

     Метод искусственного получения жизнеспособных полезных мутаций становится все  более важным в селекции растений. Уже разработано много приемов  индуцирования мутаций. В основе их лежит воздействие на организмы различными физическими и химическими факторами, называемыми мутагенами. Из них используют главным образом изменения различного типа и некоторые химические вещества.

     Действуя  этими факторами на растения, можно  резко повысить их мутационную изменчивость и отобрать среди многих вредных  и бесполезных мутантов единичные  ценные образцы и использовать их при выведении новых сортов.

     С помощью мутагенеза можно решать специальные селекционные задачи. Среди  мутантов довольно часто можно выделить растения с повышенной прочностью стебля. Эта мутация была обнаружена у  ячменя, пшеницы, овса, риса.

     Мутагенные  факторы вызывают широкую изменчивость растений по высоте стебля, причем амплитуда  этой изменчивости порой очень высокая.

     Отклонения  по высоте стебля были получены в опытах с ячменем, пшеницей, овсом, кукурузой  и другими культурами. Этот тип  мутаций можно использовать для  решения различных задач селекции, начиная с создания устойчивых к  полеганию и имеющих высокий  выход зерна сортов зерновых культур и кончая выведением мощных высокорослых форм, используемых в кормовых целях.

     Большую роль сыграли мутации для получения  карликовых и полукарликовых форм различных культур. Они отличаются высокой урожайностью, отзывчивостью на внесение удобрений [2,6].

     Несмотря  на то, что существует генетическая нестабильность культур изолированных  тканей и клеток растений, она не может обеспечить потребности селекционеров  в генетическом разнообразии.

     В связи с этим для ускорения  селекционного процесса в культуре клеток используются химические и физические мутагены. Обработка ткани раувольфии змеиной азотистым ипритом в  концентрации 2,5 * 10-3 М привела к  повышению уровня аберраций хромосом в первом пассаже до 32%, вызвала  сдвиг популяции в сторону  увеличения триплоидов. В результате удалось получить штамм с более высокой биосинтетической активностью по сравнению с исходной тканью.

     Гетерогенность  культивируемых клеток обусловлена генетической, эпигенетической и модификационной изменчивостью. Генетические, или мутационные, изменения приводят к изменению генотипа, которое может быть унаследовано. Мутации (изменения количества или структуры ДНК) происходят на генном, хромосомном и геномном уровнях [1,2,3]. 

    Генная, или точечная, мутация означает изменение  структуры ДНК в одном локусе. Генные мутации приводят к сильным  или слабым изменениям морфологических, биохимических и физиологических  свойств клетки. Мутации, возникающие в результате изменения макроструктуры хромосом, называются хромосомными мутациями, или хромосомными аберрациями (перестройками). Структурные перестройки хромосом возникают в результате инверсии, делеции, дупликации, транслокации и транспозиции. Геномные мутации связаны с изменением числа хромосом в ядре, т. е. с изменениями в кариотипе.

     Спонтанный  и индуцированный мутагенез в  культуре клеток, тканей и протопластов  позволяет получать растения, представляющие практический интерес для селекционеров. Важное практическое значение имеет  создание форм растений, устойчивых к  неблагоприятному действию факторов внешней  среды, таких как низкие температуры, засоление почв, загрязнение природной  среды токсическими веществами, поражение  вредителями и возбудителями  болезней. Эти факторы могут быть использованы в качестве селективного фона в процессе клеточной селекции. Клетки, сохранившие при этом жизнеспособность, могут быть регенерированы в целые  растения.

     Принципиальной  разницы в результатах клеточной  селекции при спонтанном и индуцированном мутагенезе нет. Для повышения частоты  мутаций в соматических клетках  обычно используют такие мутагены, как нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина, метилметансульфонат. Реже применяют облучение ультрафиолетом, γ-квантами 60Со и нейтронами [3]. 

    В качестве селективных агентов используют антибиотики, ингибиторы синтеза нуклеиновых  кислот, аналоги пуриновых и пиримидиновых  оснований, фито- и патотоксины, агенты, вызывающие солевой и водный стресс, аналоги аминокислот и т.д. 

    Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:

• прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный искомый мутантный тип клеток;
• непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений;

• тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;

• визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.).

       Из  перечисленных выше приемов клеточной  селекции прямая селекция является наиболее распространенным методом и используется главным образом для выделения  растений-регенерантов, устойчивых, например, к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другим антиметаболитам [2,3]. 

Заключение 

    Мутации являются первичными изменениями, на которых  строятся эволюция и селекция. Естественное проявление мутаций - это процесс, постоянно  идущий у всех организмов. В его  основе лежат изменения в химии  генов, различные структурные преобразования в хромосомах, изменения в числе  хромосом.

    Мутационная изменчивость лежит в основе всякого  исходного материала для селекции, ибо исходное, первичное наследственное разнообразие возникает только на основе мутаций. Возможность управления процессом  мутаций приводит к самым серьезным  изменениям во всей проблеме исходного  материала для селекции. Но естественные мутации встречаются довольно редко и трудно определяются, поэтому они играют незначительную роль в селекции.

    Управление  процессом мутаций может осуществляться разными путями. С одной стороны, резкое усиление общих процессов  изменчивости приводит к получению  в большом количестве максимального  разнообразия генов и хромосом. С  другой стороны, важнейшее значение имеет использование таких факторов, которые обладают способностью вызывать специфическое мутирование.

    Сомаклональная изменчивость в культуре изолированных клеток является альтернативой мутагенезу, т.к. с помощью нее можно отбирать новые сорта растений, причем процесс значительно сократится по времени (т.к обнаружить мутации, особенно микромутации) бывает довольно сложно – необходим целый ряд научных опытов.

    Добавляя  же в питательные среды  вещества, «имитирующие» неблагоприятные условия окружающей среды, можно наблюдать за реакцией клеток каллусных тканей, получая растения, устойчивые к данным условиям. Добавляя в питательную среду мутаген, можно наблюдать за происходящими изменениями клеток, что представляет собой научный интерес. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  использованной литературы 

1. Гуляев Г.В. Гужов Ю.Л. селекция и семеноводство полевых культур. М.: Агропромиздат, 1987.

2. Майо О. Теоретические основы селекции растений. М.: Колос, 1984.

3. Химический мутагенез и задачи сельскохозяйственного производства. М.: Наука, 1993.

4. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология. М.: Высшая школа, 1998.

5. Щербаков В. К. Мутации в эволюции и селекции растений. М.: Колос, 1992.

6. http://www.bio-log.info/?p=316

7. http://www.biotechnolog.ru