Современные методы оценки иммунного статуса животных, их характеристика, особенности

Реферат на тему:

«Современные методы оценки иммунного статуса животных, их характеристика, особенности»

Содержание:

Введение……………………………………………………………………………………..3

1. Оценка иммунного статуса при иммунодефицитах…………………………………..…3
2. Принципы иммунофенотипирования лимфоцитов……………………………………..8
1. Особенности иммунофенотипирования лимфоцитов методами лазерной проточной цитометрии………………………………………………………………………8
2. Фенотипирование лимфоцитов с частицами, покрытыми моноклональными антителами……………………………………………………………………………...10
3. Иммунофенотипирование лимфоцитов иммуноферментным методом………....11
4. Иммуномагнитное выделение лимфоцитов как метод их фенотипирования…...11
5. Лимфоцитотоксический тест……………………………………………………….12
6. Характеристика связывания липополисахаридов бактерий лейкоцитами для оценки иммунного статуса……………………………………………………….....12
7. Особенности фенотипа лимфоцитов в норме и при заболеваниях………………14
8. Иммунодиагностика патологии и аномальный иммунный ответ……………….15
3. Оценка фагоцитоза и факторов врожденного иммунитета……………………………..16
4. Характеристика гуморальных факторов естественного иммунитета………………….17
5. Специфические показатели иммунного статуса и методы их определения…………..18
6. Значение показателей иммунного статуса (иммунограмм)……………………………..18

Заключение………………………………………………………………………………....21

Список использованной литературы……………………………………………..………22

Введение

Для того чтобы грамотно и квалифицированно диагностировать болезни врач-клиницист должен в достаточной степени знать сущность и значение основных иммунологических параметров организма в норме и патологии, определяемых современными методами.

Все современные показатели иммунного статуса можно разделить на 2 группы: антигенспецифические и антиген-неспецифические. Эти методы используют для оценки иммунного статуса, т.е. для характеристики состояния системы иммунитета (СИ).

Для оценки иммунного статуса при иммунодефицитах используются преимущественно антигеннеспецифические методы, а для диагностики инфекционных заболеваний и аллергии — антиген(аллерген)-специфические. Имеются четыре основных группы антиген-неспецифических методов:

1. Количественная характеристика  популяций и субпопуляций лимфоцитов и других лей- коцитов методами иммунофенотипирования клеток по рецепторам, CD-антигенам и другим маркерам.

2. Анализ функций клеток СИ (т.е. лейкоцитов) — пролиферативной, секреторной, цитокиновой, цитотоксической.

3. Определение медиаторов и цитокинов, продуцируемых клетками, в биологических жидкостях.

4. Определение гуморальных факторов  системы иммунитета (иммуноглобулинов, комплемента и др.)

1. Оценка иммунного статуса при иммунодефицитах

Количество методов, необходимых для полноценной характеристики состояния системы иммунитета, быстро увеличивается параллельно сложности их выполнения. Поэтому применение тестов I и даже II уровня для оценки иммунного статуса недостаточно эффективно. Концепция иммунологического образа болезни, обосновывающая существование для каждого заболевания и его вариантов своих измененных параметров, а также ориентировка на вид и вариант иммунного статуса, позволяет использовать небольшую группу главных диагностических показателей в каждом конкретном случае.

Лабораторная диагностика иммунодефицита (ИД) основывается на определенной последовательности, алгоритме действий, используемых при оценке иммунного статуса. Выявление ИД проводят в двух ситуациях:

1) при скрининге контингентов населения определенных регионов и рабочих коллективов на предмет наличия ИД;

2) при обследовании больных с целью уточнения предварительного диагноза. Для некоторых генетических обусловленных иммунодефицитов возможна пренатальная диагностика на основании ультразвукового обследования, хромосомного и биохимического анализов. Эпидемиологические скрининговые обследования различных групп населения и больных на наличие иммунодефицитов проводятся по следующей примерной схеме.

1. Анамнез и осмотр. Заполнение  анкет. Их анализ, формирование групп  риска с предвари- тельным диагнозом  по основным синдромам.

2. Клинико-лабораторное обследование. Основные показатели крови и биохимический статус (объем по показаниям). Предварительный диагноз иммунопатологии (вариант иммунного статуса). Рекомендации по набору тестов для оценки иммунного статуса.

3. Оценка иммунного статуса (наиболее распространенные тесты):

3.1. Общий анализ крови; определение соотношении нейтрофилы/лимфоциты/моноциты. СОЭ, СРБ, белковые фракции сыворотки крови (g-глобулины).

3.2. Определение количества Т-лимфоцитов (процент и абсолютное число) методами с моноклональными антителами (мАТ) антителами к CD2, CD3, CD4, CD8, CD25. Отношения CD4/CD8.

3.3. Определение В-лимфоцитов — CD19, CD21, CD22, CD72 или Ig+B.

3.4. Определение иммуноглобулинов  классов G, М, А, Е в сыворотке крови и sIgA слюне. Соотношения их количества (G/M/A).

3.5. Поглотительная активность нейтрофилов крови, частиц латекса и/или стафилококков, кандид (фагоцитарное число, фагоцитарный индекс); оценка киллинга кандид, бактерий.

3.6. НСТ-тест.

3.7. Определение циркулирующих иммунных  комплексов (методом ПЭГ-осаждения). Другие тесты по показаниям.

3.8. Антитела против стрептококка, дифтерийного токсина, гемофильной палочки, столбнячного токсоида, стафилококка, его токсина и вирусов (кори, гриппа).

3.9. Определение гемолитической  активности комплемента (С50) и/или  его компонентов.

3.10. Внутрикожные пробы (после забора крови!) с распространенными антигенами (туберкулин, стрептокиназа-стрептодерназа, антигены бактерий и грибов).

3.11. По показаниям—определение ферментов, отсутствующих при первичных иммунодефицитах (АДА, пуриннуклеозидфосфорилазы, альфафетопротеин при атаксии; гранулы лейкоцитов при гранулематозной болезни).

3.12. Оценка интерферонового статуса: концентрация интерферона в сыворотке крови; уровень интерферонa а и g в культуре лимфоцитов крови после стимуляции вирусом болезни Ньюкастла и стафилококковым энтеротоксином соответственно.

3.13. HLA-типирование (при необходимости).

3.14. Выявление цитокинов (по показаниям), в крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) и в клетках системы иммунитета (СИ) методами проточной цитометрии.

3.15. Определение общей g-цепи рецепторов цитокинов при тяжелом комбинированном иммунодефиците (ТКИД) методом проточной цитометрии.

Основные показатели лимфоидной системы

Среди различных методов ОИС центральным является определение фенотипа популяций и субпопуляций лимфоцитов.

Фенотипирование лимфоцитов, в настоящее время, проводиться с помощью моноклональных антител (мАТ) к СD-антигенам в реакции иммунной флуоресценции с учетом результатов на люминисцентном микроскопе или проточном цитометре. Метод проточной цитометрии является высокоточным и эффективным для анализа популяций и субпопуляций любых лейкоцитов, в том числе по двум и трем маркерам с помощью мАТ меченых флюоресцентными метками, однако не может широко использоваться в клинической практике из-за дороговизны анализов. Для анализа популяций и субпопуляций лимфоцитов помимо методов иммунофлюоресценции с суспензией лимфоцитов можно использовать разработанные нами стабильные иммунодиагностикумы на основе моноклональных антител, позволяющие фенотипировать лимфоциты в лейкосуспензии с регистрацией при обычной световой микроскопии.

1) Общее количество лимфоцитов при подсчете формулы крови. При рождении их содержание 20–28%. На 5–6 день жизни — 40–45%. В возрасте 2–3 мес. их относительное содержание достигает 55–65% и сохраняется на этом уровне до 5–6 лет, после чего происходит их снижение и в возрасте 6–15 лет и у взрослых, относи- тельное количество лимфоцитов составляет 22–30% от других лейкоцитов (около 1500– 2500 клеток в 1 мм3 ). Увеличение количества лимфоцитов (лимфоцитоз) характерно для ряда инфекционных заболеваний, а также рецидивирующих и хронических заболеваний ЛОР- органов и бронхолегочной системы.

2) Общие Т-лимфоциты (CD2+, CD3+- клетки), в настоящее время, определяются с помощью моноклональных антител к СD-антигенам (СD2, СD3). У новорожденных их содержание 40–48%. В раннем детском возрасте — 50–60%. У взрослых их уровень составляет 55–70% (1000–1500 клеток в 1 мм3 ). При заболеваниях инфекционной этиологии характерно снижение CD3+- Т-лимфоцитов до 40–50%, которое может сохранятся в периоде реконвалесценции и не требует иммунокорригирующей терапии. Если же CD3+- Т- лимфоцитов в крови ниже 40% или после бо- лезни их содержание в течении 1 месяца не приходит в норму — это расценивается как Т-клеточный иммунодефицит и необходимо проведение иммунокоррекции или иммунотерапии под контролем иммунограммы.

3) Уровень Т-хелперов и Т-цитотоксических определяется с помощью моноклональных антител к СD4 (Тx) и СD8 (Тц) антигенам. В норме CD4+ -Т-хелперов 36–45%, CD8+-Т-цитотоксических (супрессоров)-19– 28%, соотношение Тx/Тц (иммунорегуляторный индекс, ИРИ) = 1,5–1.8. При рецидивирующих инфекционных заболеваниях этот индекс снижается до 1,2–1,5, за счет содержания CD4+-Т-хелперов (26–32%). При аутоиммунных и аллергических заболеваниях индекс больше 2.0.

4) Для выявления ранней фазы  активации лимфоцитов определяют  рецептор для ИЛ-2 (CD25), поздней  — HLA-DR антигены и CD71 (рецептор для  трансферрина). В норме содержание CD25+- лимфоцитов 6–12%. При вирусных и бактериальных инфекциях их уровень может достигать 20–30% в остром периоде заболевания, преимущественно за счет Т-лимфоцитов. Длительное сохранение высокого уровня CD25+- лимфоцитов в ремиссию, после исчезно- вения клинических симптомов, указывающее на гиперактивацию, характерно для рецидивирующих и хронических заболеваний. HLA-DR антиген в норме экспрессируют В-лимфоциты и моноциты (12–18%). При активации он появляется на Т-лимфоцитах (3–6%).

5) Функциональные показатели Т-лимфоци- тов: пролиферативная активность  — реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с определением продукции ИЛ-2, других цитокинов. Способность к бласттрансформации, после стимуляции антигеном или митогеном (ФГА) отражает функциональную активность иммунокомпетентных клеток. Лучшим показателем активации Т-клеток в тестах in vitro является определение ИЛ-2, который выделяется активированными Т-лимфоцитами и в норме поддерживает пролонгированную пролиферацию. Реакцию подавления миг- рации лимфоцитов (РПМЛ) можно использовать для дифференциальной диагностики с хроническими заболеваниями, при которых появляются медиаторы ПЧЗТ, подавляющие миграцию лейкоцитов.

6) Общее количество В-лимфоцитов  можно определить с помощью  моноклональных антител к антигенам СD19 — СD22, СD72. Используют также антитела к иммуноглобулинам, которые находятся на поверхности В-лимфоцитов. В-лимфоциты составляют 20–30% всех лимфоцитов (600–800 клеток в 1 мм3 крови). Содержание CD22+-субпопуляции В-клеток составляет 14–20% у здоровых. Есть данные, что при острых респираторных заболеваниях их уровень в фазе реконвалесценции увеличивается до 26–28%.

7) Функциональные продукты В-лимфоцитов — иммуноглобулины классов G, М, A и их субклассы в сыворотке крови и различных биологических жидкостях определяют с помощью реакции преципитации по Манчини, а также иммуноферментным, нефелометрическим и турбидиметрическим методами. При иммунодефицитах уровень иммуноглобулинов снижается, а при стимуляции системы иммунитета и воспалении — повышается. Содержание иммуноглобулинов в норме представлено в табл.1.

 При рецидивирующих инфекционных  заболеваниях имеет важное значение  определение субклассов IgG. Их физиологическое соотношение: IgG1 — 60–66%, IgG2 — 20–30%, IgG3 — 5– 8%, IgG4 — 4–5% от общего иммуноглобулина G (табл. 2). Широкий ряд респираторной патологии, включающей рецидивирующие бронхи- ты, пневмонии, бронхоэктазы, синуситы и др., ассоциируется с наличием дефицита IgG1. Дефицит IgG3 , который может протекать совместно с дефицитом IgG1 , связывают с рецидивирующими обструктивными заболеваниями легких. Рецидивирующие респираторные инфекции бактериальной этиологии (гемофильная палочка, пневмококк) имеют связь с дефицитом IgG2 в ассоциации с дефицитом IgA.

2. Принципы иммунофенотипирования лимфоцитов

 Характеристика клеток СИ  по их фенотипу служит одним из основных подходов для изучения их роли в норме и патологии. Оптимальным является его оценка в совокупности с клеточными функциями, т.е. «фенотип+функция».

Фенотип клетки — совокупность молекул, рецепторов, других структурных компонентов, которые она экспрессирует в момент исследования. Этот фенотип определяется активностью соответствующих структурных и регуляторных генов. Поэтому фенотип отражает генную активность клетки, которая, изменяясь под влиянием тех или других факторов, приводит к его модуляции.

Для характеристики фенотипа клеток используются различные маркеры:

- рецепторы, связывающие эритроциты, бактерии, вирусы, иммуноглобулины, гормоны и т.д.

- антигены системы HLA

- молекулы кластера дифференцировки — CD

С целью фенотипирования лимфоцитов широко использовалось определение рецеп- торов к эритроцитам барана и мыши. Гликопротеиды эритроцитов барана (ЭБ) связываются с Т-лимфоцитами, причем ре- цептором для этого служит молекула адгезии CD2. Первые данные об изменении уровня Т- лимфоцитов при многих иммунодефицитных болезнях были получены методом розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК). Позже эти данные были подтверждены путем определения Т-лимфоцитов с помощью моноклональных антител к CD3-молекуле. Хотя метод Е-РОК считается устаревшим, в принципе он позволяет достоверно судить об уров- не зрелых Т-лимфоцитов, хотя и не выявляет Т-клетки с низкоаффинными рецепторами к ЭБ. Однако модификация метода путем обработки ЭБ папаином или нейроаминидазой, «разрыхляющими» мембраны эритроцитов и расщепляющими некоторые вещества, позволяет выявлять всю популяцию Т-клеток, сопоставимую с определением методом проточной цитометрии.

Использование определения «активных» Т-лимфоцитов, связывающих ЭБ при 37°С, принесло меньше информации из-за неясности сущности феномена и его связи с конк- ретными, ныне известными, субпопуляциями Т-клеток. Все же этот метод в определенной степени детектирует гетерогенность феноти- па Т-клеток и иногда указывает на связь с тяжестью патологического процесса при снижении их уровня.

Применение метода «теофиллинчувствительности» для характеристики Тх и Тс оказалось неприемлемым, так как нет корреляции его показателей с CD4+ и CD8+-лимфоцитами и поэтому значение уменьшения розеткообразования под влиянием теофиллина остается неясным.

1.2.1. Особенности иммунофенотипирования  лимфоцитов методами лазерной проточной цитометрии

Цитометрия клеток в потоке позволяет анализировать их фенотип по морфологическим и молекулярным параметрам. Эти параметры различаются у лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Скорость анализируемого потока 10–30 тыс. клеток в секунду.

Проточный цитометр имеет три основные блока: оптический для измерения рассеивания света и флюоресценции возбуждаемого одним или двумя лазерами; блок преобразования световых сигналов в электрические; компьютер для анализа данных.

Проточный цитофлуориметр FACS Calibur™ производства фирмы Becton Dickinson — универсальная система, предназначенная как для клинических, так и научных исследований, основанных на анализе свойств клеток. Прибор может проводить регистрацию до 6 оптических параметров клеток, включая 4 параметра флуоресценции с использованием двухлазерной оптической схемы, что позволяет оценивать распределение нескольких клеточных маркеров в одной пробе и предоставляет широкие возможности для выбора различных флуоресцентных реагентов и их сочетаний при проведении исследований.

Двухлазерная конфигурация оптической системы прибора гарантирует надежное разделение сигнала при работе с многоцветными метками и позволяет использовать широкий спектр флуоресцентых меток.

Для метода меченых антител применяют флуоресцентные красители — флюоресцеин-5- изотиоцианат (ФИТЦ) и R-фикоэритрин (ФЭ). Под воздействием аргонового лазера с длиной волны 488 нм ФИТЦ излучает свет в зеленом спектре, а ФЭ — в оранжево-красном. Применение других флюорохромов и нескольких лазеров позволяет проводить мультицветовой анализ нескольких параметров клетки одномоментно, что является большим преимуществом этой технологии.

Несмотря на то, что иммунофенотипические маркеры лимфоцитов интенсивно изучаются, о чем свидетельствует большое количество работ, их значение при многих нозологических формах остается недостаточно исследованным. Кроме того, для проведения адекватной терапии, необходимо точно знать диагностические иммунологические критерии при назначении тех или иных иммуномодулирующих препаратов.

Наиболее существенным фактором, определяющим состояние иммунитета, является количественная и/или функциональная характеристика субпопуляций клеток системы иммунитета.

К настоящему времени практически сформировался стандарт, по которому осуществляется идентификация иммунокомпетентных клеток и определение их функциональной способности. Он включает:

- выделение лейкоцитарной фракции  крови с лизисом эритроцитов;

- инкубация выделенных клеток с моноклональными антителами к CD-рецепторам — маркерам клеточных популяций при неадекватной для иммунологических реакций температуре — 4°С, из-за «сбрасывания» рецепторов при 37°С;

- обработку клеток моно- или поликлональным антимышиным антииммуноглобулиновым конъюгатом, связанным с флюорохромом;

- идентификацию маркер-несущей субпопуляции при помощи метода проточной цитометрии или иммунофлюоресции.

Данный подход получил широкое распространение в странах Западной Европы, США и России.

Основные недостатки такого подхода — необходимость инкубации при неадекватной температуре 4°С, использование для оценки результатов дорогостоящего проточного цитометра или люминисцентного микроскопа.

При использовании «одинарной» метки выделенные из крови лейкоциты инкубируют с немечеными мАТ против соответствующего CD- антигена при 4°С 30 мин. Когда используют непрямой метод и первичные немеченые мАТ, то на втором этапе добавляют антитела, меченые флуорохромом — антимышиные, козьи или кроличьи иммуноглобулины или их F(ab)2 фрагменты и снова инкубируют при 4°С 30 мин. Очевидно, что хотя «холодовая» инкубация предотвращает движение мембраны и сброс рецептора с антителом, однако не является оптимальной температурой взаимодействия антитела и антигена.

Другим критическим моментом является последующий этап лизиса эритроцитов. Лизирующий раствор (0,8% раствор хлористого аммония + 0,1% NaHCO3 + 0,0037% натрие- вая соль ЭДТА, рН=7,2–7,4), в котором инкубируют клетки 1–3 мин, а затем центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин, может повреждать мембраны лимфоцитов, удаляя с них наиболее лабильные рецепторы активации как непосредственно, так и под действием ферментов, выделяющихся из поврежденных клеток. Когда используют метод с «двойной» меткой, то лейкоциты инкубируют с антителами при 20–22°С 30 мин, что лучше для взаимодействия антител и антигенов. Однако и в этом методе остается этап лизиса эритроцитов. Оптимальным было бы исключить данную процедуру.

Стоимость проточного цитометра составляет (в зависимости от фирмы-изготовителя) от 100 до 230 тыс. долларов США. Кроме того, в странах СНГ, серийно данные приборы вообще не производятся. Естественно, их использование необходимо, особенно для научных целей: для одномоментного выявления двух-трех и более маркеров. Однако при повседневной оценке иммунного статуса больных необходимы более простые и дешевые методы.

Это важно для иммунологического мониторинга населения, и особенно — отдельных его контингентов (ликвидаторов аварии на ЧАЭС, детей, лиц с первичными и вторичны- ми иммунодефицитами, аллергическими заболеваниями).

1.2.2. Фенотипирование лимфоцитов  с частицами, покрытыми моноклональными антителами

Детекция структур клеточной поверхности с помощью свободных антител или других лиганд, связывающихся с определенными подвижными молекулами, которые могут по ней мигрировать и сбрасываться, не отражает той ситуации, когда происходит взаимодействие клетки с рецептором другой клетки, т.е. путем межклеточных контактов, а «лиганд-рецептор» фиксируется на клетке. Поэтому необходим аналитический метод, регистрирующий взаимодействие фиксированных лиганд-антител или антигенов с клеточной поверхностью, моделирующий межклеточные взаимодействия. Такой метод предложен нами на основе диагностикумов с фиксированными эритроцитами — частицами, покрытыми мАТ.

Для анализа фенотипа популяций и субпопуляций лимфоцитов мы предложили ис- пользовать разработанные нами стабильные иммунодиагностикумы на основе моноклональных антител, связанные с частицами. Эритроциты обрабатывали антителами против иммуноглобулинов мыши и сорбировали на них мАТ. В итоге получили стабильный диагностикум, который использовали в прямой реакции розеткообразования с суспензией неочищенных лейкоцитов или лимфоцитов. Сравнение метода с проточной цитометрией и иммунофлюоресценцией позволило установить прямую корреляцию по CD-антигенам, выявляемым разными методами. Однако, количественно метод анти-CD-частиц выявлял меньшее количество CD3+-лимфоцитов и большее CD25+ активированных лимфоцитов, чем метод проточной цитометрии. Это связано, по-нашему мнению, в первом случае с плотностью распределения CD3-молекул на мембране лимфоцитов, так как для образования стабильной розетки в методе анти-CD-частиц требуется большая плотность CD3-молекул, а в проточной цитометрии типируются лимфоциты и с меньшей плотностью распределения CD3-молекул. Выявление же более высокого процента CD25+ лимфоцитов, методом СД-частиц, по-видимому, связано со стабилизацией мембраны при связи нескольких молекул CD25-антигена с антителами прочно сорбированными на частице, т.е. при так называемом «комплексном многоточечном» связывании, что предотвращает их движение к полюсу клетки и сброс рецептора вместе с антителом к нему что происходит при «одноточечном» связывании свободных антител (метод проточной цитометрии).

Мы установили, что при иммунодефицитных вариантах бронхолегочных и инфекци- онно-воспалительных заболеваний, как правило, снижены уровни лимфоцитов с феноти- пом CD3+ Т-общие и CD4+ Т-хелперы, иммунорегуляторный индекс — CD4/CD8. Одно- временно отмечалось усиление экспрессии рецепторов активации — CD25, CD71. Аналогичные данные в целом получены и методом проточной цитометрии.

1.2.3. Иммунофенотипирование  лимфоцитов иммуноферментным методом

 Принцип метода. При применении реагентов фирмы Dako используется сродство стрептавидина к биотину. Фиксированные мазки крови обрабатывают мАТ к к соответствующему CD-антигену, а несвязывающиеся антитела удаляют промыванием. На следующем этапе мазки обрабатывают антителами к мАТ (против мышиного иммуноглобулина) меченные биотином. После чего добавляют стрептавидин, меченый ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой). Выявляют активность фермента субстратхромогенной смесью. При микроскопии вокруг клеток, связавших антитела, имеется ореол окрашенного хромогена. Контроли включают отрицательный образец необработанный мАТ и положительный — клетки с известным фенотипом. В качестве положительного контроля применяют антитела к CD45 (положительны все лимфоциты), а в качестве отрицательного — неиммунный мышиный IgG1 вместо мАТ. Метод не нашел широкого применения. Использование фиксированных мазков с клетками не является оптимальным, т.к. клетки могут терять некоторые молекулы при фиксации.

1.2.4. Иммуномагнитное выделение лимфоцитов как метод их фенотипирования

 Согласно рекламному проспекту  Фирма Dynal (Норвегия) предлагает метод  иммунофенотипирования лимфоцитов на основе их биомагнитного сепарирования и подсчета абсолютного количества. Принцип метода заключается в том, что парамагнитные полистерольные микрочастицы (диаметр 4,5 мкм), конъюгированные с моноклональными антителами к CD4 и CD8 антигенам, связываются с клетками, имеющими эти антигены и после 10 мин инкубации осаждаются на магнитном сепараторе, а несвязавшиеся — удаляются. В итоге подсчитывается количество клеток, связавшихся с микрочастицами.

Это один из методов, в котором мАТ связаны с достаточно крупными микрочастица- ми, которые взаимодействуют с клетками. Способ конъюгации антител с частицами не описывается. Этапы выделения CD4+, CD8+- лимфоцитов:

- цельную кровь разбавляют фосфатным  бу- фером (125 мл крови + 350 мкл буфера)

- удаляют моноциты, для чего к крови добавляют 25 мкл анти-CD14 частиц (Dynabeads), инкубируют 10 мин при магнитном сепараторе, а затем отсасывают надосадочную жидкость (НЖ) с лимфоцитами

- к двум разным порциям НЖ  без моноцитов добавляют по 25 мкл анти-CD4 и на магнитном сепараторе Dynal MPC лимфоциты, связавшие осажденные клетки, ресуспензируют в лизирующем растворе уксусной кис- лоты для разрушения эритроцитов (5 мкм при комнатной температуре)

- добавляют красители (генцианвиолет или акридиновый оранжевый) и подсчитывают количество клеток в камере Горяева на световом или флуоресцентном микроскопе. Корреляция с проточной цитометрией — 90%.

Данный метод наиболее близок разработанному нами методу CD-частиц, так как микрочастицы несут антитела. Стоимость дозы магнитных частиц для одного анализа составляет 3 долл. Метод ограничен анализом CD8+ и CD4+-лимфоцитов.

1.2.5. Лимфоцитотоксический тест

 Принцип метода. При связывании  антител с антигенами на поверхности  клетки образуется иммунный комплекс, который активирует комплемент, лизирующий клетку. Лизис оценивается по окраске клеток трипановым синим. В методе используются только те изотипы мАТ, которые способны после связывания с антигеном активировать добавленный комп- лемент. Рассчитывается процент окрышен- ных погибших клеток, который отражает количество Т- или В-лимфоцитов соответствующей субпопуляции. В настоящее время метод чаще применяется для выявления HLA- антигенов.

1.2.6. Характеристика связывания  липополисахаридов бактерий лейкоцитами  для оценки иммунного статуса

 В норме клетки СИ постоянно контактируют с бактериями в миндалинах, пейеровых бляшках, других структурах мукозоассоции- рованной лимфоидной ткани. Важнейшими структурами бактериальной стенки и активаторами СИ служат липополисахариды (ЛПС). Центральная часть ЛПС (ядро) — олигосахаридный «кор» состоит из остатков 2-кето-3- дезоксиоктоната, галактозы, глюкозы, гептозы и N-ацетилглюкозамина. С одной стороны, к этому ядру присоединен липид А, а с другой стороны — О-специфические полисахаридные цепочки из 3–4 сахаров, которые являются наиболее иммуногенными в ЛПС и определяют его специфичность.

В целом ЛПС является эндотоксином и уже в небольших дозах вызывает лихорадку из-за активации макрофагов и выделения ими ИЛ1, ФНОa и других цитокинов, поликлональную тимуснезависимую активацию В-лимфоцитов и синтез антител, дегрануляцию гранулоцитов, агрегацию тромбоцитов. Он может связываться с любыми клетками организма, но особенно с макрофагами. В больших дозах угнетает фагоцитоз, вызывает токсикоз, нарушение функции сердечно-сосудистой системы, тромбозы, эндотоксиновый шок. ЛПС некоторых бактерий входит в состав иммуностимуляторов (продигиозан, пирогенал).

В сыворотке крови имеется ЛПС-связывающий белок; ЛПС комплексируется с ним, а затем связывается с CD14-рецептором моноцитов макрофагов и активирует их. CD14 имеется также на В-лимфоцитах и, видимо, на всех лейкоцитах. Суперактивация лейкоцитов через этот рецептор приводит к развитию эндотоксинового шока. Блокировка этого рецептора используется в лечении. ЛПС-активированная сыворотка (комплекс ЛПС+белок) индуцирует экспрессию функционального активного рецептора для ИЛ-8 на нейтрофилах и усиливает их миграцию.

ЛПС и пептидогликан бактерий имеют связующие рецепторы на всех лейкоцитах. Лейкоциты новорожденных слабее связывают ЛПС, чем взрослых. Причем не только через CD14 рецептор, так как имеются другие структуры. В прямом связывании ЛПС участвуют Toll-рецепторы [TLR-1–11].

ЛПС является митогеном для В-лимфоци- тов и может служить суперантигеном. Более того, оказалось, что он может стимулировать пролиферацию отдельных Т-лимфоцитов (1:1000) продукцию ими цитокинов. При местном контакте со слизистой оболочкой носа ЛПС в дозах 0,001–1 мкг/мл через 24 часа активировал CD3 Т-клетки и секрецию цитокинов и ферментов, т.е. индуцировал местное воспаление.