Сучасні методи дослідження ліпідів

МІНІСТЕРСТВО  ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ХАРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧУВАННЯ ТА ТОРГІВЛІ

Доповідь  на тему:

«Сучасні методи дослідження ліпідів» 
 
 
 
 

                                        Виконала:

                                        студентка ӀӀ курсу

                                        ННІХТБ

                                        денного відділення

                                        групи ТКМ-59

                                        Красюк Н.В.

                                        Перевірила:Отрошко  Н.О 
 
 
 
 

Харків 2011

Вступ

    Ліпіди (грец.lipos-жир) — жири і жироподібні речовини, органічні сполуки рослинного і тваринного походження, різні за складом, але близькі за фізико-хімічними властивостями. Ліпіди нерозчинні у воді, добре розчиняються в органічних розчинниках. До ліпідів відносять жири, віск, фосфатиди, стерини та стероїди.

    Ліпіди, які належать до важливих у біологічному відношенні речовин, входять до складу насіння сосни звичайної. Ліпіди виділяють з біологічних джерел органічними розчинниками, а індивідуальне розділення проводять хроматографічними методами. Ліпіди мають широке практичне застосування не тільки в медицині, але й як продукти харчування та в інших різних галузях промисловості.

1.Загальна характеристика ліпідів

    Ліпіди (жири і жироподібні речовини) разом з білками і вуглеводами становлять основну масу органічних речовин організму. Вони є складовими частинами клітинних оболонок та мембранних систем клітини і беруть участь в їх проникності. Жири захищають внутрішні органи від механічних пошкоджень, є важливим джерелом енергії для організму та субстратом для синтезу цілого ряду біологічно важливих речовин.

    Ліпіди об’єднують велику групу різних за хімічною природою органічних речовин, які мають деякі спільні фізико-хімічні властивості. Однією з таких спільних властивостей ліпідів є нерозчинність їх у воді і здатність добре розчинятися в органічних розчинниках — спирті, ефірі, хлороформі, ацетоні, бензолі та деяких інших.

2. Класифікація ліпідів.

    За хімічним складом та фізико-хімічними властивостями ліпіди поділяють на три групи: прості, складні і похідні ліпідів. До простих ліпідів відносять ліпіди, які побудовані з залишків спиртів і вищих жирних кислот. Найпоширенішими з цієї групи ліпідів є нейтральні жири (гліцериди), стериди і воски.

    Група складних ліпідів характеризується наявністю в їхній молекулі крім спиртів і вищих жирних кислот фосфорної або сірчаної кислот, азотистих речовин, вуглеводів та деяких інших компонентів. Основними представниками цієї групи ліпідів є фосфоліпіди, гліколіпіди.

    До групи похідних ліпідів відносять каротини, окремі жиророзчинні вітаміни, жирні кислоти, вищі спирти.

2.1.Прості ліпіди

    Нейтральні жири (гліцериди) — це складні ефіри трьохатомного спирту гліцерину і жирних кислот. Якщо в гліцерині всі три спиртові групи етерифіковані жирними кислотами, то такі сполуки називають тригліцеридами, якщо дві групи —дигліцеридами і якщо етерифікована одна спиртова група –моногліцеридами.

Моногліцерид, дигліцерид, тригліцерид.

    Вищі жирні кислоти в жирах представлені головним чином насиченими і ненасиченими ациклічними карбоновими кислотами. В окремих випадках в складі жирів зустрічаються циклічні карбонові кислоти та оксикислоти. У таблиці наведено більшість карбонових кислот, що входять до складу жирів. 
 
 
 
 

    Жирні кислоти відрізняються між собою температурою плавлення і здатністю розчинятися у воді й органічних розчинниках. Збільшення числа вуглецевих атомів у молекулах насичених жирних кислот супроводжується підвищенням їх температури плавлення. Збільшення числа подвійних зв’язків у молекулах ненасичених жирних кислот призводить до зниження їх температури плавлення. Жирні кислоти з довгим вуглецевим ланцюгом практично не розчинні у воді. Їх натрієві і калієві солі утворюють у воді міцели.

    Деякі ненасичені жирні кислоти не синтезуються в організмі людини і тварин або утворюються з недостатній кількості. Тому їх називають незамінними. До таких жирних кислот відносять лінолеву, ліноленову, арахідонову та деякі інші вищі ненасичені жирні кислоти. Основним джерелом поповнення ними організму людини є лляна, конопляна, кукурудзяна та соняшникова олія. Ці рослинні жири містять переважно лінолеву і ліноленову кислоти. Вершкове масло багате на арахідонову кислоту. Ненасичених жирних кислот в організмі зумовлює припинення росту молодих тварин, викликає захворювання шкіри до складу нейтральних жирів входять жирні кислоти з різним числом вуглецевих атомів і різним ступенем насиченості. Жирні кислоти значною мірою визначають фізичні властивості жирів. Так, наприклад, якщо в складі тригліцеридів переважають насичені (тверді) жирні кислоти, то такі жири матимуть тверду консистенцію і високу температуру плавлення. Якщо в складі тригліцеридів переважатимуть ненасичені жирні кислоти, вони матимуть низьку температуру плавлення і перебуватимуть у рідкому стані. В організмах людини і тварин жири нагромаджуються головним чином в підшкірній жировій клітковині. Це так звані резервні (запасні) жири.

    Стериди-це складні ефіри стеринів і вищих жирних кислот. Стерини, або стероли, похідні циклопентапергідрофенантрену. Останнє можна розглядати як продукт конденсації гідрованого фенантрену і циклопентану;

    Циклопентапергідрофенантрен. Основним представником стеринів є холестерин який є ненасиченим одноатомним циклічним спиртом. На зовнішній вигляд—це біла кристалічна речовина, яка розчиняється лише в органічних розчинниках. Із жирними кислотами холестерин утворює складні ефіри — холестерид.

    Із вищих жирних кислот, виявлених у складі стеридів є переважно пальмітинова, стеаринова та олеїнова кислоти. В організмах людини і тварин кількість холестерину, яка етерифікова нежирними кислотами, коливається в межах 10—20%.Більша частина холестерину з організмі існує у вільному (неетерифікованому) стані.

    Стерини є основою для утворення в організмі біологічно активних сполук — жовчних кислот, статевих гормонів, гормонів кори надниркових залоз та вітамінів групи D.

    Воски-це складні ефіри вищих спиртів і вищих жирних кислот. За фізико-хімічними властивостями воски близькі до жирів. Вони більш стійкі проти дії світла, окислювачів, нагрівання, важче піддаються гідролізу.

    Природні воски, крім складних ефірів, містять певну кількість вільних вищих спиртів і вищих жирних кислот, а також невелику кількість вуглеводів, барвників та пахучих речовин. Загальна кількість цих домішок може досягати 50%.

    Розрізняють воски тваринного і рослинного походження. До першої групи восків відносять ланолін, спермацет і бджолиний віск. Представником рослинних восків може бути карнаубський віск. Рослинні воски відіграють важливу захисну роль, покриваючи листя і плоди тонким шаром.

2.2.Складні ліпіди

    Складні ліпіди мають дуже важливе значення в життєдіяльності організму. Вони беруть безпосередню участь у побудові клітинних структур і в біохімічних процесах. У тканинах і органах складні ліпіди містяться в точно визначених кількостях, їх вміст у клітинах не змінюється навіть при голодуванні.

    Складні ліпіди часто називають ліпоїдами. Вони належать до цитоплазматичних ліпідів.

    Фосфоліпіди (фосфатиди). Характерною особливістю цієї групи ліпідів є наявність в їх молекулах залишків фосфорної кислоти. Важливими представниками фосфоліпідів є фосфатидилхоліни, фосфатидилетаноламіни, плазмологени, фосфатидилінозити, сфінгомієліни.

    Фосфатидилхоліни (холінфосфатиди, лецитини). До складу фосфатидихолінів входять гліцерин, два залишки молекул вищих жирних кислот, залишок фосфорної кислоти і холін:

    Фосфатидилетаноламіни (коламінфосфатиди, кефаліни). Ця група фосфоліпідів побудована за тим самим принципом, що й фосфатидихоліни. Відмінність їх полягає лише в тому, що до складу фосфатидилетаноламінів замість холіну входить інша азотиста основа-коламін.

    В молекулах фосфатидилсеринів азотистою основою є залишок амінокислоти серину.

    Фосфатидилсерини (серинфосфоліпіди) — менш поширені, ніж попередні дві групи фосфоліпідів. Вони відіграють важливу роль у синтезі фосфатидилетаноламінів. Між лецитинами, кефалінами і серинфосфоліпідами існує генетичний зв’язок. Ці групи фосфоліпідів відрізняються між собою лише азотистими основами і в результаті їх взаємоперетворення вони можуть переходити одна з одну.

    Плазмалогени (ацетальфосфатиди). Ці речовини за своєю будовою близькі до фосфатидилхолінів і фосфатидилколамінів. Відрізняються від них тим, що в їх складі замість однієї з вищих жирних кислот з гідроксильною групою гліцерину сполучається альдегід вищої жирної кислоти.

    Плазмогени. Сполуки, що утворюються в результаті взаємодії альдегідів із спиртами, називаються ацеталями, тому група фосфоліпідів має назву ацетальфосфатидів. Містяться вони переважно в складі нервової м’язової тканин разом з кефалінами.

    Фосфатидилінозити (інозитфосфоліпіди). Ця група фосфоліпідів характеризується наявністю в їх складі шестиатомного циклічного спирту інозиту. Розрізняють моно- і дифосфатидилінозити:

    Монофосфатидилінозити. Фосфатидилінозити досить поширені в живій природі. Вони є в організмах людини, тварин і рослин. Особливо багато їх у складі нервової тканини фосфорної кислоти:

    Кардіоліпіни є важливою складовою частиною ліпопротеїдів мембран мітохондрій. Вважають, що вони відіграють важливу роль у процесах перенесення електронів, в окислювальному фосфорилюванні.

    Сфінгомієліни. Група фосфоліпідів, яка на відміну від попередніх груп, містить не трьох-, а двохатомний спирт сфінгозин, що зв’язується пептидним зв’язком з вищою жирною кислотою і ефірним зв’язком з фосфорною кислотою. Остання зв’язується з азотистою основою — холіном.

    Сфінгомієліни відрізняються один від одного за хімічним складом і будовою вищої жирної кислоти. До їх складу часто входять пальмітинова, стеаринова, лігноцеринова, нервонова та інші кислоти. Багато сфінгомієлінів у нервовій тканині. Вони складають основу мієлінових оболонок нервових волокон.

3.Біологічна роль ліпідів в організмі.

    Ліпіди, як і білки, вуглеводи та інші речовини, відіграють в організмі важливу біологічну роль. Вона насамперед визначається тим, що ці речовини характеризуються комплексом своєрідних фізико-хімічних властивостей.

    В організмах людини і тварин ліпіди входять до складу всіх клітин. Однак розподілені вони між різними органами і тканинами нерівномірно і кількість різних груп ліпідів у них також неоднакова.

    Значна частина ліпідів входить до складу клітин організму як пластичний матеріал. Вони утворюють в основному комплекси з білками (ліпопротеїди), вуглеводами (гліколіпіди) та деякими іншими речовинами. Такі комплекси становлять основу структури клітин і тканин організму. Значна кількість ліпопротеїдних комплексів входить до складу клітинних мембран та мітоходрій, в яких проходять важливі метаболічні процеси—фосфорилююче та вільне окислення. Ліпіди, що входять до складу мембран, беруть безпосередню участь у процесах активного транспорту крізь мембрани молекул та іонів, специфічної рецепції на поверхні клітин, передачі нервових імпульсів тощо. Оскільки клітинні мембрани є важливими регуляторами багатьох біохімічних процесів, то зміна структури, складу та орієнтації мембранних ліпідів викликає значні порушення клітинного метаболізму.

    Ліпіди виконують важливі механічну і термоізоляційну функції. Вважають, що доросла людина залежно від умов зовнішнього середовища і виду трудової діяльності щодобово повинна одержувати 8—10 г фосфоліпідів, 8—15 ненасичених жирних кислот і 0.3—0,5 г холестерину. Для забезпечення збалансованості харчового раціону необхідно також підтримувати належне співвідношення між білками, ліпідами і вуглеводами.

4. Визначення вмісту загальних ліпідів

    Найбільш простим методом визначення загальних ліпідів в тканинах є метод настоювання наважок тканини в хлороформ-метанольній суміші. За різницею мас зразка до і після екстракції знаходять процентний вміст ліпідів. Визначення ліпідів можна проводити в абсолютно-сухому чи повітряно-сухому матеріалі. При використанні повітряно-сухого матеріалу паралельно із визначенням ліпідів визначають вміст води, щоб зробити розрахунки на абсолютно-суху речовину. Для одержання надійних результатів роблять два паралельних визначення.

    1,0-1,5 г. насіння сосни звичайної зважують на аптечних терезах, розтирають у ступці, потім переносять у висушені і зважені на аналітичних терезах пакети із фільтрувального паперу. Зважують матеріал разом із пакетом і по різниці між одержаною масою і масою порожнього пакету визначають масу наважки. Пакет із наважкою вкладають в пакет більшого розміру і поміщають в конічну колбу, додають 35-40 мл. Метанолу і потім доливають 35-40 мл. хлороформу. Вміст колби перемішують і залишають в темному місці.

    Пакет із обезжиреним матеріалом промивають і сушать в термостаті при 100 С протягом 2,5 год. , після чого зважують.

    Визначення вмісту води проводять у повітряно-сухому матеріалі паралельно із обезжиренням. Матеріал поміщають у бюкс, сушать і за різницею мас б’юкса до і після просушення визначають вміст води.

5.Визначення вмісту загальних ліпідів в тканинах за допомогою апарату Сокслету

    Метод заключається в неперервній екстракції сумарних ліпідів з висушеного матеріалу з подальшим визначенням різниці мас зразка до і після екстракції.

    Досліджуваний зразок, висушений і подрібнений, поміщають в пакет з фільтрувального паперу, який опускають в екстрактор апарату Сокслета. Екстрактор заповнюють ефіром на 1/5 об’єму. Колбу поміщають в водяну баню, і пропустивши воду в холодильник, нагрівають.

    Після нагрівання ефір, який містить жири, стікає в колбу. Процес повторюють до повного виділення жиру із зразка.

5.2.Розділення ліпідів на фракції методом ТШХ

    Для розділення ліпідів широко використовують ТШХ. Метод базується на тому, що ліпідний екстракт наносять на спеціально приготовлені пластинки з шаром силікагелю або Silufol пластинки. Розділення проводять в підібраній системі розчинників, в спеціальних камерах. Проявляють хроматограми концентрованою сульфатною кислотою або парами йоду. Плями обводять і розраховують Rf кожної і порівнюють з теоретичним значенням Rf.

    В якості рухомої фази при ТШХ ліпідів використовують суміш хлороформу, метанолу і води у співвідношенні 65:25:4.

5.3.Розділення фосфоліпідів методом ТШХ

    Ліпідний екстракт нанесли капіляром на Silufol пластинку на відстані 1 см. від краю пластинки. В якості розчинника використовували суміш хлороформ-метанол-вода у співвідношенні 65:25:4. Пластинку помістили в хроматографічну камеру з розчинником і вийняли, коли розчинник піднявся на 1,5 см. Від верхнього краю. Пластинку висушили і оприскали 10%-ним розчином сульфатної кислоти до появи обвуглених плям. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

    1.http://referaty.net.ua/referaty/referat_108217.html

    2. Біологія: Навч. Посібник / Слюсарів А.О., Самсонов О.В., Мухін В.М. та ін.; за ред. та пер. з рос.. Мотузяного В.О.-2-ге вид., К.:В. ш., 1995. – 607с.

    3. Довідник з біології / за ред. Ситника К.М.- К.: Наук. Думка, 1998. – 682с.

    4. Лікарські рослини і їх застосування / Марченко М.С., Карамишев А.М., Сила В. І. 2-ге вид., К.: Здоров’я, 1981. – 232с.

    5. Біологічна хімія / за ред. Сопіна Є.Ф. –К.:В.ш., 1972.- 384с.

    6. Боєчко Ф. Ф. Біологічна хімія. – К.: В.ш., 1989. – 438с.

    7. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – 2-е изд., - М.: В.ш., 1985. – 503с.

    8. Ермолаев М.В. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1983. – 300с.

    9. Добрынская М.А., Павлович И.А. Учебник биологической химии. – Л.:Медгиз, 1961. – 230с.

    10. Кучеренко Н.Е., Васильев М.А. Липиды. – К.: В.ш. 1983. – 263с.

    11. Кучеренко Н.Е. Биохимия. – Л.: В.ш., 1988. – 432с.