Введение генов в клетки растений. Достижения генной инженерии. Проблемы биобезопасности трансгенных растений. 2

 

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Тюменский Государственный Университет

Институт биологии

Кафедра анатомии и физиологии человека и животных

 

Введение генов в клетки растений. Достижения генной инженерии. Проблемы биобезопасности трансгенных растений.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнили:

Зорков Василий Александрович

Чудаев Александр Валерьевич

 

 

 

г.Тюмень, 2014 год

Содержание

 

• Введение генов в клетки растений...................................................................2
• Достижения генной инженерии.......................................................................12
• Улучшение качества запасных белков..........................................................13
• Создание гербицидоустойчивых растений...................................................15
• Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям..................17
• Повышение эффективности биологической азотфиксации......................18
• Получение растений с новыми свойствами..................................................19
• Проблемы биобезопасности трансгенных растений...................................20
• Список литературы...........................................................................................24

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение генов в клетки растений

Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами.

Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения.

Для трансформации устойчивых ("рекальцитрантных") к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку, многие из которых взяты из практики работы с клетками бактерий или животных. Эти методы достаточно разнообразны, они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом.

Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно, впрочем, трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы - хлоропласты и митохондрии.

В последнее время был разработан и успешно применен также комбинированный метод трансформации, названный агролистическим. При этом чужеродная ДНК вводится в ткани каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Вводимая ДНК включает как Т-ДНК вектор с целевым и маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности, поставленные под эукариотический промотор. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном, как и при обычной агробактериальной трансформации.

После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.

Самый эффективный метод переноса генов в растения – использование в качестве вектора почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Эта бактерия содержит плазмиду, в которую можно встроить необходимый для переноса ген. Agrobacterium tumefaciens заражает большинство двудольных растений и вызывает у них образование больших наростов, называемых корончатыми галлами, которые представляют собой подобие раковой опухоли. В норме в ответ на повреждение растение выделяет химические вещества, стимулирующие клеточное деление; при этом образуется группа клеток, называемых каллусом, которые быстро закрывают рану.

Agrobacterium tumefaciens вызывает образование  корончатых галлов (опухолей). Т-ДНК  – трансформирующая ДНК, которая  интегрируется в растительный  геном; vir – область, включающая гены, продукты которых обеспечивают  вырезание и перенос Т-ДНК в  растительную клетку; tra – область, где локализованы гены, контролирующие  конъюгацию бактерий; ori – область, содержащая гены, продукты которых  обеспечивают репликацию Ti-плазмиды

 

Химические вещества, выделяемые поврежденными клетками растения, стимулируют и клетки Agrobacterium, которые заражают рану и вызывают образование галла. Этот процесс контролируется бактериальной плазмидой (Ti-плазмида; от англ. tumor-inducing). Она проникает в растительную клетку и встраивается в ДНК растения. Это приводит к нерегулируемому росту. Сама бактерия не попадает в клетки, но может жить между ними, используя питательные вещества, которые производят растительные клетки под контролем плазмидной ДНК. Клетки растений, содержащие встроенную в их геном Ti-плазмиду с чужеродным геном, называются трансформированными.

К сожалению этот метод долгое время был неприменим к однодольным растениям, к которым относятся такие важные сельскохозяйственные культуры, как кукуруза и пшеница. Однако сейчас эта проблема решена. Метод трансформации используется для улучшения сортов томатов, картофеля и многих древесных растений.

Интеграция Т-ДНК в хромосому растений и образование опухоли (корончатого галла) (по Э.С. Пирузян)

 

С помощью техники клонирования, из одной трансформированной клетки можно получить целое растение. Для этого клетки сначала выращивают в жидкой культуре, затем образовавшуюся недифференцированную массу, называемую каллусом, помещают на питательный агар. При правильном соотношении гормонов формируются побеги, корни и вырастает новое растение. Другой способ получения трансформированных растений подразумевает использование Agrobacterium. Диски, нарезанные из листьев, заражают бактерией и раскладывают на питательном агаре. В процессе роста трансформированные клетки формируют корни и побеги.

Использование вирусов

В генной инженерии бактерий роль векторов обычно играют бактериофаги (вирусы бактерий); вероятно, для трансформации растений можно использовать растительные вирусы.

Использование “ружья”

Неожиданно эффективным оказалось введение чужеродной ДНК в клетки растений с помощью специального ружья. Нужная ДНК упаковывается в золотые или вольфрамовые бусинки диаметром 1 мм. Их размещают на кончике пластиковой пули, которую вставляют в ствол специально сконструированного ружья. В первоначальном варианте пуля выстреливалась обычным способом, т.е. с помощью взрывного заряда, однако сейчас для выстрела используют сжатый газ. Пуля разрывается в камере на поверхности, имеющей микроскопические отверстия. Некоторые из частичек упакованной ДНК попадают через эти отверстия в мишень, которой являются растительные клетки или ткани. Выстрел производится в вакууме, поэтому частички ДНК не оседают. Они обнаруживаются в цитоплазме трансформированных клеток.

Схема действия «генной» пушки.

Схема создания генетически модифицированных растений

Основные этапы этого процесса включают:

1) получение целевых генов, предназначенных для введения в растение, и конструирование кассеты экспрессии;

2) конструирование вектора, несущего целевой ген;

3) трансформацию растительных клеток;

4) регенерацию целого растения из трансформированной клетки;

5) детектирование трансформированных растений среди регенерантов.

Получение целевых генов. На первом этапе необходимо получить ген, который будет вводиться в реципиентную клетку растения-хозяина. Для этого существует несколько возможностей.

Если расшифрована нуклеотидная последовательность ДНК и картированы гены донорного организма (т.е. известно, какие фрагменты этой ДНК кодируют те или иные признаки), то нужный ген может быть вырезан специальными ферментами рестриктазами из геномной ДНК донора. Другим способом получения целевого гена является химический или ферментативный синтез нужного фрагмента ДНК. И, наконец, искомую нуклеотидную последовательность можно получить ферментативным синтезом ДНК с матричной РНК — кДНК. Таким образом, в результате реализации того или иного способа получают фрагмент ДНК, несущий ген, кодирующий необходимый признак.

Для того чтобы ген после введения его в организм нового хозяина экспрессировался, т.е. работал, и, как результат этого, в клетке синтезировался соответствующий белок, необходимо снабдить его регуляторными элементами. Регуляторные элементы представляют собой определенные последовательности нуклеотидов, которые позволяют гену функционировать. Обязательными компонентами регуляторных элементов являются:

♦ промотор — участок молекулы ДНК, с которым связывается РНК-полимераза (фермент, катализирующий синтез мРНК), что сопровождается инициацией транскрипции гена;

♦ терминатор — участок молекулы ДНК, определяющий окончание синтеза молекулы мРНК.

В качестве промотора чаще всего используют сильный промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Он относится к конститутивным промоторам, т.е. таким, которые работают на протяжении всей жизни растения. Иногда требуются специфические промоторы — такие, которые активны в отдельных клетках, тканях, органах или лишь на определенных стадиях жизни растений. Например, есть промоторы, которые работают только в клубнях картофеля и никогда не будут работать в его листьях. Наконец, существуют индуцибельные промоторы, которые активируются только под воздействием определенных факторов — химических веществ, температуры и др. В зависимости от того, какой ген должен быть перенесен в растение и в какой период он должен экспрессироваться, для создания вектора выбирают тот или иной промотор.

Таким образом, кассета экспрессии представляет собой группу функционально связанных участков ДНК, в состав которой входят промотор, целевой ген и терминатор.

Конструирование вектора. Сама по себе кассета экспрессии не может попасть в клетку-реципиент и интегрироваться (внедриться) в хромосомы растения-хозяина. Для этого нужен вектор — специальная молекула ДНК, которая может проникать в клетки растений и там самореплицироваться, либо встраиваться в ДНК хозяина и реплицироваться вместе с ней.

В качестве вектора обычно используют ДНК вируса или бактериофага, а также плазмиды бактерий (кольцевые молекулы ДНК, несущие небольшое количество генов и присутствующие в бактериальной клетке наряду с хромосомной ДНК). Именно плазмиды чаще всего применяются для трансформации растений.

Первые попытки создания таких векторных систем основывались на использовании 77-плазмиды (от англ. tumor-inducing plasmid) почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens — фитопатоген, который инфицирует клетки растений, что приводит к образованию опухоли — корончатого галла, нарушающей нормальный

рост растения. Причем, эта бактерия может поражать только клетки двудольных растений.

Инфицирование растений A. tumefaciens и образование корончатого галла

 

Образование корончатого галла является результатом трех взаимосвязанных процессов:

1. Проникновение бактерии в клетку растения.

2. Интеграция в геном растительной клетки специфического сегмента плазмидной ДНК бактерии — Т-ДНК (от англ. transferred DNA — часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли).

3. Экспрессия отдельных генов Т-ДНК. Инфекционный процесс начинается с прикрепления

A. tumefaciens к клеткам растения  в месте повреждения, чаще всего  у основания стебля. Поврежденное  растение выделяет специфические  фенольные соединения, которые активируют  гены вирулентности (vir-гены), локализованные  в участке Ti-плазмиды за пределами  Т-ДНК .

Продукты vir-генов необходимы для транспорта и интеграции Т-ДНК в геном растительной клетки. После активации fir-генов Т-ДНК транспортируется в клетку. При этом она находится в одноцепочечной форме, и именно в такой форме происходит ее встраивание в хромосомную ДНК растения.

Генетическая карта 77-плазмиды.

 

Т-ДНК содержит гены ауксина, цитокинина и опина, которые транскрибируются и транслируются только в растительных клетках За пределами Т-ДНК находится кластер vir генов гены кодирующие ферменты катаболизма опина, и сайт инициации репликации (ori), который обеспечивает стабильное поддержание плазмиды в A. tumefaciens Л и П - левая и правая фланкирующие последовательности соответственно

Большинство генов Т-ДНК активируются только после ее интеграции в хромосомную ДНК растения. Их продукты и вызывают образование корончатого галла. Это происходит в результате экспрессии плазмидных генов, кодирующих ферменты, обеспечивающие синтез растительных гормонов ауксина (ИУК — индолилуксусная кислота) и цитокининов. Ауксин и цитокинины регулируют рост и развитие растительной клетки, но, присутствуя в избытке, могут вызывать у растений образование опухолей.

При использовании 77-плазмиды в качестве вектора для генетической трансформации растений кассету экспрессии, содержащую целевой ген, встраивают в Т-ДНК, а затем такой модифицированной плазмидой, помещенной в бактерию A. tumefaciens, инфицируют клетки растений.

Несмотря на то что 77-плазмиды являются эффективными природными векторами, их использование имеет некоторые ограничения. Наиболее существенные из них следующие:

1. Ауксин и цитокинины, синтезируемые трансформированными 77-плазмидами клетками, подавляют регенерацию зрелых растений из этих клеток. Следовательно, при конструировании векторов на основе 77-плазмид гены ауксина и цитокинина должны быть удалены.

2. Ti-плазмиды имеют очень большой размер (200— 800 тыс. нуклеотидных пар), а для экспериментов с рекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера. Следовательно, участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены.

3. 77-плазмиды не реплицируются в кишечной бактерии Escherichia coli (именно в этих бактериях производят клонирование созданного вектора для получения множества его копий, которые в дальнейшем и будут использовать для трансформации растительных клеток). Следовательно, при конструировании векторов необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их воспроизводство в Е. coli.

Кроме манипуляций, связанных с удалением из 77-плазмид определенных участков ДНК и введения в них сайта инициации репликации кишечной бактерии, в вектор включают специальный ген, который позволяет идентифицировать трансформированные клетки. Он дает возможность обнаружить клетки растений, несущие чужеродную ДНК в составе геномной ДНК трансформированного растения. Эти гены позволяют либо проводить отбор трансформированных клеток — в этом случае они называются селективными маркерными генами, либо оценивать активность кодируемого ими фермента — регуляторные гены. Испытано несколько десятков генов, которые можно использовать как селективные маркерные гены, и репортерных генов, чей белковый продукт можно обнаружить с помощью специальных методов.

Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и кроме кассеты экспрессии содержат следующие элементы:

♦ селективный маркерный ген, который обеспечивает устойчивость трансформированных клеток к антибиотикам;

♦ сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в Е. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens; .

♦ правая фланкирующая последовательность Т-ДНК, которая абсолютно необходима для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений;

♦ полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.

Выделение трансформированных растений. Трансформированные тем или иным способом растительные клетки культивируют в условиях in vitro на специальных средах, способствующих регенерации из них растеньиц. Таким образом, из одной трансформированной клетки можно вырастить полноценное фертильное растение, все клетки которого несут чужеродную ДНК.

Культивирование регенерантов включает несколько серий пассажей («пересадок») на селективных средах, содержащих антибиотик или гербицид, благодаря чему клетки, в которых нет маркерного гена устойчивости к этим веществам, а следовательно, нет и чужеродной ДНК, погибают.

В дальнейшем с помощью определенных манипуляций добиваются элиминации (удаления) маркерных генов из геномов растеньиц-регенерантов, поскольку присутствие этих генов в культурах, использующихся в качестве сырья для производства продуктов питания, нежелательно.

Отобранные регенеранты используют для анализа геномной ДНК, который позволяет определить присутствие целевого гена и число его копий, интегрированных в геном.

Заключительный этап лабораторного тестирования ТГ-растений включает биологические исследования, определяющие стабильность проявления целевого признака.

Таким образом, с использованием описанных выше технологий к настоящему времени созданы и испытаны в полевых условиях ГМ-формы многих сельскохозяйственных растений. Так, получено значительное количество ТГ-форм томатов (более 260), сои (более 200), хлопчатника (более 150), тыквенных (более 80), а также пшеницы, риса, подсолнечника, яблонь и др. Однако зарегистрировано и допущено к промышленному производству лишь незначительное количество ТГ-форм растений (например, в США — немногим более 100 линий ГМ-растений, в других странах — еще меньше). В России на сегодняшний день в государственном реестре зарегистрированы 17 видов продовольственного сырья из ГМИ и 5 видов ГММ. Это связано с тем, что прежде чем попасть на рынок, продукция, содержащая ГМ-компоненты, должна пройти экспертизу качества и безопасности.

Достижения генной инженерии.

Первые трансгенные растения (растения табака со встроенными генами из микроорганизмов) были получены в 1983 г. Первые успешные полевые испытания трансгенных растений (устойчивые к вирусной инфекции растения табака) были проведены в США уже в 1986 г.

После прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой "Calgen", а также гербицид-устойчивая соя компании "Monsanto". Уже через 1-2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса, хлопчатника.

Табак стал первым генномодифицированным

растением, полученным в 1983 году

 

В настоящее время получением и испытанием генетически модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире с совокупным капиталом более ста миллиардов долларов. В 1999 г. трансгенные растения были высажены на общей площади порядка 40 млн. га, что превышает размеры такой страны, как Великобритания.

Первая волна трансгенных растений, допущенных для практического применения, содержала дополнительные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредителям, порче при хранении, стрессам).

Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название "метаболическая инженерия". При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие "лекарственные" белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.

Улучшение качества запасных белков

Запасные белки основных культурных видов кодируются семейством близкородственных генов. Накопление запасных белков семян – сложный биосинтетический процесс. Первая генноинженерная попытка улучшения свойства одного растения путем введения гена запасного белка от другого была, проведена Д. Кемпом и Т. Холлом в 1983 г. в США. Ген фазеолина бобов с помощью Ti-плазмиды был перенесен в геном подсолнечника. Результатом этого опыта было лишь химерное растение, получившее название санбин. В клетках подсолнечника были обнаружены иммунологически родственные фазеолиновые полипептиды, что подтверждало факт переноса гена между растениями, относящимися к различным семействам

Позднее ген фазеолина был передан клеткам табака: в растениях-регенерантах ген экспрессировался во всех тканях, хотя и в малых количествах. Неспецифическая экспрессия фазеолинового гена, так же как и в случае переноса его в клетки подсолнечника, сильно отличается от экспрессии этого гена в зрелых семядолях бобов где фазеолин составлял 25—50% от общего белка. Этот факт указывает на необходимость сохранения и других регуляторных сигналов этого гена при конструировании химерных растений и на важность контроля экспрессии генов в процессе онтогенеза растений.

Более реальной задачей для генетической инженерии считается улучшение аминокислотного состава белков. Как известно, в запасном белке большинства злаковых наблюдается дефицит лизина, треонина, триптофана, у бобовых — метионина и цистеина. Введение в эти белки дополнительных количеств дефицитных аминокислот могло бы ликвидировать аминокислотный дисбаланс. Методами традиционной селекции удалось существенно повысить содержание лизина в запасных белках злаковых. Во всех этих случаях часть проламинов (спирторастворимые запасные белки злаковых) заменялась другими белками, содержащими много лизина. Однако у таких растении уменьшались размеры зерна и снижалась урожайность

Растения могут производить и белки животного происхождения. Так, встраивание в геном растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus химерного гена, состоящего из части гена запасного 25-белка арабидопсиса и кодирующей части для нейропептида — энкефалина, приводило к синтезу химерного белка до 200 нг на 1 г семени. Два структурных белковых домена были связаны последовательностью, узнаваемой трипсином, что давало возможность в дальнейшем легко изолировать чистый энкефалин.

Разработаны также подходы, позволяющие получать бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. Получен картофель, экспрессирующий олигомеры нетоксичной субъединицы β-токсина холеры. Эти трансгенные растения могут быть использованы для получения дешевой вакцины от холеры.

Важнейшим сырьем для получения разного рода химических веществ являются жирные кислоты — основной компонент растительного масла. По своей структуре это углеродные цепи, которые обладают различными физико-химическими свойствами в зависимости от своей длины и степени насыщения углеродных связей

Экспериментальная работа заключалась в том, что был клонирован ген специфической тиоэстеразы из растения Umbellularia califomica, где содержание лаурата в жире семян достигало 70%. Структурная часть гена этого фермента под контролем промотора-терминатора гена белка, специфического для ранней стадии семяобразования, была встроена в геном рапса и арабидопсиса, что и привело к увеличению содержания лаурата в масле этих растений.

Проводится работа по созданию трансгенных растений картофеля и других крахмалнакапливающих культур, в которых это вещество будет находиться в основном в виде амилопектина, то есть разветвленной форме крахмала, или же в основном только в виде амилозы, то есть линейных форм крахмала. Раствор амилопектина в воде более жидкий и прозрачный, чем у амилозы, которая при взаимодействии с водой образует ригидный гель. Так, например, крахмал, состоящий в основном из амилопектина, по-видимому, будет иметь спрос на рынке производителей различных питательных смесей, где сейчас в качестве наполнителя используется модифицированный крахмал.

 

Создание гербицидоустойчивых растений

В новых, интенсивных сельскохозяйственных технологиях гербициды применяются очень широко. Это связано с тем, что на смену прежним экологически опасным гербицидам широкого спектра действия, обладающим токсичностью для млекопитающих и длительно сохраняющимся во внешней среде, приходят новые, более совершенные и безопасные соединения. Однако они обладают недостатком — подавляют рост не только сорняков, но и культурных растений. Такие высокоэффективные гербициды, как, глифосат, атразины интенсивно изучаются на предмет выявления механизма толерантности к ним некоторых сорняков. Так, на полях, где широко используют атразин, довольно часто появляются атразинустойчивые биотипы у многих видов растении.

Изучение механизма устойчивости к гербицидам с целью получения методами генетической инженерии культурных растений, обладающих этим признаком, включает следующие этапы: выявление биохимических мишеней действия гербицидов в растительной клетке: отбор устойчивых к данному гербициду организмов в качестве источников генов устойчивости: клонирование этих генов: введение их в культурные растения и изучение их функционирования

Существуют четыре принципиально различных механизма, которые могут обеспечивать устойчивость к тем или иным химическим соединениям, включая гербициды: транспортный, элиминирующий, регуляционный и контактный. Транспортный механизм устойчивости заключается в невозможности проникновения гербицида в клетку. При действии элиминирующего механизма устойчивости вещества, попавшие внутрь клетки, могут разрушаться с помощью индуцируемых клеточных факторов, чаще всего деградирующих ферментов, а также подвергаться тому или иному виду модификации, образуя неактивные безвредные для клетки продукты. При регуляционной резистентности белок или фермент клетки, инактивирующийся под действием гербицида, начинает усиленно синтезироваться, ликвидируя таким образом дефицит нужного метаболита в клетке. Контактный механизм устойчивости обеспечивается изменением структуры мишени (белок или фермент), взаимодействием с которым связано повреждающее действие гербицида