Иммобилизованные ферменты

ВВЕДЕНИЕ

Иммобилизация ферментов  путем присоединения их к тем  или иным способом к инертной полимерной матрице – это та область, научных исследований, которая в настоящее время вызывает большой интерес у биохимиков, химиков–органиков, физико–химиков, микробиологов, биоматематиков, биофизиков и инженеров–химиков.

За последние 20 лет изучение иммобилизованных ферментов проводилось  на основе двух главных предпосылок. Во–первых, очевидно, что имеются  широкие потенциальные возможности  для исследования иммобилизованных ферментов в качестве регенерируемых, устойчивых и специфических и  специфических промышленных катализаторов. В связи с этим большое число работ было посвящено иммобилизации ферментов, имеющих промышленное значение, и сопутствующим проблемам разработки реакторов и крупномасштабных процессов. Однако, несмотря на широкий размах и глубину проведенных исследований, успехи в этой области пока еще невелики.

Во–вторых, иммобилизованные ферменты изучались с той целью, чтобы выяснить влияние гетерогенного  окружения на катализируемую ферментом  реакцию. Исследование высокоочищенных  ферментов в разбавленных растворах, где кинетика реакции соответствует  уравнению Михаэлиса–Ментен, много дало для понимания их поведения в этих условиях. Однако, как это не печально для энзимологов, большинство внутриклеточных ферментов никогда не функционирует в условиях, отвечающих уравнению Михаэлиса–Ментен, и обычно находится не в разбавленном растворе, а в сложной неоднородной среде. Поэтому, чтобы лучше понять регуляцию ферментов in vivo, было предпринято много попыток изучить влияние на них иммобилизации и определенной гетерогенной среды, а затем соотнести полученные сведения с ситуацией in vivo. [1]

1 ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ  ФЕРМЕНТОВ

Существуют два основных метода иммобилизации ферментов:

          – физический;

–  химический.

Физическая иммобилизация  ферментов представляет собой включение  фермента в такую среду, в которой  для него допустимой является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент  не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

– адсорбция на нерастворимых  носителях;

– включение в поры геля;

– пространственное отделение  фермента от основного объёма реакционной  системы с помощью полупроницаемой  перегородки–мембраны;

– включение фермента в  двухфазную среду, где фермент растворим  и может находится только в  одной из фаз.

Главным отличительным признаком  химических методов иммобилизации  является то, что путем химического  взаимодействия на структуру ферментов в его молекуле создаются новые ковалентные связи в частности между белком и носителем. [2]

1. Физические способы иммобилизации ферментов

1. Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих сейчас способов иммобилизации ферментов. Данный способ иммобилизации ферментов представлен на рисунке 1.

Рисунок 1 – Адсорбция  на нерастворимых носителях

Прежде чем понять механизм адсорбционной иммобилизации необходимо ознакомиться с понятием носители для  данного метода.  Носители для  адсорбционной иммобилизации можно  разделить на два основных класса — неорганические и органические. В качестве неорганических носителей главным образом используются кремнезем, оксиды алюминия, титана и других металлов, различные природные алюмосиликаты (глины), пористое стекло, керамика, активированный уголь и другие. Среди органических носителей наибольшее распространение получили различные полисахариды и  полимерные ионообменные смолы, коллаген.

Обычно носители применяются  в виде порошков, мелких шариков и гранул. Иногда для снижения гидродинамического сопротивления носители изготавливают в форме монолитов, пронизанных большим числом узких параллельных каналов, разделенных тонкими стенками. Важнейшими характеристиками носителей являются удельная поверхность, размер пор, механическая прочность и химическая стойкость.

Существует несколько  методов адсорбционной иммобилизации:

1. Статический способ

 Носитель вносят в водный раствор фермента и полученную смесь оставляют на некоторое время без перемешивания. Иммобилизация достигается за счет самопроизвольной диффузии фермента к поверхности носителя с последующей адсорбцией. Недостатком метода является то, что для получения препарата с высоким содержанием адсорбированного фермента и равномерного заполнения поверхности носителя последний приходится выдерживать в контакте с раствором фермента в течение длительного времени (несколько суток).

2. Способ с перемешиванием

 Носитель суспенизируется в растворе фермента и полученная смесь непрерывно перемешивается с помощью магнитной или механической мешалки. Этот способ гораздо эффективнее статического и обеспечивает более равномерное заполнение поверхности  носителя  адсорбированным  ферментом.

3. Метод электроосаждения

В этом случае в раствор фермента погружают два электрода, на поверхность одного из которых помещают слой носителя. При включении электрического тока молекулы фермента благодаря имеющимся на их поверхности заряженным группам начинают перемещаться в растворе в направлении соответствующего электрода и осаждаются на поверхности носителя.

4)Метод носителя на  колонке

Существует две модификации этого метода. В одной из них чёрез колонку, заполненную носителем, с помощью насоса прокачивают в направлении сверху вниз раствор фермента в режиме непрерывной циркуляции. В другом варианте метода направление потока изменено на противоположное, т. е. раствор фермента подается в нижнюю часть колонки, причем скорость потока подбирается так, чтобы частицы носителя оставались во взвешенном состоянии, образуя «кипящий слой». Метод нанесения в колонке обладает тем преимуществом, что позволяет проводить нанесение фермента, промывку, а затем и сам ферментативный процесс в одной и той же колонке без дополнительных манипуляций с носителем.[2]

2. Иммобилизация ферментов путем включения в гели

Суть этого метода иммобилизации  состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель( см. рисунок 2).

Среднее расстояние между  соседними цепями в геле меньше размера  молекулы включенного фермента, поэтому  он не может покинуть полимерную матрицу  и выйти в окружающий раствор, т. е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в  удерживание фермента в сетке  геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой  фермента и окружающими ее полимерными цепями.

Пространство между полимерными  цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть общего объема геля.

Для иммобилизации ферментов  в геле существует два основных способа.

1 способ -  Фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки.

2 способ – фермент  вносят в раствор уже готового  полимера, который затем каим  либо образом переврдят в гелеобразное  состояние. [2]

3. Иммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек (мембран)

Общий принцип, лежащий в  основе этого способа иммобилизации, состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, которая легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но представляет собой непреодолимый барьер для крупных молекул фермента (см. рисунок 3).Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой.[2]

2. Двойное эмульгирование

При иммобилизации методом двойного эмульгирования сначала готовят эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе полимера. Готовую эмульсию вновь диспергируют, но в воде. В результате получается водная эмульсиая из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие включенные капли водного раствора фермента. Через некоторое время органический раствор затвердевает, образуя полимерные сферические частицы с иммобилизованным в них ферментом.

С. Мэй и Н. Ли предложили модификацию этого способа иммобилизации, в котором в качестве материала для образования мембраны вместо водонерастворимого отверждающегося полимера используются жидкие углеводороды с большой молекулярной массой. Этот метод получил название иммобилизации путем включения в жидкие мембраны.

3) Включение в волокна

От микрокапсулирования этот способ иммобилизации отличается главным образом формой получаемых препаратов: в первом случае образуются сферические микрокапсулы, а во втором — нити. Суть состоит в том, что эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе волокнообразующего полимера (производные целлюлозы, поливинилхлорид, поли-L-метилглутамат) продавливают через фильеры в жидкость (например, толуол), вызывающую коагуляцию полимера. Полученные волокна представляют собой пористые полимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию небольших капель водного раствора фермента размером около 1 мкм. Ферментсодержащие волокна обладают высокой механической прочностью Для дополнительного повышения механической прочности волокна иногда заключают в тонкую полиамидную оболочку.

4. Включение в липосомы                                  

Существует несколько  способов получения липосом, содержащих включенный фермент. В одном из иих раствор липида (обычно лецитина) в органическом растворителе (например, в хлороформе) упаривается в вакууме, и липид остается на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят водный раствор фермента, встряхивают до полного удаления пленки липида со стенок колбы и оставляют на некоторое время. В полученной таким образом дисперсии липида происходит самопроизвольное образование (самосборка) мультиламеллярных липосом, содержащих включенный фермент. Во избежание окисления липида все операции необходимо проводить в атмосфере инертного газа.

В другом варианте метода раствор  липида в органическом растворителе наслаивают на поверхность водного  раствора фермента, после чего органический растворитель удаляют путем испарения в токе инертного газа, а образовавшуюся липидную пленку диспергируют в водном растворе. Недостаток этого способа состоит в том, что контакт с органическим растворителем может вызвать инактивацию фермента.

Для удаления невключившегося  фермента липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе. В случае моноламеллярных  липосом, получаемых путем ультразвуковой обработки, разделение проводят методом  гель-фильтрации на колонке.

Недавно был предложен  новый способ иммобилизации ферментов путем включения их в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу кратной связи. После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированного липида обычным способом, их подвергают облучению ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора. При этом происходит полимеризация мономерных молекул липида с образованием ковалентоно сшитой замкнутой липидной бислойной мембраны.

1.1.4 Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа

Отличительная черта этого  способа иммобилизации состоит  в том, что ограничение свободы  перемещения фермента в объеме системы  достигается не за счет его взаимодействия с жестким носителем (адсорбентом, гелем или мембраной), а вследствие его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной системы. Что касается субстрата и продукта ферментативной реакции, то они распределены между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного цикла процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор ( см. рисунок 4).[2]

1. Двухфазные системы типа«вода — несмешивающийся с водой органический растворитель»

В таких системах фермент  присутствует только в водной фазе, поскольку белки, как правило, нерастворимы в неполярных органических растворителях, выступающих в роли второй фазы. Объем водной фазы составляет обычно 1—2% от общего объема системы. В ходе процесса реакционную смесь осторожно перемешивают, чтобы ускорить диффузию субстрата и продукта через границу раздела фаз.

Основные недостатки этого  способа иммобилизации — низкая скорость процесса вследствие небольшой  площади поверхности раздела фаз и возможность инактивации фермента при его адсорбции на границе раздела фаз. Чтобы преодолеть это затруднение и добиться увеличения поверхности раздела, в качестве фермент содержащей фазы часто применяется крупнопористый неорганический носитель (например, пористое стекло), частицы которого  пропитаны   водным  раствором фермента.

2. Микроэмульсии

Проблема увеличения поверхности  раздела фаз может быть решена при использовании в качестве среды для ферментативных реакций микроэмульси типа «вода в масле». Методика получения ферментсодержащих микроэмульсий состоит в том, что фермент в виде водного раствора (в количестве нескольких объемных процентов от общего объема системы) или лиофилизованного порошка вносят в раствор ПАВ в неполярном органическом растворителе и энергично перемешивают в течение нескольких минут. В результате образуется полностью прозрачный гомогенный раствор, в котором молекулы фермента включены внутрь гидратированных обращенных мицелл ПАВ, или микроэмульсионных капель, причем в каждой белоксодержащей мицелле присутствует обычно только одна молекула фермента.

Ограничения, накладываемые  на скорость ферментативной реакции  диффузией субстрата и продукта, в микроэмульсиях практически отсутствуют  из-за огромной удельной поверхности  раздела между водными микрокаплями и органическим растворителем. Дополнительное преимущество таких систем состоит в том, что фермент, находящийся внутри микроэмульсионной капли, защищен от денатурирующего воздействия органического растворителя слоем молекул ПАВ. Микроэмульсии представляют собой универсальную микрогетерогенную среду для ферментативных реакций: практически все из нескольких десятков ферментов различных классов, изученных в микроэмульсионных системах, полностью сохраняют, а иногда и преобретают более высокую каталитическую активность по сравению с водным раствором.

3. Двухфазные водные системы

В основе этого способа  иммобилизации лежит тот факт, что водные растворы некоторых полимеров (полиэтиленгликоля, декстрана, поливинилового спирта и других) обладают свойством не смешиваться между собой или с концентрированным водным раствором электролита, образуя системы двухфазного типа. Обычно используемые концентрации полимеров в обеих фазах лежат в интервале от 5 до 15%. Наибольшее распространение получили системы, состоящие из несмешивающихся между собой водных растворов полиэтиленгликоля и декстрана, один из которых диспергирован в другом в виде мелких капель. Варьируя природу входящих в систему компонентов и объемное соотношение фаз, можно подобрать условия, при которых фермент и продукты реакции находятся преимущественно в разных фазах, что позволяет отделять продукты реакции от биокатализатора.

Наряду с рядом важных достоинств, к числу которых можно  отнести почти полное отсутствие диффузионных ограничений при протекании реакции, простоту приготовления и  доступность необходимых компонентов, двухфазные водные системы имеют  однако, серьезные недостатки. Главный  из них — это то, что вследствие эффектов распределения часть фермента, хотя и небольшая, всегда переносится в фазу, содержащую продукты реакции. Это приводит к загрязнению продуктов и потерям дорогостоящего катализатора. Чтобы избежать этого нежелательного явления, приходится применять дополнительные устройства, например мембранные ультрафильтры, что приводит к замедлению и удорожанию всего процесса.

2. Основные преимущества и недостатки физических методов иммобилизации

Для сравнения сводим основные преимущества и недостатки различных  способов физической иммобилизации  ферментов в таблицу 1. [3]

Таблица 1 - преимущества и недостатки физических методов иммобилизации

2. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

Главным отличительным признаком  химических методов иммобилизации является то, что путем химического воздействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи в частности между белком и носителем. [2]

Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюганта. Иными словами, при достаточно широком варьировании условий, таких, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких, как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Именно химическими методами, путем многоточечного ковалентного закрепления белковой структуры удается достигнуть наибольших эффектов стабилизации ферментов.

Речь идет о ковалентном  вшивании молекул фермента в различные типы сеток (ретикуляция фермента). Идея конструирования ферментных сеток вытекает из полифункциональной природы самой молекулы фермента, имеющей на поверхности помимо активного центра достаточно большое количество реакционноспособных групп.  При введении в раствор фермента бифункционального сшивающего агента отдельные молекулы фермента сшиваются друг с другом и образуют более или менее сложные агрегаты сетчатой структуры, в которой узлами служат сами молекулы фермента.

В зависимости от природы  и количества сшивающего реагента можно  получить как водорастворимые, так  и водонерастворимые препараты. [3]

Другой пример ретикуляции  основан на использовании ферментов, предварительно модифицированных реагентом, содержащим двойную связь. В этом случае при сополимеризации белкового макромономера с низкомолекулярными мономерами образуются сетчатые полимерные гели, сшитые белком или дополнительным сшивающим мономером. В рассматриваемой системе исходное состояние – жидкий раствор, конечное – твердое тело (гель). Сшивкой белка в объеме растворителя получают трехмерный гель в  виде крупного однородного блока, который можно механически измельчать(см. рисунок 5).

Трехмерный гель в виде мелких частиц можно непосредственно  получать эмульсионной полимеризацией. Эмульсии получают диспергированием водного раствора, содержащего мономеры, в несмешивающемся с водой органическим растворителем. Предельный вариант таких систем – микроэмульсии, или гидратированное обращеие мицеллы ПАВ в органических растворителях(см. рисунок 6). Это новое качество иммобилизации – молекулярный уровень. [3]

Процесс ретикуляции может  быть реализован не только в растворе фермента, но и при использовании  его иммобилизованных препаратов. Так  в случае фермента, предварительно иммобилизованного на химическом инертном носителе путем физической адсорбции, дополнительная обработка сшивающим агентом приведет к повышению прочности(задубливанию) препарата. Носитель здесь непосредственно не принимает участия в химической реакции – он служит лишь матрицей для организации монослоя адсорбированного фермента и обуславливает двухмерную направленность ретикуляции. Более того носитель может быть вообще удален, и таким образом, получится сшитая ферментная пленка (см. рисунок 7).

Препараты молекулярно иммобилизованных ферментов могут быть получены, если обе группы бифункционального сшивающего агента провзаимодействуют с одной  молекулой белка. В таком случае речь идет о наложении «химических  скобок», внктри молекулярно закрепляющих структуру фермента (см. рисунок 8). Исключить межмолекулярные взаимодействия можно путем перехода от гомогенных к микрогетерогенным системам с пространственно изолированными молекулами фермента, например, солюбилизацией ферментов в органическом растворителе с помощью гидротированных обращенных мицелл ПАВ.

2.1 Химическая структура ферментов и их функциональные группы

Основой любого фермента является белок, представляющий собой компактную конструкцию из одной или нескольких полипептидных цепей, ковалентно связанных дисульфидными мостиками. Помимо белка ферменты иногда могут содержать и небелковые компоненты: простетические группы неорганической и органической природы, липиды (в липопротеидах) и углеводы (в гликопротеидах). В общем случае химические методы иммобилизации нацелены на модификацию функциональных групп в белковой части молекулы фермента. Однако при выборе процедуры иммобилизации для конкретного фермента целесообразно учитывать и специфические особенности строения его молекулы.