Амилолитические ферменты. 2

CoolReferat.com

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ УКРАИНЫ

УКРАИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ХИМИКО -ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА БИОТЕХНОЛОГИИ

И БЕЗОПАСНОСТИ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ

КУРСОВАЯ РАБОТА

ТЕМА: АМИЛОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ

Выполнил………………………………………………………ст.гр.5-Ф-69

                                                                                                       Клименко Е.О.

Проверил……………………………………………профессор Лихолат Е.А.

                                                    Днепропетровск

2009 г.

СОДЕРЖАНИЕ

1.      Введение……………………………………………………………………4

2.      Общая часть ………………………………………………………………8

    2.1. Основные понятия энзимологии ………………………………………...8

2.1.1. Понятие о ферментах как о биологических катализаторах………8

2.1.2. Классификация и номенклатура ферментов……………………....8

2.1.3. Химическая природа и строение ферментов. …………………….9

2.1.4. Механизм действия ферментов и их специфичность…………….9

2.1.5. Кинетика ферментативных реакций. ……………………………..12

2.1.6. Ингибирование ферментов………………………………………...13

2.1.7.Активация ферментов………………………………………………14

2.1.8. Единицы активности ферментов………………………………….15

2.1.9. Внутриклеточная регуляция ферментативной активности……...15

2.1.10.Методы определения активности ферментов……………………16

2.1.11. Получение ферментных препаратов…………………………….19

3. Амилолитические препараты..................................................................21

3.1. Источники получения амилаз………………………………………….21

3.2. Механизм действия и свойства амилаз………………………………...21

3.3. Компьютерное моделирование структуры амилолитических ферментов……………………………………………………………….26

4. Получение микробных ферментных препаратов……………………32

4.1. Основные сведенья…………………………………………………….32

4.2. Микроорганизмы – продуценты ферментов…………………………..32

4.2.1. Микроскопические грибы…………………………………………32

4.2.2. Дрожжеподобные организмы……………………………………..34

4.2.3. Бактерии……………………………………………………………34

4.3. Производственные способы культивирования                                               микроорганизмов – продуцентов ферментов…………………………34

4.3.1. Поверхностное культивирование микроскопических

грибов……………………………………………………………………..35

4.3.2. Глубинное культивирование микроорганизмов…………………40

4.4. концентрирование ферментных растворов……………………………42

4.5. Оборудование для получения амилолитических ферментов…………43

4.5.1Назначение…………………………………………………………..43

     4.5.2.Области применения………………………………………………..43

4.5.3.Устройство………………………………………………………….44

4.5.3.1Модуль для приготовления питательной среды (МПС)………..44

4.5.3.2.Модуль стерилизационный (МС)……………………………….45

4.5.3.3.Модуль ферментационный (МФ)………………………………45

4.5.3.4.Модуль интерактивного управления (МУ) ……………………45

4.5.3.5.Выполняемые функции…………………………………………46

4.5.3.6.Примеры использования ОКА-01………………………………47

        Литература………………………………………………………………..49

                                         1. Введение

Изучение ферментов представляет особый интерес, так как эта область знания находится на стыке биологических и физических наук. С одной стороны, ферменты имеют исключительное значение в биологии. Жизнь зависит от сложной совокупности химических реакций, осуществляемых специфическими ферментами, и любое изменение деятельности ферментов может повлечь за собой серьезные последствия для живого организма. С другой стороны, ферменты как катализаторы все больше и больше привлекают внимание физико-химиков. Изучение механизма действия ферментов составляет само по себе одну из самых увлекательных областей современного научного исследования.

В настоящее время наука о ферментах  - энзимология превратилась в большую бурно развивающуюся отрасль знания с многочисленными ответвлениями, тесно связанную со многими науками, особенно с биохимией, физической химией, бактериологией, микро-биологией, генетикой, ботаникой, сельским хозяйством, фармакологией, токсикологией, патологией, физиологией, медициной и химической технологией. Кроме того, она имеет важное практическое применение в столь различных областях, как, например, пивоварение и другие бродильные производства, борьба с вредителями в сельском хозяйстве и химическая война.

Многие научные работники в различных частях света посвятили себя изучению различных энзимологических проблем; учреждены специальные институты по изучению ферментов, существует целый ряд энзимологических журналов, и по отдельным вопросам энзимологии к настоящему времени имеется обширная литература.

Иногда трудно себе представить, что энзимология возникла сравнительно недавно; зарождение этой области науки можно отнести к первой половине XIX в., но особенно бурное развитие она претерпела в течение последних 35 лет. Хотя явления брожения и переваривания были известны с незапамятных времен, первое ясное представление о ферменте, по-видимому, было дано только в 1833 г. Пайоном и Персо, когда они обнаружили в осадке, образующемся при добавлении спирта к солодовому экстракту, термолабильное вещество, обладающее способностью превращать крахмал в сахар. Это вещество, которое мы теперь называем амилазой, было названо ими диастазой (от греческого слова — разделять) благодаря его способности отделять растворимый декстрин от нерастворимой оболочки крахмальных зерен. Название «диастаза» впоследствии было распространено на все ферменты как видовое наименование.

В 1898 г. Дюкло предложил последние три буквы этого видового названия (суффикс «аза»)прибавлять к корню названия того вещества, на которое данный фермент действует. Этот принцип был положен в основу применяемой ныне номенклатуры ферментов; однако несколько названий

пищеварительных ферментов, оканчивающиеся на «ин», удержались оканчи-

вающиеся на «ин», удержались до настоящего времени. Поскольку число известных ферментов продолжает увеличиваться, в названии фермента стали указывать не только природу вещества, на которое он действует, но также и характер катализируемой им реакции (например, лактатдегидрогеназа).

Сразу же после открытия ферментов многие исследователи обратили внимание на сходство между их действием и действием дрожжей при бро-жении. Поэтому к агентам, вызывающим брожение, стали применять термин «фермент». Во второй половине XIX в. разгорелся большой спор между Либихом, придерживавшимся того взгляда, что брожение и сходные процессы обусловлены действием химических веществ, и Пастером, утверждавшим, что брожение неотделимо от жизнедеятельности клеток. Отсюда возникло разделение ферментов на «неорганизованные» и «организованные», т.е., как сказали бы мы теперь, на экстрагируемые ферменты и ферменты, функционирующие в живой клетке. Для того чтобы избежать применения этих неудобных наименований, В. Кюне  в 1878 г. ввел в употребление термин «энзим». Поскольку среди ученых имели хождение неправильные представления о причинах, побудивших Кюне предложить этот термин, мы цитируем высказывание самого Кюне:

«Таким образом, мы не намереваемся выдвигать какую-либо особую гипотезу, а только констатируем, что в дрожжах имеется что-то, что обладает той или иной ферментативной активностью. Это название, однако, применимо не только к инвертину дрожжей. Оно должно подчеркнуть, что более сложные организмы, из которых можно получить такие ферменты, как пенсин, трипсин и т. п., не столь резко отличаются от одноклеточных организмов, как это иногда принято думать».

Спор Пастера и Либиха был разрешен, после того как Бухнеру удалось получить систему ферментов, осуществляющих брожение, из дрожжевого экстракта, не содержащего дрожжевых клеток. Однако название «фермент» сохранилось в Германии до настоящего времени.

Достигнутые к концу XIX в. замечательные успехи в области стереохимии органических веществ, представляющих биологический интерес, сделали возможным изучение пределов действия ферментов, или их так называемой «специфичности». Эмилю Фишеру мы обязаны развитием представления о специфичности ферментов и о близком стерическом соответствии между ферментом и субстратом. На основании своих наблюдений над субстратами известной структуры Фишер выдвинул свое знаменитое положение о том, что фермент подходит к субстрату так, как ключ к замку. Специфичность составляет в настоящее время очень важный раздел учения о ферментах. Вследствие существования близкого соответствия между ферментом и субстратом фермент может действовать только на очень ограниченный ряд субстратов, и это является причиной существования большого числа различных ферментов. Изучение специфичности ферментов, разумеется, невозможно без выделения индивидуальных ферментов в чистом виде.

Серьезных работ по получению ферментов в чистом виде до 1920 г. не было. Большинство ранних работ по очистке ферментов было проведено Вильштеттером и его сотрудниками между 1922 и 1928 гг.. Несколько работ было проведено в течение этого периода и другими исследователями (в качестве примера можно указать опыты Диксона и Кодама по очистке ксантиноксидазы), но ни водном из этих случаев не была достигнута полная чистота. Следующим важным достижением было получение ферментов в кристаллическом виде. Первым ферментом, полученным в кристаллическом виде, оказалась уреаза, кристаллы которой получил Самнер в 1926 г.. Однако эти первые кристаллы были далеко не чистыми. За этой работой вскоре последовала серия классических работ Нортропа и его сотрудников по выделению в кристаллическом виде протеолитических ферментов. И хотя еще 20 лет назад число полученных в чистом виде ферментов было очень мало, в наше время число ферментов, полученных в чистом и кристаллическом виде, уже достигает 100, а очищенных до той или иной степени превышает 500.

Первая работа по очистке ферментов была встречена резкой критикой. Указывалось, что «нефизиологично» выделять ферменты из клетки и что ценность представляют только те методы, которые позволяют изучать ферменты в неповрежденных клетках. Позднее, когда были получены первые

белковые кристаллы, обладающие высокой ферментативной активностью, возникли сомнения относительно возможности кристаллизации самих ферментов. Предполагалось, что ферменты лишь адсорбированы на кристаллах инертного белка. Нортроп, однако, привел убедительные доказательства того, что полученные им белковые кристаллы сами являются ферментами. С тех пор были выделены в чистом виде многие ферменты, причем все они также оказались белками. Таким образом, представление о ферменте с течением времени менялось. Сначала этим словом обозначали неопределенные влияния или свойства, присущие некоторым препаратам, потом — определенные химические вещества и, наконец, специфические белки.

Главный интерес в ранний период развития энзимологии сосредоточивался на изучении ферментов пищеварения и брожения; только значительно позднее была установлена важность внутриклеточных ферментов. Фактически серьезных работ по очистке внутриклеточных ферментов до 1937 г. не было, и это несмотря на то, что сравнительно мало ферментов встречается в естественных выделениях живых клеток. Однако с 1937 г. положение полностью изменилось, и то громадное увеличение числа известных ферментов, которое мы имеем теперь, обусловлено главным образом открытием новых внутриклеточных ферментов. Это расширение наших знаний о ферментах живого вещества привело в свою очередь к значительно   более   глубокому   пониманию   механизма   многих  основных

жизненных процессов, особенно лежащих в основе жизни обменных процессов, связанных с запасанием и использованием энергии. Наши знания о таких процессах, как фотосинтез, дыхание, биологическое окисление, брожение, синтез многих необходимых для роста органических веществ, выполнение механической или осмотической работы, значительно пополнились благодаря выделению и изучению соответствующих ферментов.

Возможность получать ферменты в чистом виде позволила в последние годы предпринять их количественное изучение с помощью физико-химических методов. Учение о кинетике ферментов, в основе которого лежат классические работы Михаэлиса, начатые в 1913 г., достигло к настоящему времени значительного развития  и продолжает развиваться дальше преимущественно в направлении изучения механизма ферментативного катализа. Использование других методов, в том числе изотопных и оптических, а также химическое изучение активных групп ферментов тоже проливает свет на способ их действия.

Очистка ферментов способствовала также более глубокому пониманию их высокой специфичности, являющейся одним из наиболее характерных и важных свойств ферментов. Это свойство резко отличает ферменты от других катализаторов. Благодаря специфичности возможно существование полиферментных систем, осуществляющих цепи реакций, из которых состоят

различные обменные процессы.

Значительные успехи были достигнуты в области изучения свойств и функций ферментов. Однако в этой области предстоит еще очень большая работа: много важных ферментов еще только предстоит открыть; другие, на существование которых мы уже имеем указания, в настоящее время ожидают изучения.

Мы считаем, что в настоящее время энзимология достигла той стадии, когда в ближайшем будущем можно надеяться пожать обильные плоды всего громадного числа исследований, которые были проведены в последние годы. Особенно большие успехи достигнуты при изучении одной из самых увлекательных проблем энзимологии — механизма действия ферментов.

Наконец, никогда не следует забывать, что ферменты имеют столь большое значение вследствие того, что сама жизнь тесно связана с ферментным катализом. По необходимости развитие энзимологии происходило главным образом в направлении изучения изолированных ферментов. Только в последние годы появились возможности для развития биологической стороны предмета, а именно для изучения ферментов и ферментных систем непосредственно в живой клетке.

2. ОБЩАЯ ЧАСТЬ

2.1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ЭНЗИМОЛОГИИ

2.1.1. Понятие о ферментах как о биологических катализаторах.

Ферменты (лат. Fermentum – брожение, бродильное начало) – это специфические белки, способные во много раз ускорять биохимические реакции, протекающие в живых организмах, не входя при этом в состав конечных продуктов реакции. Т.е. ферменты (или другое их название – энзимы) являются биологическими катализаторами биохимических реакций.

Все биохимические реакции, протекающие в клетках микроорганизмов, в растительных и животных организмах, катализируются соответствующими ферментами. Переваривание, всасывание и усвоение пищевых веществ, синтез и распад белков, нуклеиновых кислот, жиров, углеводов и других соединений в тканях и клетках любого организма представляет собой совокупность ферментативных реакций. Любое функциональное проявление живого организма (дыхание, размножение и др.) обеспечивается действием соответствующих ферментных систем.

Ферменты обладают определенными свойствами, отличающих их от неорганических катализаторов: высокой субстратной специфичностью, высокой скоростью проведения ферментативной реакции, способностью ускорять реакции в физиологических условиях, т.е в условиях, характерных для жизнедеятельности клеток (соответствующая температура, реакция среды и др.)

2.1.2. Классификация и номенклатура ферментов.

В настоящее время число различных известных реакций, катализируемых ферментами, составляет более 2 тыс. и число их непрерывно возрастает. Для того, чтобы ориентироваться в этом множестве биохимических превращений, нужна некоторая систематика. Она создана Международным союзом по биохимии (International Union of Biochemistry, IUB) и рекомендована к повсеместному использованию. Согласно этой классификации все ферменты подразделяют на 6 классов в зависимости от типа катализируемых превращений:

1.Оксидоредуктазы. К этому классу ферментов относятся практически все ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.

2.Трансферазы. К этому классу относятся ферменты, катализирующие различные превращения, представляющие собой перенос радикала от молекулы-донора к молекуле-акцептору и не являющиеся процессом гидролиза. В общем виде эти превращения можно записать так:

XY + Z X + YZ   (X, Z H2O или OH-)

3. Гидролазы – ферменты, катализирующие разнообразные реакции гидролиза. Подклассы в этом классе выделяют в соответствии с типом гидролизуемых связей.

4. Лиазы. Ферменты этого класса катализируют в одном направлении гидролитическое расщепление субстрата с образованием кратной связи или, реже, цикла, а в другом направлении – присоединение по кратной связи.

5. Изомеразы – это ферменты, катализирующие различные процессы изомеризации.

6.Лигазы (синтетазы). Этот класс составляют ферменты, катализирующие реакции конденсации или присоединения, сопряженные с гидролизом одной из пирофосфатных связей в молекуле АТФ или ГТФ.

2.1.3. Химическая природа и строение ферментов.

Все ферменты – белки, имеющие, как и другие белки, первичную, вторичную, третичную и часто четвертичную структуру.

Ферменты могут быть как простыми, так и сложными белками. Молекулы ферментов, представляющие собой простые белки, целиком построены из полипептидных цепей и при гидролизе распадаются только на аминокислоты. Примером ферментов такого рода являются гидролитические ферменты пепсин, трипсин, уреаза, лизоцим и др. Большинство природных ферментов относится к сложным белкам, содержащих в составе своей молекулы помимо полипептидных цепей небелковый компонент. Как белковая часть такого сложного фермента (апофермента), так и небелковый компонент его молекулы (кофермент) в отдельности лишены ферментативной активности. Только соединившись вместе и образовав так называемый холофермент (полный фермент), они приобретают свойства, характерные для биокатализаторов. В роли коферментов могут выступать различные соединения. Так, ряд коферментов является производными витаминов. По химическому строению многие коферменты представляют собой нуклеотиды, некоторые – органические производные фосфорной кислоты или пептиды и их производные (например, фолиевая кислота, глутатион, КоА). Таким образом, между ферментами, нуклеотидами и витаминами существует определенная функциональная связь.

2.1.4. Механизм действия ферментов и их специфичность.

Для объяснения механизма действия ферментов было предложено много теорий. Все они исходят из экспериментально установленного факта, что биокатализаторы, так же как и неорганические катализаторы, не могут сделать возможным протекание процессов или реакций, которые с точки зрения термодинамики невозможны. Все теории катализа допускают, что катализаторы тем или иным путем снижают энергию активации катализируемой реакции и таким образом резко увеличивают скорость химического превращения.  Катализаторы  лишь  сокращают  время, необходимое для достижения  химической  реакцией  состояния  подвижного

равновесия. Состояние подвижного равновесия обратимой химической реакции в присутствии катализатора становится стационарным. Следовательно, при наличии катализатора в равной мере возрастает скорость как прямой, так и обратной реакции.

              Начало современным представлениям о механизме действия ферментов было положено работой Михаэлиса и Ментен, опубликованной в 1913 г. В этой работе впервые высказывалась идея о том, что основой действия ферментов является образование фермент-субстратного комплекса, который затем распадается с образованием продуктов ферментативной реакции и освобождением фермента в исходном состоянии.

              В процессе образования и превращениях фермент-субстратных  комплексов принято различать несколько стадий:

              1. Присоединение молекулы субстрата к ферменту.

              2. Последовательное превращение первичного фермент-субстратного комплекса в один или несколько активированных комплексов.

              3. Отделение конечных продуктов реакции от фермента.

              Специфичность, которую проявляют ферменты в отношении субстрата как при образовании фермент-субстратного комплекса, так и при каталитическом химическом превращении, обусловлена существованием в молекуле фермента специфического участка, называемого активным центром. Та часть активного центра, которая принимает непосредственное участие в каталитическом действии, получила название каталитического участка, а место, где осуществляется связывание фермента с субстратом, - контактного участка, или контактной площадки.

              К 80-м гг. 20 в. был идентифицирован аминокислотный состав активных центров многих ферментов. В активный центр фермента могут входить аминокислотные остатки, сравнительно далеко отстоящие друг от друга в полипептидной цепи и сблизившиеся в результате ее ”перекручивания” при образовании вторичной и третичной структур ферментного белка. Так, в молекуле химотрипсина (протеолитического фермента животного происхождения) в состав активного центра входят остаток гистидина, находящийся в полипептидной цепи в положении 57, остаток серина в положении 195 и остаток аспарагиновой кислоты  в положении 102.

              Расположение аминокислотных остатков, формирующих контактный участок в молекуле фермента, способствует такому пространственному размещению субстрата, которое наиболее благоприятно для его атаки каталитическими (функциональными) группами активного центра. Например, реакция А + В АВ, катализируемая соединениями, имеющие активные группы С, D и Е, в обычных условиях должна была бы происходить только в том случае, если бы одновременно столкнулись все пять реагентов. Вероятность такого столкновения ничтожно мала, поэтому скорость образования продукта реакции АВ в этом случае практически равна нулю. В  том  случае,  когда  эту  реакцию  катализирует  фермент,  требуется

только его взаимодействие с веществами А и В, поскольку группы  С, D и Е уже включены в состав молекулы фермента. В результате эффекта близости реакционных групп в молекуле скорость катализируемой ферментом реакции увеличивается на несколько порядков. Кроме того, когда субстрат присоединяется к активному центру фермента, пространственная конфигурация молекулы субстрата изменяется и определенные химические связи в ней ослабевают.

              Каталитическая активность фермента определяется структурой его молекулы в целом. Другие аминокислотные остатки, помимо входящих в активный центр, необходимы для формирования и стабилизации определенной конформации активного центра. Они также образуют участки, с которыми специфически взаимодействуют различные вещества, регулирующие активность фермента. В молекуле фермента имеются такие участки, за счет которых он может взаимодействовать с другими ферментами (при образовании мультиферментных комплексов) или белками мембран (мембранные ферменты).

              Важнейшим свойством ферментов является их субстратная специфичность, т.е. способность не только ускорять реакции, но и избирательно катализировать лишь определенный путь превращения конкретного вещества – субстрата.  По признаку специфичности действия все ферменты можно разделить на две группы:

1.      Ферменты, обладающие абсолютной специфичностью.

2.      Ферменты, обладающие относительной  специфичностью.

Абсолютная специфичность проявляется тогда, когда фермент действует лишь на одно единственное вещество и катализирует только определенное превращение этого вещества. К абсолютной специфичности относят также стереохимическую (оптическую) специфичность. В живой природе встречаются лишь определенные пространственные формы соединений: аминокислоты в белках – только L-ряда, сахара – преимущественно D-ряда. Ферменты всегда действуют только на один из двух оптических изомеров вещества (L- или D-изомер). Специфичность ферментов может быть направлена и на другие типы стереоизомеров. Так, ферменты, действующие на транс-изомер, обычно неактивны в отношении цис-изомера того же вещества.

Наряду с ферментами, которым свойственна абсолютная специфичность, имеется большая группа ферментов, обладающих относительной или групповой специфичностью. Например, пепсин (протеолитический фермент животного происхождения) катализирует расщепление белковых молекул, которые могут существенно различаться друг от друга как по аминокислотному составу, так и по физико-химическим

свойствам. Объясняется это тем, что местом действия пепсина является пептидная связь – CO – NH – .

2.1.5. Кинетика ферментативных реакций.

Скорость ферментативной реакции зависит прежде всего от природы фермента, который может обладать низкой или высокой ферментативной активностью, а также от концентрации субстрата, величины рН среды, температуры, присутствия ингибиторов или активаторов и др.

Установлено, что при прочих равных условиях и при наличии избытка субстрата начальная скорость ферментативной реакции пропорциональна концентрации фермента.

Зависимость между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции графически можно выразить кривой, показанной на

рисунке 2.1.

Рис. 2.1. График, выражающий зависимость между скоростью ферментативной реакции (V) и концентрацией субстрата (S) при постоянной концентрации фермента: отрезок абсциссы Км соответствует константе Михаэлиса (концентрация субстрата, при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной – Vмакс).

              Скорость реакции, соответствующая восходящей части кривой, пропорциональна концентрации субстрата (S); в верхней части кривой скорость реакции приближается к максимальному значению (Vмакс) и почти не зависит от концентрации субстрата.

              Исходя   из   представлений   об   образовании   фермент-субстратных

комплексов в ходе ферментативной  реакции Михаэлис и Ментен рассчитали весьма важную константу, позже названную константой Михаэлиса (Км), которая в числовом выражении равна той концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость реакции составляет половину максимальной (т.е. когда в любой момент в комплексе с субстратом находится и половина молекул фермента).  Таким образом, Км является мерой сродства между ферментом и субстратом, причем низкие величины Км свидетельствуют о высокой степени такого сродства.

              Существует еще одна величина, характеризующая ферментативную реакцию, которая получила название ”число оборотов фермента”. Величина это показывает, сколько молекул субстрата превращается в продукты реакции за единицу времени в расчете на одну молекулу фермента.