Aspergillus terreus — продуцент ітаконової кислоти

МІНІСТЕРСТВО  ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ  УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ 
 
 
 
 
 

Кафедра біотехнології мікробного синтезу 
 
 
 
 
 
 

РОЗРАХУНКОВО-ПОЯСНЮВАЛЬНА ЗАПИСКА 

до курсової роботи з дисципліни 

«Загальна мікробіологія та вірусологія» 
 
 
 
 
 
 
 
 

Виконав студент групи БТЕК - III - 1    Донець О.С. 

Керівник, к. т. н.                   Пінчук Ю.М. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Київ-2009

РЕФЕРАТ 

     Дана  курсова робота виконана згідно отриманого завдання. Структура курсової роботи відповідає вимогам щодо порядку  оформлення курсових робіт, вказаних в «Методичних вказівках до виконання курсової роботи» (№ 6501).

      Курсова робота викладена на 30 сторінках, включає 9 рисунків, 4 таблиці, 10 літературних джерел.

     У загальній частині  курсової роботи представлена характеристика Aspergillus terreus – продуцента ітаконової кислоти.

     У розрахунково-графічній частині  містяться розв’язки розрахунково-графічних завдань курсової роботи.

     У розділі «Визначення показників швидкості росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів» розраховані показники росту мікроорганізмів при періодичному культивуванні.

     У розділі «Поживні середовища для  вирощування мікроорганізмів» проаналізовано склад поживного середовища і  придатність його для вирощування мікроорганізмів, розраховано теоретично можливий рівень біомаси за кількістю азоту і вуглецю, що містяться в поживному середовищі.

     У розділі «Енергетичний баланс окиснення субстрату» проведено аналіз енергетичного балансу окислення глюкози за заданих умов.

     Ключові слова: Aspergillus terreus, ітаконова кислота, лаг-фаза, цис-аконітова кислота, поживне середовище, гліколіз, субстрат. 
 
 
 
 
 
 
 

     ЗМІСТ 

Вступ…………………………………………………………………….……………....4

1. Загальна частина..........................................................................................................7

     1.1.Обґрунтування вибіру біологічного агента……………………………………7

     1.2. Характеристика біологічного агента Aspergillus terreus продуцента

                        ітаконової кислоти ….…………………………….……………...……………….…..9

      2. Розрахунково – графічна частина............................................................................14

           2.1.Розділ 1. “Визначення показників росту при періодичному культивуванні

           мікроорганізмів” ………………………………………………………………......15

           2.2. Розділ 2. “Поживні середовища для вирощування

      мікроорганізмів” …………………………………………………………………….. 19

         2.3. Розділ 3.  “Енергетичний  баланс окиснення субстрату”…………...............25

      Висновки………………………………………………………………………….…...29

      Список  використаної літератури…………………………………………………….30 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Вступ

     Міжнародними експертами в галузі біотехнологічних  наукових досліджень, інтелектуальної власності та економічної політики на Всесвітньому біотехнологічному форумі було одностайно визнано, що людство в ХХI ст. завдяки сучасним біотехнологіям отримало надзвичайні можливості щодо вирішення соціальних проблем, пов’язаних з харчуванням  зростаючого населення планети, підтримкою здоров’я людини і навколишнього середовища,  поповненням джерел енергії та природних ресурсів.

     Фундамент сучасної біотехнології було закладено ще 6 – 8 тисяч років тому, коли людина інтуїтивно почала використовувати процеси бродіння у виробництвві хліба, пива і вина. Біотехнологія на сучасному етапі, а також на багато десятиріч вперед визначає науково-технічний прогрес і рівень життя людей. Вона є не тільки наукою, але і сферою діяльності людини, яка, використовуючи біологічні процеси, що протікають в живих організмах і системах, переносить їх на виробництво для отримання украй необхідних органічних речовин, і відтворення тих біологічних ефектів, які не створені природою. Вихідним матеріалом для роботи служать: клітини мікроорганізмів; клітини, органи і тканини тварин, рослин і людини; віруси, позаклітинні продукти та іммобілізовані клітини організмів, їх компоненти та позаклітинні продукти. З кожним днем збільшується кількість досліджених мікроорганізмів, а також сполук, які вони синтезують за тих чи інших умовах культивування.

     Стан  біотехнологічної галузі потребує великої  уваги з боку держави, тому що роль сучасної біотехнології є вирішальною для становлення економіки України, розвиток котрої базується на впровадженні високотехнологічних виробництв. Залучення біотехнологічних розробок уможливлює розв’язання актуальних завдань сучасної медицини, сільського господарства, фармакології, екології, низки галузей промисловості.[4]

     Біотехнологічні процеси з використанням мікроорганізмів  і ферментів уже на сучасному технічному рівні широко застосовують у харчовій промисловості. Промислове вирощування мікроорганізмів використовують для одержання багатьох цінних сполук - ферментів, гормонів, амінокислот, вітамінів, антибіотиків, метанолу, органічних кислот (оцтової, лимонної, молочної) і т.д. За допомогою мікроорганізмів проводять біотрансформацію одних органічних сполук в інші (наприклад, сорбіту у фруктозу). Широке застосування в різноманітних виробництвах одержали іммобілізовані ферменти. Для виділення біологічно активних речовин зі складних сумішей використовують моноклональні антитіла. А. С. Спіріним у 1985-88 розроблені принципи безклітинного синтезу білка, коли замість клітин застосовуються спеціальні біореактори, що містять необхідний набір очищених клітинних компонентів. Цей метод дозволяє одержувати різні типи білків і може бути ефективним у виробництві. Багато промислових технологій заміняються технологіями, що використовують ферменти і мікроорганізми. Такі біотехнологічні методи переробки сільськогосподарських, промислових і побутових відходів, очищення і використання стічних вод для одержання біогазу і добрив. У ряді країн за допомогою мікроорганізмів одержують етиловий спирт, що використовують як пальне для автомобілів (у Бразилії, де паливний спирт широко застосовується, його одержують із цукрового тростняку й інших рослин). На спроможності різноманітних бактерій переводити метали в розчинні сполуки або накопичувати їх у собі заснований метод виділення багатьох металів із бідних руд або стічних вод.

     Внесок  біотехнології в сільськогосподарське виробництво полягає в полегшенні традиційних методів селекції рослин і тварин і розробці нових технологій, що дозволяють підвищити ефективність сільського господарства. У багатьох країнах методами генетичної і клітинної інженерії створені високопродуктивні і стійкі до шкідників, хвороб, гербіцидів сорти сільськогосподарських рослин. Розроблена техніка оздоровлення рослин від накопичених інфекцій. Як одна з найважливіших проблем біотехнології у усьому світі широко досліджується можливість керування процесом азотфіксації, у тому числі можливість уведення генів азотфіксації в геном корисних рослин, а також процесом фотосинтезу. Ведуться дослідження з поліпшення амінокислотного складу рослинних білків. Розробляються нові регулятори росту рослин, мікробіологічні засоби захисту рослин від хвороб і шкідників, бактеріальні добрива. Геноінженерні вакцини, сироватки, моноклональні антитіла використовують для профілактики, діагностики і терапії основних хвороб сільськогосподарських тварин. У створенні більш ефективних технологій племінної справи застосовують геноінженерний гормон росту, а також техніку трансплантації і мікроманіпуляцій на ембріонах домашніх тварин. Для підвищення продуктивності тварин використовують кормовий білок, отриманий мікробіологічним синтезом. 
 

     

 

  1. Загальна частина
    1. Обґрунтування вибору біологічного агента

     Ітаконова кислота синтезується пліснявими грибами роду Aspergillus, зокрема А. іtасопісиs і А. terreus. Промислове виробництво базується на використанні А. terreus (наприклад штам ЕУУ-417). Утворення ітаконової кислоти з вуглеводних джерел пов'язане з ЦТК, її попередником є цис-аконітова кислота (Див. рис.1).

    Виробництво ітаконової кислоти було налагоджено  в 60-х роках минулого століття. Для  її синтезу використовують Aspergillus terreus  який має ряд переваг :

  1. А. terreus - є більш вивченим за інші продуценти.
  2. Процес синтезу ітаконової кислоти грибом А. terreus відбувається  в ферментерах ,які не потребують особливих допоміжних засобів .
  3. А. terreus в основному ростуть на доступному середовищі(меляса) .
  4. Хімічний синтез є складнішим та економічно не вигіднішим ніж мікробіологічний. 

    Технологічний процес одержання ітаконової кислоти подібний до виробництва лимонної кислоти, оскільки ферментацію продуцента здійснюють поверхневим або глибинним способом.

    Поверхневе  вирощування продуцента здійснюють у кюветах, глибинне — у ферментаторах, обладнаних мішалками і барботерами.

    Ітаконова кислота у концентрації 7 % інгібує  ріст продуцента, тому у процесі біосинтезу необхідна її нейтралізація. Для цього найчастіше використовують гідроксид амонію, з допомогою якого підтримують рН середовища на рівні 3.8, в результаті чого синтезується до 150—200 г/л цільового продукту. Активаторами біосинтезу ітаконової кислоти є катіони магнію, міді і цинку.

    Вихід ітаконової кислоти за поверхневим  культивуванням досягає 36— 38 % у перерахунку на 100 г спожитої глюкози, за глибинним — 65 % і вище.

    Після закінчення ферментації міцелій  сепарують, промивають, віджимають і передають у збірник відходів; культуральну рідину освітлюють активованим вугіллям, упарюють приблизно до 1/10 первинного об'єму і передають на кристалізацію ітаконової кислоти. Кристали кислоти центрифугують, ви сушують і фасують. Додатково очищати кислоту можна перекристалізацієк з 25 %-х водних розчинів.

    Ітаконову кислоту використовують у хімічному  синтезі високоякісних смол, волокон типу «нітрон», детергентів, лікарських речовин, барвників і інших органічних сполук. [6] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    1. Характеристика  біологічного агента

      Положення грибів серед живих  організмів. Нині серед мікологів загальновизнаною є концепція про існування п'яти царств живих організмів, запропонована у 1969 р. Р. Уіттейкером. За уявленнями Р. Уіттейкером, два примітивних царства — прокаріотичних організмів (Ргосагуоtа), які характеризуються відсутністю ядерної мембрани як основної відмінної ознаки, та найпростіших (Ргоtіstа) одноклітинних організмів, які мають ядро з ядерною мембраною та характеризуються авто- та гетеротрофним типом живлення, є вихідними формами еволюції і виникнення відособлених трьох класів багатоклітинних організмів — рослин (Рlantae), тварин (Аnimalia) і грибів (Fungi). Отже, згідно з цією концепцією, гриби мають статус окремого царства органічного світу. У систематиках, опублікованих у 90-х рр. XX ст. (Д.Л. Хоуксворт, 1995 р.; Л. Маргеліс та К.В. Шварц, 1997 р.; Т. Кавалір-Сміт, 1998 р.), гриби також виділені в окреме царство. Мікологи вважають, що визнання факту незалежності грибів від царства рослин і тварин є одним з найважливіших досягнень загальної біології середини та кінця XX ст.

     За систематикою 70-80 років ХХ ст. гриб Аspergillus terreus відноситься до відділу Eumуcota, класу Аscomicetes , сімейства аспергілових (Аspergillaceae), роду Аspergillus.

     За систематикою Т.Кавалір-Сміта (1998р.) Аspergillus terreus відноситься до підцарства Neomycota, відділу Ascomycota, класу Аscomicetes, сімейства аспергілових (Аspergillaceae), роду Аspergillus

    За  сучасною філогенетичною систематикою:

походження - Клітинні організми 
   › Надцарство -
Eukaryota 
       ›Царство -
Fungi 
         ›Підцарство
Dikarya 
           › Відділ -
Ascomycota 
             › Підвідділ -
Pezizomycotina 
               › Клас -
Eurotiomycetes 
                 ›Підклас -
Eurotiomycetidae 
                   › Порядок -
Eurotiales 
                     ›Родина -
Trichocomaceae 
                        ›Рід - Aspergillus 
                           ›Вид - Aspergillus terreus[10]
 
 
 

      Морфолого-культуральні ознаки. Колонії коричневих або помаранчево-коричневих відтінків. Вони ростуть досить швидко, обмежені чи широко розкриті, 3,5-5см в діам., плоскі або з помітними дрібними радіальними борозенками, низькі, оксамитові, іноді пухнасті, клочковатие, зазвичай з тонким краєм, з численними конідіальними головками , що додають колонії характерний вигляд, коричнево-темно-жовті, глинисто-коричневі, горіхові    Рис.3. Морфологічні особливості    або деревно-коричневі, рідше помаранчево-  г-верхня частина конідієносця         коричневих  відтінків, що наближаються до

д-конідії                            брудно-помаранчевим (рис.2). Конідіальні головки колонковидні, дуже щільні, компактні, однакової товщини по всій довжині, досить варіабельні, 150-500 х 30-50 мкм. Конідиеносці більш або менш звивисті,безбарвні, 100-250 х 4,5-6 мкм, з гладкими оболонками; апікальні розширення  полушаровидне або куполоподібні, 10-16 мкм в діаметрі. Стерігми двоярусні : базальні - щільні, паралельні, 5-7 х 2-2,5 мкм; другого ярусу - тісно скупчені, по 2-3 на кожній з базальних стерігм, 5,5-7,5 х 1,5-2 мкм . Конідії кулясті або слабоеліптичні, звичайно 1,8-2,4 мкм в діаметрі., з гладкими оболонками.( рис.3) Запах дуже слабкий або відсутній.

       Виділено з грунтів, повітря,  рослинних залишків, харчових продуктів,  промислових матеріалів і виробів.  Загальне поширення: космополіт.

     Представники  А. terreus- звичайні компоненти агробіоцеінозів, можуть контамінувати різні харчові продукти (зернові, фрукти, овочі і т.д.) і промислові вироби в умовах підвищеної вологості. В регіонах тропічної та субтропічної зон, особливо в лісових грунтах. Зростає при різних температурах, але більш швидке та обільний ріст відмічений при 33,5-37,0°С. [1]

     Мешканці  грунтів, рослинних залишків; контамінують харчові продукти, промислові матеріали, вироби і конструкції. Продуценти органічних кислот, антибіотиків, токсинів. Патогенні для комах ,тварин і людини.

     А. terreus- один з найбільш активних цеплюлозоруйнуючих грибів, але здатний гідролізувати пальмову та кокосову олію, а також продукувати амілазу, ліпазу, метілестеразу та деполімеразу на різних субстратах рослинного походження, викликаючи їх деградацію. А. terreus на тирсі продукує целлобіазу, екзоглюкозідазу і ендоглюконазу, активність яких залежить від умов культивування.

     Знайшов широке застосування в промисловості  як продуцент ітаконовой кислоти, хоча при відповідній регуляції метаболізму  виділяє ще ряд органічних кіслот: лимонну, цис-аконітову, α-кетаглутарову, итатартарікову . Штами його легко мутують і піддаються направленому впливу при отриманні особливо активних продуцентів.

     Може  поселятися на різних кремнієвмісних  і металевих матеріалах, викликає поступове руйнування їх поверхні, що, очевидно, пояснюється здатністю до надсинтезу органічних кислот в екстримальних умовах. Електронно-мікроскопічні дослідження поверхні клітинної оболонки А. terreus показали, що ультроcтруктурна організація її змінюється в залежності від субстрату культивування. Клітини міцелію, вирощеного   на розчинних  субстратах ( глюкози, Na-КМЦ) в логарифмічній фазі зростання мають гладку поверхню. При рості на твердому нерозчинному субстраті (соломі) клітини секретірують речовину  полісахаридної природи, утворюють не поверхні густу фібрилярну сітку.

     З усіх числених його різновидів в даний  час визнають тільки дві – А. terreus var.aureus  и A. terreus var. Africanus.

     Ознаки  для розпізнавання різновидів А. terreus

1 A. terreus var. Africanus. Від основного виду відрізняється тим, що зростає швидше і широко при 24-26 ° С, утворює щільний субстратний міцелій і склероціеоподібні структури, що надають колонії характерний вигляд.

2 А. terreus var.aureus.   Виділення цієї форми засновано на зміні кольору колонії в період її формування. [1] 

    Особливості розмноження. Для Аspergillus terreus характерним є безстатеве розмноження – за допомогою конідій. Часом зустрічається статевий процес. На рис. 4 показано процес безстатевого (за допомогою конідій) та статевого розмноження у вищих грибів — аскоміцетів. За статевого розмноження на міцелії утворюються гаметангії 2, які складаються з антеридія (містить "+" – ядра, чоловіча статева клітина) та аскогонія (містить "-" – ядра, жіноча статева клітина). В аскогонії ядра з'єднуються попарно, але не зливаються. Із заплідненого аскогонія утворюються аскогенні двоядерні гіфи 3, а пари ядер піддаються мітозу, за якого реплікуються нові парні хромосоми. Далі в кінчиках аскогенних гіфів 4 відбувається каріогамія, після чого диплоїдні ядра піддаються мейозу. В результаті утворюються вісім гаплоїдних ядер, які розвиваються в аскоспори і розміщуються в аску 4. Одночасно аски, вміщені в міцеліальні гіфи, перетворюються в аскокарп 5. Аскокарп розпадається на окремі аски, які містять вісім аскоспор. Аскоспори проростають, утворюючи новий міцелій.[7]

                

Рис.4. Статевий процес

      Фізіолого-біохімічні ознаки. За типом живлення Aspergillus terreus є хемоорганогетеротрофом. Він є облігатним аеробом і не може існувати без кисню, джерелом якого є атмосферне повітря. Важливе значення для процесів життєдіяльності грибів має рН. Для більшості оптимальним є рН 3,0 – 4,0 . Залежно від рН можуть змінюватися культуральні та морфологічні ознаки: забарвлення середовища і колоній, характер росту міцелію, розміри  та форма органів розмноження, впливає на фізіологічну активність грибів. В ході культивування рН може змінюватися завдяки виділенням з клітини метаболітів і ферментів. Оптимальна температура росту для грибів Aspergillus terreus складає 25 – 35 С. Для грибів є характерним вплив світла на ріст міцелію, спороутворення, метаболічні та інші морфологічні процеси грибів. Пряме світло інгібує ріст грибів. Чергування  освітлення і темряви стимулює ріст. При цьому спостерігаються деякі періоди адаптації при переході  від росту при освітленні до росту в темноті і навпаки. Світло теж впливає на синтез нуклеїнових кислот, білка, компонентів клітинної оболонки і пігментів. Світло різного спектрального складу  по різному впливає на ріст і спороутворення різних грибів. Гриби є досить стійкими до дії радіації, але певні дози іонізуючого та УФ випромінювання можуть викликати мутації.[7]

  1. Розрахунково – графічна частина
 

    2.1. Розділ 1«Визначення показників швидкості росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів»

Завдання 1. Визначити (рис. ):

- швидкість росту (µ) між 24 та 32 год. культивування;

- рівень біомаси;

- економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація сахарози в середовищі становить 0.09М;

- тривалість лаг-фази.

                                                                                                   

Рис.5. Крива росту бактеріальної популяції 

     Визначення  основних параметрів кривої росту (концентрації біомаси, швидкості росту та тривалості лаг-фази) наведено на рис.6, 7.

     Швидкість експоненційного  росту – це міра швидкості росту клітин в експоненційній фазі. Її визначають за формулою

     

                 

де lg e = 0,43429.

                           

     Рис.6. Параметри росту: А – біомаса; Б – швидкість росту; В – тривалість лаг- фази 

     Згідно  з умовою t = 32 а t0 = 24 год. Визначаємо за графіком (див. рис. 7) концентрацію біомаси у момент часу t та t0: Хt = 4 г/л; Х0 = 2,8 г/л.

     Отже,

µ = (ln 4-ln 2,8)/(32-24)=0,046 год-1

     Рівень  біомаси (концентрація біомаси) – це різниця між максимальною (у стаціонарній фазі росту) та вихідною біомасою бактерій:

      Х=Хмакс – Х0 .

     Цю  величину виражають у граммах (міліграмах) сухої речовини, яка міститься у літрі (мілілітрі) культуральної рідини або клітинної суспензії.

     Згідно  з наведеним графіком вихідний рівень біомаси становить 0,33 г/л, а рівень біомаси у стаціонарній фазі росту – 8,0 г/л. Отже, згідно з наведеним рівнянням концентрація біомаси становить 8,0-0,33=7,67(г/л ).

     Економічний коефіцієнт. Важливим показником періодичного процесу є відношення концентрації біомаси до кількості спожитого субстрату – Х/S. Якщо ці дві величини виражені у вагових одиницях, як в нашому завданні, то відношення Х/S називають економічним коефіцієнтом (Y). Якщо врожай у грамах відноситься до кількості молей спожитого субстрату, то отриману величину називають молярним економічним коефіцієнтом.

     Згідно  з умовою, початкова концентрація сахарози в поживному середовищі (S) становить 0,09М або 0,09×342=30,78 г/л. Рівень біомаси – 7,67 г/л. Отже, економічний коефіцієнт Y=Х/S = 7,67/30,78 =0,249 або 24,9%.

     Тривалість  лаг-фази визначають як проміжок часу між моментом tr, в який культура досягла певної біомаси Хr, і моментом часу tt, в який вона могла б досягти такої ж біомаси, якби одразу ж після інокуляції починався експоненційній ріст. 

Рис. 7.  Розрахунок тривалості лаг-фази

     Для визначення тривалості лаг-фази на кривій росту (рис. 7) проводимо теоретичну пряму, паралельно тій частині кривої, що відображає експоненційний ріст культури. Тривалість лаг-фази визначають за формулою

 Т = t - (ln Хr – ln Х0)/ µ ),

 де

 µ =(ln Хr – ln Хt)/( tr – tt).

     За  умовою Х0 = 0,33 г/л; приймають Хr таким, що дорівнює 2 г/л. На реальній та теоретичній кривій визначають час tr та tt потрібний для досягнення 2,0 г/л біомаси: tr =19,0 год , а tt =10,0 год .

     Розрахуємо  швидкість росту в період даного проміжку часу, при умові, що

Хt=0,6 г/л , Хr=2,0 г/л Отже, швидкість  росту:

µ = (ln 2,0 – ln 0,6)/(19,0-10,0)=0,134 год-1;

     Знаючи  швидкість росту на даному проміжку, розраховуємо тривалість лаг-фази: Т =19,0– ((ln 2,0 – ln 0,33)/0,134) =7,66 год.

     Отже, тривалість лаг-фази становить 7,66 год.

     Завдання 2. Визначити константу швидкості поділу (v) та тривалість генерації(g), якщо початкова концентрація клітин становить 104, а через 8 год–109

     Бактерії  розмножуються бінарним поділом, тому їхня кількість збільшується в геометричній прогресії: 2º→2¹→2²→2³→… 2ⁿ.

     Якщо  на одиницю об’єму періодичної культури, що росте, припадає N0  клітин, то після n  поділів кількість клітин стане N0×2ⁿ. Логарифмуючи, отримаємо: lg N= lg N0+ n×lg2, звідки кількість клітинних поділів:

            n= (lg N- lg N0) / lg2.

     Кількість клітинних поділів за 1 год. (константа швидкості поділу v ) визначають за формулою:

v= n / t = (lg N- lg N0) / lg2×(t- t 0).

     Тривалість  генерації (час, необхідний для одного циклу поділу) визначають за  формулою:

g= t / n = 1/ v.

     Якщо  за 8 годин кількість клітини у середовищі збільшується з 104  до 109, то константа швидкості поділу

     v= (lg109 -lg104) / 0,3010×8 = 2,08 год-1.

     Тривалість генерації g=1/ 2,08=0,48 год 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Aspergillus terreus — продуцент ітаконової кислоти