Биопленки: локализация, структура, роль в патологии человека

Министерство образования и науки Российской Федерации

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Челябинский государственный университет»

Биологический факультет

Кафедра микробиологии

Курсовая работа по микробиологии

Биопленки: локализация, структура, роль в патологии человека

Челябинск

2012

Оглавление

Введение

Несмотря на различия в определении понятия «биопленки» (biofilms), формулируемого разными авторами, у этих форм существования микроорганизмов можно отметить специфические особенности, которые позволяют классифицировать их как пространственно и метаболически структурированные сообщества микроорганизмов, заключенные во внеклеточный полимерный матрикс и расположенные на границе раздела фаз.

Как правило, биопленки формируются в проточных системах, содержащих необходимые для роста субстраты.

По современным представлениям, 95-99% микроорганизмов в природных местах обитания существуют в виде биопленок.

Длительное время (со времен Р.Коха, широко применявшего метод культивирования на твердых средах) в микробиологии господствовала парадигма «чистых культур», благодаря которой были достигнуты впечатляющие успехи в изучении микробного разнообразия и в совершенствовании методов классификации. Однако такой подход не всегда способствовал изучению микробной экологии и, в частности, вклада микроорганизмов в биогеохимические процессы in situ.

Смена парадигмы наметилась лишь в середине прошлого века с появлением работ К.Зобелла, обратившего внимание на важность взаимодействия микроорганизмов с поверхностями раздела фаз. А сама идея, что микроорганизмы существуют в природе, главным образом, в виде структурированных сообществ, а не индивидуальных, свободно плавающих («планктонных») клеток была сформулирована Дж.Костертоном.

Однако наиболее четкую формулировку новой парадигмы дал Г.А.Заварзин, констатировав смену исследовательских подходов к биологическим объектам, а именно, переход от редукционизма к холизму (философии целостности), т.е. к восприятию их как целостных, совместно эволюционирующих систем.

В результате узкий взгляд на микроорганизмы как на одноклеточные формы жизни сменяется все большим осознанием их способности функционировать в составе многоклеточных сообществ.

Биопленки являются одним из видов микробных консорциумов, играющих важнейшую роль в биосферных биогеохимических процессах. Одними из главных факторов, определяющих процессы круговорота биогенных элементов, является молекулярный кислород, подавляющий процессы азотфиксации, денитрификации, восстановления сульфатов и металлов, а также метаногенез. Микроорганизмы, особенно прокариоты, в связи с отсутствием внутриклеточной изоляции аэробных и анаэробных процессов, вынуждены искать выход в формировании ассоциаций с другими микроорганизмами, которые позволяют находить защиту от вредных последствий воздействия кислорода и, особенно, его активных форм. В этом одна из причин того, что в природе микроорганизмы существуют в основном в виде структурированных сообществ. Биопленки защищают населяющие их микроорганизмы не только от кислорода, но и от последствий других вредных воздействий окружающей среды. В соответствии с приведенным определением биопленки являются микробными сообществами, формирующимися на поверхности раздела фаз. В настоящее время детально исследованы только биопленки, развивающиеся на границе жидкой и твердой сред.

Цель моей курсовой работы – рассмотреть общие вопросы, касающиеся строения, жизнедеятельности биопленок и их значения. При написании курсовой работы ставились следующие задачи:

1.      изучить строение биопленок

2.      изучить этапы и механизмы формирования биопленок

3.      описать взаимоотношения между компонентами биопленок

4.      изучить значение биопленок для экологии, биотехнологии и в патологии человека

Глава 1. Общие представления о структуре биопленок

1.1. Строение биопленок

Основные наиболее исследованные виды биопленок, формирующиеся на границе твердой и жидкой фаз, имеют следующие морфотипы (Приложение 1):

-  Простой слой клеток, сформированный одним или несколькими видами микроорганизмов, без выраженной морфологической дифференциации (выделяют только внутреннюю и наружную части) – самый примитивный тип биопленок [1]. Такие пленки описаны для бактерий родов Citrobacter, а также для дефектных по ауторегуляции Pseudomonas aeruginosa

-  Маты фотосинтезирующих, метаногенных и сульфатредуцирующих бактериальных сообществ, а также сообщество микроорганизмов, развивающееся в очистных сооружениях сточных вод. Маты представляют собой многовидовое сообщество, с выраженной стратификацией соответственно градиенту фактора, регулирующего структура мата, а именно – света для фототрофов, питательных веществ, окислительного потенциала и др. для хемотрофов. Этот тип биопленок часто может достигать в толщину нескольких десятков сантиметров

-  Зубные биопленки (бляшки), образованные сложным сообществом многих микроорганизмов. Этот тип пленок является одним из наиболее изученных. Для него описана строгая последовательность колонизации разными микроорганизмами, типы и механизмы взаимодействия организмов. Из зубных биопленок выделены сотни видов микроорганизмов.

-  Пленка с лентами-выростами, формирующаяся смешанной популяцией бактерий в условиях турбулентного оттока. Эти ленты могут отрываться и способствовать расселению популяции

-  «грибы» - биопленки, сформированными одним или несколькими видами микроорганизмами со специфической трехмерной структурой, особыми функционально-морфологическими образованиями (порами, каналами, пустотами, ножками). В образовании таких дифференцированных биопленок у P.aeruginosa и Serratia marcescens важную роль играют гены, ответственные за  синтез альгинатов, рамнолипидов, а также сигнальных компонентов системы «quorum sensing».

-  Бентосные и речные осадки, а также взвешенные в воде хлопья (flocs, «речной и морской снег») и различные типы обрастаний, особенно те, которые формируются в «экстремобиоценозах»

Для границы вода-воздух описано 3 морфотипа:

-              Примитивный слой на границе воды и воздуха, когда микробы образуют пленку – описано для вибрионов и бацилл

-              Массивные структуры типа чайного гриба (медузомицет, гриб «комбуча»). Сообщество чайного гриба представляет собой симбиоз уксуснокислых бактерий и дрожжей многих родов. Дрожжи включены в полисахаридную строму, образованную бактериями, и вся ассоциация располагается на границе вода-воздух, достигая толщины нескольких сантиметров

-              Пленка бацилл на границе жидкость-воздух, с рыхлой основной частью из цепочек клеток и плодовыми телами, образующими споры, обращенными в воздух.

1.2. Этапы и механизмы формирования биопленок и их регуляция

Погруженная в природную воду твердая поверхность немедленно покрывается так называемой первичной пленкой, изменяющей свойства этой поверхности [5]. Формирование такого слоя молекул является первой стадией, предшествующей образованию собственно бактериальной пленки. (Приложение 2). Например, образование зубных бляшек протекает полноценно только на поверхности зубов в присутствии  слюны. Белки слюны образуют слой на поверхности, к которому прикрепляются первые бактерии-колонизаторы.

Затем следует этап собственно микробной адгезии, обратимая адгезия, когда микроорганизмы обратимо прикрепляются к твердой поверхности. На этом этапе действуют неспецифические физико-химические силы взаимодействия между молекулами и структурами на поверхностях микроорганизма и твердого субстрата (Ван-дер-Ваальсовы, гидрофобные, электростатические, дисперсионные силы Лондона). К такому типу адгезии способны как живые, так и убитые клетки микроорганизмов. Например, убитые УФ-излучением или нагреванием P.fluorescens не теряют своей способности к адгезии.

Следующая стадия необратимой адгезии наступает, когда клетка необратимо связывается с поверхностью. Эта фаза, в свою очередь, состоит из нескольких самостоятельных этапов формирования биопленки. В течение некоторого времени после прикрепления к поверхности клетки могут перемещаться вдоль поверхности посредством жгутиков и пилей IV типа. Затем клетки теряют подвижность, некоторые из них слипаются друг с другом, начинают выделять внеклеточные полимеры (полисахариды, липополисахариды, гликопротеины), формируя внеклеточный полимерный матрикс (ВПМ). В результате деления клеток возникают компактные микроколонии, объединенные этим матриксом.

Затем наступает пора вторичных колонизаторов, т.е. микроорганизмов, которые прикрепляются к клеткам, локализованным на поверхности. Например, при формировании зубной бляшки первичными колонизаторами являются стрептококки, к которым прикрепляются фузобактерии и затем уже другие бактерии, всего нескольких сот  видов. Одновременно с увеличением толщины биопленки формируются ее специфические структуры – полости, каналы, выросты, поры. Эта стадия нарастания зрелой биопленки в благоприятных условиях продолжается достаточно долго, а в неблагоприятных условиях, вступает в последнюю фазу – распада, деградации, гибели части клеток и высвобождения остальной части клеток в виде свободноплавающих (планктонных), что было показано для P.aeruginosa, S.marcescens, Vibrio cholerae и P.tunicata.

На процесс формирования биопленок и их свойства влияют факторы окружающей среды и свойства клеток самого микроорганизма [3]. Наиболее важными внешними факторами являются величины рН, солености, осмолярности, парциальное давление кислорода, доступность источников питания, а также гидрофобность поверхности раздела фаз, сила и тип движения жидкости относительно этой поверхности.

Основным фактором, влияющим на перемещение к поверхности раздела фаз как подвижных, так и неспособных к движению микроорганизмов, является течение жидкости. Адгезия бактерий к твердым поверхностям происходит как в условиях турбулентного потока жидкости, так и при относительной неподвижности водной фазы. Вблизи твердой поверхности существует зона малоподвижной воды («вязкий слой»). Наряду с этим на перемещение микроорганизмов влияют капиллярные (дренажные) силы, обусловленные давлением жидкости, протекающей между поверхностью твердой фазы и поверхностью бактерии. Седиментация может играть значительную роль только в слабопроточных системах с частицами значительных размеров, таких как крупные бактерии или агрегаты из бактерий. Определенную роль играет и собственная двигательная активность микроорганизмов, поскольку подвижные клетки активно перемещаются по направлению к поверхности и окончательно удерживаются притягивающими силами, действующими вблизи поверхности.

Важную роль в адгезии играет гидрофобность микробных клеток. Так, у мутантов бактерий Burkholderia cepacia, Shewanella alga, Enterococcus fecalis, поверхность которых значительно менее гидрофобна, чем у дикого типа, способность к адгезии в значительной степени редуцирована. Заряд поверхности также влияет на адгезию микроорганизмов. Отрицательный заряд ингибирует адгезию P.fluorescens, тогда как присутствие на поверхности субстрата катионов Fe3+ значительно увеличивает количество адгезированных анаэробных бактерий Desulfomonile tiedjei, Syntrophomonas wolfei, Syntrophobacter wolinii и Desulfovibrio sp. (клетки этих бактерий заряжены отрицательно).

Зависимость бактериальной адгезии от рН среды достаточно видоспецифична. Количество адгезированных клеток скользящей бактерии Flexibacter sp. увеличивается со снижением рН. В случае Enterobacter cloacae и Chromobacterium sp. оптимум рН для адгезии находится в области 5,5-7. за пределами этого диапазона количество прикрепленных клеток минимально. Максимальная адгезия P.fluorescens происходит при рН 7. напротив, Archaeoglobus fulgidus образует биопленку при резком повышении рН до экстремальных значений.

Повышение ионной силы раствора усиливает адгезию тогда, когда исходная ионная сила низкая (в растворах с концентрацией менее 0,1 М NaCl). При более высоких значениях этого показателя возможны различные варианты. Так, например, концентрация NaCl до 0,1 М усиливает адгезию Vibrio alginolyticus и P.fluorescens, при превышении этого значения наблюдается ингибирование прикрепления. Повышенная осмолярность среды способствует адгезии Staphylococcus epidermidis.

Влияние температуры на адгезию микроорганизмов также очень видоспецифично. Выделяют два типа зависимости:

1.                      максимальное количество прикрепленных клеток коррелирует с температурным профилем скорости роста, т.е. микроорганизмы прикрепляются в нормальных для роста условиях. Такого рода зависимости демонстрируют представители видов P.fluorescens, E. сloacae и рода Chromobacter

2.                      максимум адгезии наблюдается при неоптимальных, и даже совсем не совместимых с ростом данных микроорганизмов значениях температуры. Повышенная температура вызывает адгезию S. epidermidis. В ответ на температурный стресс A. fulgidus прикрепляются к поверхности культиватора и продуцируют значительные количества хорошо дифференцированной биопленки в течение 2-3 ч.

На бактериальную адгезию могут оказывать влияние концентрация кислорода, а также некоторые яды и ультрафиолетовое излучение.

Создается впечатление, что положительным образом на адгезию (и последующее формирование биопленки), как правило, влияют те факторы, которые в данных условиях рассматриваются микроорганизмом как стрессовые.

Исследовано также влияние на адгезию и биотических факторов.

Фаза роста бактериальной культуры в значительной степени определяет адгезивные свойства клеток. Способность к адгезии анаэробных бактерий Syntrophomonas wolfei и Desulfovibrio наиболее выражена в ранней логарифмической фазе и снижается с возрастом культуры, становясь пренебрежимо низкой при истощении источников питания в среде. Повышенные адгезионные свойства активно растущих клеток могут быть связаны с их подвижностью. Процесс адгезии характеризуется кривой насыщения, достигая максимума через 2 ч. Плотность клеточной суспензии не имеет большого значения. Режим поступления питательных веществ, их качественный состав, а также лимитирование могут быть регулирующими факторами для бактериальной адгезии. Копиотрофные бактерии, помещенные в среду с экстремально низким содержанием источников углерода, т.е. в условия голодания, реагируют на это повышением адгезионных свойств клеток.

В процесс формирования биопленок вовлекается ряд биохимических и генетических механизмов. Специфическим генетическим механизмом можно считать наличие генов, реагирующих на прикрепление и активных только (или в основном) в биопленках. Несколько генов реагируют на обратимое прикрепление, в то время как необратимое прикрепление вызывает изменение активности уже нескольких десятков генов. У Bacillus subtilis образование биопленки регулируется по типу катаболитной репрессии глюкозой. Наличие специфических регуляторных систем биопленкообразования было показано для E.coli, стафилококков, стрептококков.

Ряд авторов отмечают важность наличия поверхностных структур – жгутиков и пилей IV  типа, а также специфических «липких молекул» - лектинов и адгезинов. Адгезины являются специфическими молекулами, обеспечивающими узнавание поверхности, к которой происходит прикрепление, а также само прикрепление за счет гидрофобных, водородных, ионных и ковалентных связей. Эти молекулы, естественно, локализуются на поверхностных структурах микроорганизмов.

Процесс адгезии регулируется также путем образования антиадгезинов, специфических внеклеточных метаболитов, предотвращающих обратимую адгезию. Антиадгезины используются как для регуляции адгезии самого организма-продуцента, так и для борьбы с конкурентами, не допуская их внедрения в уже сформированную биопленку. Так, клетки одного из штамма пленкообразующих морских штаммов скользящих бактерий Cytophaga не подавляют жизнеспособность, но ингибируют адгезию другого штамма за счет выделения ингибитора-гликопротеина, состоящего из 5 нейтральных сахаров и 18 аминокислот.

У P.fluorescens описаны газообразные регуляторы адгезии и антиадгезины, представленные смесью н-алканов, протеазами и другими гидролазами.

Подобное антиадгезионное действие оказывают антиадгезины бацилл, такие как липоциклопептид B.licheniformis, а также хорошо известный биосурфактант сурфактин, выделяемый B. subtilis. Это вещество ингибировало адгезию и формирование биопленки бактериями Salmonella enterica. Выделение биосурфактантов микроорганизмами биопленок как защитный механизм, направленный против колонизации поверхности другими штаммами, впервые было описано на примере пробиотических бактерий в мочеполовой системе, кишечнике и глотке человека. Например, Streptococcus thermophilus и виды рода Lactobacillus в процессе роста способны выделять биосурфактанты.

Межклеточная коммуникация посредством специфических ауторегуляторов чрезвычайно важна для развития и функционирования биопленок. Неспособные к ауторегуляции с участием гомосеринлактонов мутанты P.aeruginosa образовывали нетипичные, вырожденные плоские биопленки. Регуляторы другого типа, галогенфураноны, образуемые морскими водорослями, препятствуют формированию бактериальных биопленок. Известен ряд примеров, когда при истощении источника питания в среде бактерии биопленки выделяют гидролитические ферменты, позволяющие им использовать полимеры матрикса как источники питания и одновременно высвобождающие их в виде планктонных клеток, способных найти более благоприятные для размножения условия. Показано, что выделение сурфактанта рамнолипида P.aeruginosa необходимо для предотвращения плотного прикрепления вновь образованных бактерий внутри биопленки и их удаления из нее, и таким образом, для формирования и поддержания полостей в биопленках.

Активность бактериофагов приводит к лизису части инфицированных бактерий биопленки и появлению полостей и каналов. В старых пленках P.aeruginosa, S.marcescens, Vibrio cholerae и P.tunicata обнаружена индуцированная гибель клеток, за счет которой обеспечиваются пищей оставшиеся клетки и которая способствует структуризации биопленки – образованию полостей, каналов и пор.

Почему в лабораторных условиях микроорганизмы, как привило, растут в виде планктонных культур, а в природе – в виде биопленок? С одной стороны, неспособность к образованию биопленок может явиться результатом отбора, проводимого исследователями и направленного на быстрый рост микроорганизма в виде гомогенной культуры, что облегчает проведение аналитических процедур в динамике роста, получение стандартной биомассы, выделение клеточных компонентов. Хотя в учреждениях, где изучают процессы, осуществляемые прикрепленными или агрегированными культурами (например, при очистке воды), их стараются поддерживать именно в нативном, агрегированном состоянии.

С другой стороны, в лабораторных условиях микроорганизмы стараются выращивать на богатых средах в оптимальных условиях и, возможно, это как раз и есть основная причина роста в виде планктонной культуры.

1.3. Многообразие взаимоотношений между компонентами биопленок

Метаболическая гетерогенность микроорганизмов в биопленках обусловлена многими причинами, из которых наиболее очевидной является пространственная: локализация микробных клеток в различных участках трехмерного матрикса [4]. В этом отношении биопленки принципиально не отличаются от стратифицированных морских и пресноводных осадков. Однако, учитывая меньшую, как правило, толщину биопленок стратифицированные процессы в них обычно выражены не столь заметно.

Тем не менее, с использованием микросенсоров показано, что предпочтительная последовательность акцепторов электронов, присущая осадкам, сохраняется и в пресноводных биопленках. Такие акцепторы располагаются в порядке, соответствующем величине изменения свободной энергии в реакции их восстановления:

O2>NO3(-)>MnO2>Fe(3+)>SO4(2-)>CO2. Поэтому, в первую очередь, используется O2 (в процессах дыхания, нитрификации и окисления сульфида), затем NO2(-) и NO3(-), образованные в процессе нитрификации или поступившие из окружающей среды. Денитрификация может быть сопряжена с окислением сульфида. Сульфатредукция протекает ниже зоны денитрификации. Наконец, метаногенез пространственно отделен от сульфатредукции и осуществляется в наиболее глубоких зонах биопленки.

В целом распределение функций в биопленке можно в упрощенном виде представить следующим образом (Приложение 3).

Однако такая стройная и логически обоснованная модель реализуется далеко не во всех случаях. Микрозональность биопленок приводит к тому, что, например, сульфатредуцирующие бактерии могут располагаться не только на границе аэробной и анаэробной зон, но встречаются даже в анаэробных участках, и при этом активно метаболизируют пропионат.

Поскольку биопленки, как правило, представляют собой гетерогенные сообщества, состоящие из микроорганизмов разных физиологических групп, необходимо остановиться на основных типах взаимоотношений (прежде всего трофических), возникающих между их компонентами.

Взаимодействие между компонентами начинается уже в процессе формирования биопленки. Многократно было показано, что биопленки, состоящие из микроорганизмов разных таксонов, прочнее и толще, чем биопленки, состоящие из микроорганизмов одного вида. Взаимодействие происходит, по-видимому, на стадии формирования внеклеточного матрикса.

В «зрелых» биопленках, в отличие от планктонных культур, конкуренция между видами обнаруживается редко. И даже в том случае, когда один из видов, благодаря более высокой скорости роста занимает господствующее положение, второй сохраняет жизнеспособность и высокую численность. Подобные взаимоотношения обнаружены, например, в бинарных (состоящих из культур двух видов) биопленках между популяциями быстро растущей культуры Klebsiella pneumoniae и культурой P.aeruginosa.

Более редкая разновидность конкуренции – амменсализм может быть обусловлен образованием одним из микроорганизмом агентов, ингибирующих других членов сообщества, а также созданием неблагоприятных физико-химических условий (например, величины рН). Такая ситуация обнаружена в бинарной биопленке, сформированной двумя видами Ruminococcus, один из которых образует бактерицин, активный против другого вида.

Наиболее часто встречающимися взаимоотношениями между микробными компонентами биопленок являются комменсализм и протокооперация.

Комменсализм выражается в одностороннем влиянии одного из компонентов биопленки на жизнедеятельность другого ее компонента. Обычный пример – потребление кислорода аэробным микроорганизмом, способствующее росту микроаэрофильных или анаэробных «сожителей». Этот тип взаимодействия играет важную роль в микробной коррозии с участием сульфатредукторов, локализованных в анаэробных микронишах.

Протокооперация приводит к взаимному положительному влиянию компонентов биопленок друг на друга. Такие взаимоотношения существуют, например, в биопленках, содержащих фототрофные и гетеротрофные микроорганизмы. Характерным примером протокооперации служит также взаимодействие целлюлолитических бродильщиков и метаногенов. Последние, утилизируя молекулярный водород, а также формиат, образованные в процессе брожения, сдвигают термодинамическое равновесие, предотвращая накопление восстановленных коферментов в клетках бродильщиков и стимулируя синтез ими АТФ.

Предыдущий случай является примером, когда протокооперация переходит в синергизм, поскольку оба компонента биопленки получают выгоду от сотрудничества, а образование или потребление какого-либо продукта в биопленке превышает величину, характерную для индивидуальных популяций. Типичным примером служит гидролиз целлюлозы в биопленке, содержащей как целлюлолитические, так и неспособные к расщеплению целлюлозы микроорганизмы. Последние стимулируют гидролиз целлюлозы и рост целлюлолитиков путем потребления низкомолекулярных продуктов гидролиза, которые репрессируют биосинтез целлюлаз.

Заметную роль в межклеточных взаимодействиях в биопленках играет обмен генетической информацией, что в определенной степени обусловлено высокой плотностью микробной популяции. Существует множество доказательств того, что горизонтальный перенос генов в биопленках происходит с большей интенсивностью, чем в планктонных культурах. В биопленках, в частности, реализуется механизм защиты плазмид от элиминирования по типу «токсин-антитоксин». Принцип такой защиты состоит в кодировании плазмидой стабильного белка-токсина и лабильного белка-антитоксина. Если дочерние клетки после деления не содержат плазмид и не способны осуществлять ресинтез антитоксина, то после распада остаточного антитоксина стабильный токсин убивает такие клетки. Эффективность горизонтального переноса генов in situ убедительно доказана применением сканирующей конфокальной лазерной микроскопии (SCLM) с помощью генов-репортеров, кодирующих флуоресцирующие белки: зеленый, красный, голубой, желтый и синий. Более того, удается не только определить пространственную локализацию мигрирующих плазмид в популяции, но и изолировать соответствующую субпопуляцию методами сортирования клеток.

Кроме метаболической гетерогенности, присущей биопленке как целостной системе и определяемой зональностью биопленок, отмечают также существенные особенности в физиолого-биохимических свойствах клеток, входящих в состав биопленок, по сравнению с их планктонными аналогами. В результате возникло представление об особом «биопленочном» фенотипе, выражающемся, в частности, в снижении чувствительности к антибиотикам и токсичным агентам.

Анализ активности отдельных генов, осуществляемый методами «протеомики» (с использованием двухмерного электрофореза белков), позволил установить различия в экспрессии генов в процессе формирования биопленок, а также по мере их созревания. Удалось даже пространственно локализовать места синтеза отдельных белков в биопленке. Так, например, показано, что гены lasI и rhlI P.aeruginosa, определяющие синтез факторов «quorum sensing», преимущественно экспрессируются в клетках, локализованных на границе раздела твердой и жидкой фаз, причем экспрессия первого гена уменьшается со временем, тогда как второй ген экспрессируется с постоянной скоростью.