Газовая хроматография и её применение в фарм анализе

Министерство Здравоохранения Республики Беларусь

Витебский государственный медицинский университет

Кафедра фармацевтической химии с курсом ФПКС

 

 

 

 

 

Курсовая работа

на тему:

 

ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

и ее применение в Фармацевтическом анализе

 

 

 

 

 

Научный руководитель:

Ассистент Моисеев Д.В.

 

 

 

 

 

Витебск - 2007

 

Оглавление

 

Введение

 

Газовая хроматография — метод разделения летучих соединений. Подвижной фазой служит инертный газ (газ-носитель), протекающий через неподзижную фазу, обладающую большой поверхностью. В качестве подвижной фазы используют водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ. Газ-носитель не взаимодействует с разделяемыми веществами и неподвижной фазой.

В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы различают два вида газовой хроматографии — газоадсорбционную (неподвижная фаза — твердый носитель: силикагель, уголь, оксид алюминия) и газожидкостную (неподвижная фаза — жидкость, нанесенная на инертный носитель).

Процесс разделения основан на различии в летучести и растворимости    (или    адсорбируемости)    разделяемых    компонентов Через хроматографическую колонку быстрее движется тот компонент, растворимость которого в неподвижной фазе меньше, а летучесть (упругость пара) при данной температуре больше.

Газохроматографическим методом могут быть проанализированы газообразные, жидкие и твердые вещества с молекулярной массой меньше 400, удовлетворяющие определенным требованиям, главные из которых — летучесть, термостабильность, инертность и легкость получения. Для быстрого и полного разделения достаточно, чтобы упругость пара была 1-4 мм при рабочей температуре колонки. Более летучим считается вещество, упругость паров которого выше. Количественный анализ можно провести только в том случае, если вещество термостойко, т.е. испаряется в дозаторе воспроизводимо и элюируется без разложения. При разложении вещества на хроматограмме появляются ложные пики, относящиеся к продуктам разложения. Вещество не должно образовывать устойчивых сольватов при растворении в неподвижной жидкой фазе и реагировать с материалами, из которых изготовлены детали хроматографа. Желательно работать с соединениями, которые легко получить с количественным выходом. Этим требованиям в большей мере удовлетворяют, как правило, органические вещества, поэтому  ГХ широко используют как серийный метод анализа органических соединений. Этим методом можно также определять почти все элементы периодической системы в виде летучих комплексов.

 

 

Основная часть

1. Общая характеристика

 

Газовая хроматография - группа хроматографических методов анализа, в которых подвижной фазой является газ (газ – носитель).

В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы различают:

Газотвёрдофазная (ГТХ) или газоадсорбционная (ГАХ) хроматография – неподвижной фазой является вещество, на котором адсорбируются разделяемые компоненты.

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) – неподвижной фазой является слой   жидкости, нанесённый на поверхность твёрдого носителя. 

Эффективность разделения  в газовой хроматографии зависит от давления пара соединения и от степени его взаимодействия с неподвижной фазой. Эффективность разделения может быть получена на основе законов Генри и Рауля. Полученное соотношение называется формулой Херингтона:

 

    (1)

 

 

где Vg1 и Vg2 удельные объёмы удерживания для компонентов 2 и 1 соответственно.

Удельный объём удерживания Vg зависит от истинного объёма удерживания VN, массы неподвижной фазы ms и температуры Т следующим образом:

        (2)

 

Удельный объём удерживания менее всего зависим от условий анализа. Однако имеется немало трудностей для определения этой величины, поэтому на практике его используют редко.

Истинный объём удерживания VN связан с исправленным объёмом удерживания VR’ через коэффициент Мартина j:

 

      (3)

 

Коэффициент j учитывает падение давления при прохождении газа-носителя через колонку ( из-за сопротивления разделяющей колонки давление газа на входе в колонку больше, чем на выходе из неё ) и рассчитывается по формуле:

 

                        J = 3[ (pi/po)2 – 1 ] / 2[ (pi/po)3 – 1 ]   (4)

 

где pi – давление газа на входе в колонку, а po – на выходе из неё.

В формуле Херингтона p10 и p20 представляют собой давления пара чистых компонентов 1 и 2 соответственно, а γ10 и γ20 – коэффициенты активности, относящиеся к моляльной концентрационной шкале, компонентов 1 и 2 при бесконечном разбавлении.

 Для времён удерживания двух разделяемых компонентов применимо следующее соотношение:

 

     (5)

Согласно этому выражению, разделение двух компонентов определяется их относительной летучестью, равной отношению давлений насыщенных паров компонентов:

 

      (6)

В то же время коэффициенты активности характеризуют взаимодействия разделяемых компонентов с неподвижной фазой, определяя тем самым её селективность.

 

 

 

 2. Устройство газового хроматографа

 Газохроматографические определения  проводятся с помощью прибора, называемого газовым хроматографом. Принципиальная схема такого прибора имеет следующий вид:

 

                        Рисунок 1 – Схема газового хроматографа

В ГАХ и ГЖХ используется один и тот же прибор. Различие между данными вариантами газовой хроматографии заключается лишь в содержимом хроматографической колонки.

Подвижная фаза (газ-носитель)

В качестве подвижной фазы в газовой хроматографии применяют инертные газы (гелий, аргон), азот, водород, диоксид углерода и другие вещества. Газ-носитель должен:

• быть инертен по отношению к определяемым веществам и сорбенту;
• иметь как можно меньшую вязкость;
• обеспечивать высокую чувствительность детектора;
• быть доступным, взрывобезопасным, достаточно чистым (или легко подвергаться очистке).

 Газы-носители  хранятся в  стальных баллонах под давлением (до 150 атм). Газ отбирается из баллона  с помощью крана - редуктора (устройства, позволяющего отбирать газ из баллона при давлении намного меньшем, чем давление в баллоне). При программировании температуры кроме регулятора давления необходимо также использовать регулятор потока. Для измерения скорости потока газа на входе в колонку используется ротаметр, а на выходе  из колонки – измеритель потока.   Система подготовки газа необходима для установки, стабилизации, очистки газовых потоков, а также измерения их скорости. Она включает в себя регулятор давления, регулятор расхода газа, фильтры для очистки газа и т.д.

Система ввода пробы

 

Устройство для ввода пробы (дозатор) предназначено для ввода в колонку определённого количества анализируемой пробы. При анализе газообразных веществ проба может быть непосредственно введена в поток газа – носителя. Жидкие и твёрдые пробы предварительно испаряют в инжекционном испарителе, который представляет собой металлический блок, имеющий канал для ввода и испарения пробы. С одной стороны канал закрыт пробкой из самоуплотняющейся силиконовой резины (септа), а с другой стороны к нему присоединена колонка. Для дозирования газообразных веществ применяют газовые краны-дозаторы. Если анализируемая проба является жидкостью, её вводят с помощью специального микрошприца в испаритель. Проба, введённая в канал испарителя, куда предварительно подаётся поток нагретого газа-носителя, быстро испаряется и переносится потоком газа в колонку. Температура испарителя поддерживается обычно на 30-50 °С выше температуры кипения наименее летучего компонента анализируемой смеси.

Хроматографическая колонка

Колонки, применяемые в газовой хроматографии, можно разделить на набивные и капиллярные.

Набивные (насадочные) колонки представляют собой изогнутые или прямые трубки, изготовленные из стекла, металла или полимера, диаметром от 3 до 8 мм и длиной от 1 до 20 м (чаще всего 1-5 м). Неподвижная фаза наносится на гранулированный материал – носитель (силикагель, диатомит, активированный уголь) и помещается внутрь колонки. В ГАХ материал – носитель сам является неподвижной фазой.

Недостатком набивных колонок является то что их максимальная длина составляет 20 м (при этом число теоретических тарелок N ~ 10000). При такой длине падение давления становится очень большим (давление на входе в колонку достигает нескольких МПа, что объясняется затруднением потока газа – носителя). Поэтому при работе с такими колонками требуется видоизменение типовой схемы серийно выпускаемых хроматографов.

 Капиллярные колонки представляют собой изогнутые стальные, стеклянные или кварцевые трубки с внутренним диаметром 0,1-1,0 мм и длиной от 10 до 100 м. Неподвижная фаза распределена на стенках капилляра в виде тонкой плёнки (тонкоплёночный капилляр) или в виде тонкого слоя гранул правильной формы (тонкослойный капилляр).

Рисунок 2 - Капиллярные колонки Alltech

 

Капиллярные колонки обеспечивают более высокую эффективность хроматографического разделения, чем насадочные (число теоретических тарелок для капиллярных колонок N ~ 100000). Вариант газовой хроматографии, в котором используются капиллярные колонки, называется капиллярной газовой хроматографией.

Перед использованием колонки должны быть хорошо прогреты в потоке газа – носителя для удаления остатков растворителя. Температура колонки определяется главным образом летучестью пробы и может изменяться в пределах от – 196 °С (температура кипения жидкого азота) до 350 °С. Для поддержания постоянной температуры используют термостат.

Детекторы

 Детектор представляет собой устройство, реагирующее на изменение определённых свойств системы газ–носитель – разделяемый компонент и  предназначенное для обнаружения и количественного определения компонентов анализируемой смеси, выходящих из колонки в потоке газа-носителя. Работа детектора основана на преобразовании в электрический сигнал изменений физических, химических или физико-химических свойств газового потока, выходящего из колонки.

Детекторы подразделяют на:

• универсальные – используются для регистрации многих веществ (катарометр, ПИД).
• селективные – чувствительны к химическим соединениям определённых классов (ТИД, ДЭЗ).

Различают также деструктивные (ПИД, ПФ) и недеструктивные (катарометр, инфракрасный детектор) детекторы. Детектор считают деструктивным, если более чем 1% анализируемых компонентов разлагается или реагирует с образованием других соединений. 

Основными характеристиками хроматографических детекторов являются:

• чувствительность – характеризуется отношением сигнала детектора к количеству вещества.
• предел обнаружения – за минимально определяемое содержание вещества принимают такое содержание, которому соответствует утроенный сигнал шумов детектора.
• величина линейного динамического диапазона – сигнал детектора считается линейным, если отношение сигналов детектора, соответствующих двум пробам, пропорционально отношению количеств вещества в этих пробах. 
• воспроизводимость – характеризуется стандартным отклонением серии сигналов детектора при вводе в хроматограф одних и тех же проб.
• стабильность работы – низкая чувствительность к колебаниям температуры и скорости потока газа.

Для газовой хроматографии предложено более 50 различных детекторов. Однако обычно комплект современного универсального хроматографа включает в себя не более 4 - 6 детекторов. Основные характеристики некоторых детекторов, применяемых в газовой хроматографии, приведены в таблице.

 

Характеристика некоторых газохроматографических детекторов

Детектор	mmin, г	Линейный диапазон	Детектируемые компоненты
катарометр	10-7	104	Универсальный - любые вещества, отличающиеся по теплопроводности от газа-носителя
пламенно-ионизационный	10-12	107	селективный – вещества (органические), способные ионизироваться в водородном пламени.
электронного захвата	5×10-14	102	селективный - вещества электрофильные в газовой среде: полиароматические,  полигалогеносодержащие, нитрилы серусодержащие, и т.д.
термоионный	10-13 – 10-14	105	селективный - P-, N-содержащие и некоторые другие соединения
масс-спектрометр	10-12	105 -106	универсальный - исследование сложных смесей неизвестного состава; в режиме масс-фрагментографии - специфический

  Рисунок 3 – Схема катарометра

Детектор по теплопроводности (катарометр) представляет собой металлический блок, в полости которого находится тонкая спираль, изготовленная из материала (W, Pt), электрическое сопротивление которого сильно зависит от температуры. Обычно катарометр имеет две ячейки. Через ячейку сравнения пропускают газ-носитель, а через ячейку измерения - элюат. Если спираль омывает чистый газ – носитель, то она теряет постоянное количество теплоты и её температура постоянна. Если же в состав газа – носителя входят определяемые вещества, то его тепло- проводность  уменьшается и соответственно уменьшается температура спирали. Это приводит к изменению сопротивления нити, которое измеряют с помощью моста Уитстона. 

            Рисунок 4 - Мост Уитстона для катарометра

При использовании катарометра в хроматографе должны быть две колонки, через одну пропускают газовую смесь, содержащую разделяемые вещества, а через вторую - чистый газ-носитель.

Следует отметить, что в качестве газа – носителя можно использовать только водород и гелий, теплопроводность которых примерно в 6-10 раз выше, чем у органических веществ. Катарометр не годится в качестве детектора для капиллярной газовой хроматографии из–за его низкой чувствительности.  

Пламенно-ионизационный детектор (ПИД) представляет собой металлическую камеру, в корпус которой снизу введена горелка, выполняющая функцию катода, а сверху – собирающий электрод (анод).    Для работы данного детектора необходимы водород, который смешивается с элюатом и сгорает при выходе из горелки, и воздух  - для обеспечения горения водорода.

Рисунок 5 – Схема ПИД: 1 - собирающий электрод; 2 - горелка

 

Пламя чистого водорода практически не содержит ионов, поэтому фоновое сопротивление пространства между электродами очень велико, а сила тока очень мала. Если в пламя из колонки попадает органическое вещество, то оно ионизируется. Ионы заполняют межэлектродное пространство, в результате чего сопротивление снижается, а сила тока резко увеличивается.

 ПИД хазактеризуется очень низким пределом обнаружения и большим линейным диапазоном, что делает его весьма удобным при определении следов. Однако при детектировании происходит компонентов пробы (деструктивный характер).

Термоионный детектор внешне похож на пламенно-ионизационный. Он имеет кварцевую горелку, на конце которой находится таблетка из соли щелочного металла (например, CsBr или Rb2SO4). При нагревании эта соль испаряется и в газовой фазе устанавливается равновесие:

CsBr  + H+  =  Cs+  + HBr

При попадании в пламя соединения, содержащего в составе молекулы атомы фосфора и некоторые другие гетероатомы, скорость образования ионов резко увеличивается и сила тока возрастает. Термоионный детектор наиболее чувствителен к фосфорсодержащим соединениям. В меньшей степени он реагирует на соединения азота, серы, галогенов (кроме фтора), мышьяка, олова.

Детектор электронного захвата (ДЭЗ) представляет собой ионизационную камеру (ячейку с двумя электродами), в которой находится источник b-излучения, например, 63Ni или титановая фольга, содержащая адсорбированный тритий. В качестве газа-носителя при работе с детектором электронного захвата применяют азот, гелий, аргон и другие газы, способные ионизироваться с освобождением электрона. Фоновый ток детектора обусловлен, в основном, электронами. Молекулы анализируемых веществ, обладающие большим сродством к электрону, при попадании в детектор захватывают электроны и превращаются в анионы. Число носителей заряда при этом не изменяется, но сила тока уменьшается, так как анионы обладают на несколько порядков меньшей подвижностью, чем свободные электроны. Кроме того, образовавшиеся анионы вступают во взаимодействие с катионами газа-носителя, что вносит дополнительный вклад в уменьшение силы тока.

                                       Рисунок 6 -  Схема ДЭЗ

 

3. Особенности  газотвёрдофазной хроматографии

Особенность метода газоадсорбционной хроматографии (ГАХ) в том, что в качестве неподвижной фазы применяют адсорбенты с высокой удельной поверхностью (10—1000 м2/г)) и распределение веществ между неподвижной и подвижной фазами определяется процессом адсорбции. Адсорбция молекул из газовой фазы, т.е. концентрирование их на поверхности раздела твердой и газообразной фаз, происходит за счет межмолекулярных взаимодействий (дисперсионных, ориентационных, индукционных), имеющих электростатическую природу. Возможно образование водородной связи, причем вклад этого вида взаимодействия в удерживаемые объемы значительно уменьшается с ростом температуры.

Для аналитической практики важно, чтобы при постоянной температуре количество адсорбированного вещества на поверхности cs было пропорционально концентрации этого вещества в газовой фазе сm:

Cs =  kСm

т.е. чтобы распределение происходило в соответствии с линейной изотермой адсорбции (k — константа). В этом случае каждый компонент перемещается вдоль колонки с постоянной скоростью, не зависящей от его концентрации. Разделение же веществ обусловлено различной скоростью их перемещения. Поэтому в ГАХ чрезвычайно важен выбор сорбента, площадь и природа которого обусловливает разделение при заданной температуре.

В качестве НФ для ГАХ используют как неорганические  (активные  угли, силикагели, оксид алюминия), так и органические (сополимеры стирола и дивинилбензола) сорбенты.

К преимуществам ГАХ относят:

• широкий температурный диапазон
• быстрое установление равновесия
• хорошая стабильность базовой линии, что особенно важно для ГХ с программируемой температурой и для сочетания ГХ и МС.

Наряду с преимуществами у ГАХ имеются также существенные недостатки:

• малый линейный интервал изотермы адсорбции (вследствие этого                                      возникают ассиметричные пики)
• высокие энальпии адсорбции, приводящие к большому времени анализа
• поверхность некоторых сорбентов обладает каталитической активностью.

 

 

4. Особенности  газожидкостной хроматографии

В основе механизма разделения определяемых компонентов в методе ГЖХ лежит их распределение между неподвижной жидкой фазой  и газом – носителем.

К жидкостям, используемым в качестве НФ, предъявляются следующие требования:

• термическая и химическая устойчивость
• нелетучесть (tкип НФ должна быть примерно на 100°С выше требуемой температуры колонки)
• селективность (разделяющая жидкость должна обеспечивать различные коэффициенты распределения для анализируемых компонентов)
• небольшая вязкость (в противном случае замедляется процесс диффузии)
• образование равномерной плёнки, прочно связанной с носителем
• В зависимости от полярности различают жидкие фазы трёх типов:
• неполярные (УВ, метилсилоксаны)
• умеренно полярные (сложные эфиры, нитрилы, фенилсилоксаны)
• полярные (полигликоли, нитросилоксаны)

Среди неподвижных фаз особое место занимают химически связанные фазы. Они обладают более высокой термостабильностью и не десорбируются с колонки, поскольку разделяющая жидкость ковалентно связана с поверхностью материала носителя. 

Зная свойства неподвижной жидкой фазы и природу разделяемых веществ, например класс, строение, можно достаточно быстро подобрать подходящую для разделения данной смеси селективную жидкую фазу. При выборе разделяющей жидкости пользуются эмпирическим правилом “ Подобное растворяется в подобном “. Так, например, по отношению к полярным соединениям (спирты, органические кислоты, амины) высокой селективностью обладают типичные полярные фазы, содержащие в своём составе функциональные группы – ОН, - СN, - СООН. Напротив, для разделения неполярных соединений (насыщенные УВ, галогенированные УВ) отлично подходят неполярные фазы.

К твёрдым носителям, на которые наносятся неподвижные фазы, предъявляются следующие требования:  

 Твердый носитель должен:

• однородность
• термическая и механическая устойчивость
• химическая инертность
• сферическая форма частиц,  небольшая удельная поверхность

Для нанесения жидкой фазы на твёрдый носитель её смешивают с легколетучим растворителем, например, эфиром. К этому раствору добавляют твёрдый носитель. Смесь нагревают, растворитель испаряется и жидкая фаза остаётся на носителе.

Наибольшее распространение из носителей в ГЖХ получили носители на основе диатомита – микроаморфного, содержащего воду, диоксида кремния (хромосорб G, хромосорб W, хроматрон Н). Необработанные специальным образом носители содержат на своей поверхности металлы и силанольные группы. Это приводит к физической адсорбции полярных соединений, в результате чего на хроматограмме появляются пики с размытым задним фронтом. Для предотвращения нежелательных взаимодействий носители обрабатывают кислотой (для удаления металлов) и диметилдихлорсиланом (DMCS) – для превращения силанольных групп на поверхности в силильные эфиры:

Рисунок 7 – Инактивация остаточных силанольных групп

 

Полученный таким образом носитель обозначают AW-DMCS – промытый кислотой и обработанный диметилдихлорсиланом.

В некоторых случаях в качестве носителей используют полимерные носители (тефлон), стеклянные шарики, графитированную сажу.

 

 

5. Практическое  применение

В газовой хроматографии, для того чтобы учесть влияние объёма и температуры, для идентификации определяемых веществ вместо времени удерживания используют объём удерживания. Общий объём удерживания VR и объём удерживания подвижной фазы (мёртвый объём) VM получают умножением соответствующих времён удерживания на объёмную скорость потока газа – носителя  F:

 

VR = FtR   и    VM = FtM

 

При сравнении хроматограмм, полученных на разных приборах, во избежание ошибок в идентификации используют исправленный объём удерживания VR’ , равный разности между общим и мёртвым объёмами удерживания:

 

VR’ = VR – VM

 

Часто идентификацию проводят по относительным параметрам удерживания, которым относятся относительный объём удерживания, а также различные индексы удерживания  (Ковача, Роршнайдера, Мак-Рейнольдса).

Относительный объём удерживания равен отношению объёма удерживания определяемого компонента к объёму удерживания стандарта:

 

Vотн = VR/VR.st

 

Эта величина зависит только от состава подвижной и неподвижной фаз.

Однако табулирование значений Vотн с целью идентификации вызывает сложности из-за выбора стандарта. Попытки выбрать один стандарт (в газовой хроматографии рекомендовали, например, н-нонан) приводят к трудностям, поскольку всегда желательно, чтобы приведенные объемы удерживания определяемого вещества и стандарта были близкими, добиться же этого при едином стандарте невозможно. Легкокипящие вещества элюируются значительно быстрее нонана и даже бывает трудно получить его пик за приемлемое время при температурах, близких к комнатной; наоборот, при анализе высококипящих веществ нонан элюируется слишком быстро и точность измерения VR.st оказывается очень низкой. Поэтому в газовой хроматографии для целей идентификации применяют, как правило, интерполяционные характеристики и, прежде всего, индекс удерживания I. 

Индекс удерживания I (индекс Ковача) соединения равен 100-кратному числу атомов углерода гипотетического н-алкана с таким же временем удерживания, как и у определяемого соединения.

Согласно этому определению н-алканы имеют индекс, равный 100-кратному числу атомов углерода в молекуле при любых температурах на всех разделяющих колонках. Например, для н-гексана он равен 600, для н-октана  - 800.

Для определения индекса удерживания определяемое вещество хроматографируют в смеси, которая содержит по крайней мере два н-алкана. При этом время удерживания определяемого вещества должно находится между временами н-алканов:

 

                   Рисунок 8 - Определение индекса удерживания Ковача

                                                                                                                                                                                                              Расчёт индекса проводится по следующей формуле:

 

 

 где, tRx, tRz, tR(z+1) – времена удерживания определяемого вещества Х, н-алкана с числом углеродных атомов Z и н-алкана с числом углеродных атомов Z+1.

Индексы удерживания определены для многих соединений и доступны в виде табличных данных для большинства обычных неподвижных фаз. Они относительно независимы от температуры.