Генная терапия, виды, основные проблемы и перспективы

Министерство  образовании РФ

Пензенский  государственный университет

Медицинский институт

Кафедра

<<Микробиологии, эпидемиологии и инфекционных болезней>> 
 
 

Курсовая  работа

на тему :

<<Генная терапия, виды, основные проблемы и перспективы>> 
 
 
 
 
 

Выполнил: студент Мохаммад Раед

                                                               Группа : 08лф2                      

                                                  Принимала: СТ. преподаватель

                                                      Митрофанова Н.Н.

Пенза.2011 

Содержание

1. Введение.....................................................................................3
2. Генная терапия............................................................................4
3. Историческая справка................................................................6
4. методы генотической трансфекции в генной терапии...............8
1. РЕТРОВИРУСЫ....................................................................10
2. АДЕНОВИРУСЫ...................................................................11
5. Искусственные транспортнные средства...................................12
1. ПОЛИМЕРЫ..........................................................................12
2. ЛИПОСОМЫ.........................................................................12
6. Механизмы липофекции.............................................................14
1. ДОСТАВКА ДНК К ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК.................14
2. Взаимодействие комплексов с клеточной поверхностью и проникнование в цитоплазму.................................................14
3. Освобождение ДНК в цитоплазу и транспорт в ядро...........15
7. Моральные проблемы генной терапии.......................................20
8. Заключение..................................................................................22
9. Список литературы.....................................................................25

1. Введение 

    За последние десятилетия появился совершенно новый подход к лечению заболеваний – генная терапия. Принципиальное отличие нового способа лечения от традиционных состоит в том, что он направлен на устранение первопричины заболевания, а не ее следствий. В данной статье рассмотрены основные аспекты терапии на уровне генов, приведены примеры успехов и неудач, сопутствующих становлению этого направления науки.

   На современном этапе генную терапию можно определить как лечение наследственных и ненаследственных заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций.

Лечение заболеваний на генном уровне представляет собой весьма заманчивую перспективу. Но, как и любое вмешательство в организм человека, оно может привести к абсолютно непредсказуемым результатам.

   За полувековой период развития данной области медицины был накоплен как положительный, так и отрицательный опыт использования генотерапии. Тем не менее нельзя однозначно сказать, является ли вмешательство на уровне генов благом или непоправимой ошибкой.

    С момента своего зарождения концепция генной терапии вызывала множество споров. Сторонники преобразования организма на уровне генов утверждали, что данный вид лечения – медицина будущего.

силой. 
 

2. ГЕННАЯ  ТЕРАПИЯ.

    Существует тяжёлое заболевание – гиперхолестеринемия. Причиной его является недостаток или дефект генов ЛПНП-рецептора – мелких структур на поверхности клеток печени, "вытягивающих" липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), вредные для здоровья человека, из крови и ответственных за их разрушение и ответственных за их разрушение в печени. Джеймс Вильсон, бывший исследователь из Медицинской школы Мичиганского университета в Энн-Арбор, сделал попытку внедрить копии нормального гена ЛПНП-рецептора пациенту.  Сначала он отделил у женщины 15% печени (6 млрд. клеток), которые были выращены в 800 чашках с питательными средствами. В них был введён искусственно выведенный безвредный вирус, содержащий нужный ген. Восприняли ген около 20% растущих клеток печени. Модифицированные клетки были введены в тело пациентки с помощью катетера в вену, ведущую непосредственно к печени, где, как рассчитывал исследователь, они присоединятся к остальным клеткам и начнут делиться. Через несколько месяцев малая печёночная биопсия показала, что новый ген функционирует в некоторых из введённых клетках печени. Более того, содержание ЛПНП в крови пациентки упало на 15-30%. Вильсон сказал, что улучшение стало достаточным для того, чтобы далее обходиться только лекарствами для дальнейшего снижения уровня ЛПНП. Решающие достижения молекулярной биологии и генетики в изучении тонкой структуры генов эукариот, их картирования на хромосомах млекопитающих, и, прежде всего человека, бурный рост в области биотехнологии и генной инженерии привели к тому, что уже в 1989 году были предприняты первые попытки лечения моногенных болезней.

    Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путём введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций.

   Первоначально полагали, что генная терапия позволит исправить дефекты в гене, которые вызывают моногенные заболевания. Теоретически считали, что коррекция генного дефекта возможна как на уровне соматических, так и зародышевых (половых) клеток. Но многочисленные опыты и эксперименты внесли поправки в эти представления.

   Значительно проще исправить не сам дефект в гене, то есть заменить весь мутантный ген или его повреждённый фрагмент на нормальный, а вводить в организм пациента полноценно работающий ген.

Работы  по генной терапии у человека ограничены в основном соматическими тканями, поскольку манипуляции на половых или зародышевых клетках могут привести к серьёзным и непредсказуемым последствиям.

   Уже разработанная и применяемая на практике методика генной терапии эффективна не только при лечении моногенных заболеваний, но и таких широко распространённых патологий мультифакториальной природы (то есть вызванными генетическими и экзогенными факторами), как злокачественные опухоли, многие виды тяжёлых вирусных, сердечно-сосудистых и др. заболеваний. 

3. Историческая  справка.

   Первые клинические испытания в генной терапии прошли в мае 1989 года. Т-лимфоциты, взятые из опухоли у больного меланомой, были помечены прокариотическим геном neo, устойчивым к неомицину. Это позволило легко отделить эти клетки в культуре, а затем детально проследить их судьбу в кровотоке и избирательное накопление в опухолях.

   Первым моногенным наследственным заболеванием, к которому применили методы генной терапии, стал наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене фермента аденозиндезаминазы. 14-го сентября 1990 года в Бетесде (США) четырёхлетней девочке, страдающей этой достаточно редкой патологией (1:100000) пересадили её собственные лимфоциты, которые предварительно трансформировали in vitro геном АДА (ген АДА + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедуру повторяли с интервалом в 3-5 месяцев. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций.

   Большинство проектов в генной терапии (около 80%) касаются лечения онкологических заболеваний, а также ВИЧ-инфекции. Начаты клинические испытания моногенных наследственных болезней и таких как:

- Семейная гиперхолестеринемия (1992)

- Гемофилия В (1992)

- Муковисцидоз (1993)

- Болезнь Гоше (1993)

  Программы генной терапии для клинических испытаний должны включать:

1. Обоснование выбора заболевания для проведения такой терапии
2. Определение типа клеток, подлежащих генетической модификации
3. Схему конструирования экзогенной ДНК
4. Обоснование биологической безопасности вводимой генной конструкции, включая опыты на культурах клеток и на модельных (трансгенных) животных.
5. Разработку её переноса в клетки пациента
6. Методы анализа работы введённых генов
7. Оценки клинического (терапевтического) эффекта
8. Возможные побочные последствия и методы их предупреждения.

    В зависимости от способа введения экзогенной ДНК в геном пациента генная терапия может проводиться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает:

1. Выделение и культивирование специфических типов клеток пациента.
2. Введение в них чужеродных генов.
3. Отбор трансфецированных клеток.
4. Реинфузию их тому же пациенту.

   Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определённым образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний (муковисцидоз, рак лёгких).

4. Методы генетической трансфекции в генной терапии.

    Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии).

    Трансфекция может проводиться с использованием чистой ("голой"-naked) ДНК, легированной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК. Комплексированная – плазмидная ДНК, соединённая с солями, белками (трансферрин), органическими полимерами, или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишённых способности к репликации.

    Обнажённая ДНК при внутримышечном введении способна экспрессироваться в количествах, достаточных для развития иммунного ответа на появление новых белков. Этот эффект потенциально может быть использован в целях вакцинации против определённых патогенных вирусов, однако не достаточен для большинства терапевтических целей.

   Для доставки генетического материала идеальной представляется "молекулярная машина", обладающая такими качествами как:

- высокая степень безопасности и надёжности в сочетании с достаточной дешевизной и возможностью широкого применения;

- способность сохранять активность при движении в русле крови в течение длительного и контролируемого времени, и при этом не распознаваться иммунной системой, не вызывать воспалительных процессов;

- высокая избирательность взаимодействия только с клетками-мишенями;

- достаточный объём генетической информации и высокая эффективность, при которой достигается экспрессия каждой доставляемой молекулы ДНК;

- возможность трансформировать заданное количество клеток от нескольких процентов до заведомо гарантированной 100%-й трансформации, что особенно важно при лечении онкологических заболеваний и некоторых вирусных инфекций;

- возможность контролировать как интенсивность, так и время экспрессии на основе данных клинического наблюдения.

   Основные методы доставки чужеродных генов в клетки разделяются на физические, химические и биологические.

  ФИЗИЧЕСКИЕ: микроинъекция, инъекция струёй, электропорация, замораживание-оттаивание, биобаллистика (бомбардирование клеток каплями жидкости или суспензией частичек золота с адсорбированной плазмидой).

  ХИМИЧЕСКИЕ: соли некоторых катионов, например, кальция, ДЕАЕ декстран, полилизин, липосомы.

  БИОЛОГИЧЕСКИЕ: вирусные векторы. 
 

  Повысить эффективность стабильной интеграции можно :

• путём совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем;
• путём создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительной персистенции внутри ядер).

   В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.

Теперь  остановимся подробнее  на некоторых методах.

Вирусы  в качестве средств доставки генетического  материала.

Большинство используемых вирусов получены от диких  штаммов, обладающих различной степенью патогенности, но утративших патогенные свойства благодаря удалению генов, ответственных за размножение и (или) сборку вирусных частиц. В клинической практике обычно используются ретровирусы и аденовирусы.

1. РЕТРОВИРУСЫ – это РНК-содержащие вирусы, репликация которых осуществляется через ДНК интермедиата. Генетическая информация вирусной частицы, полезный объём которой может составлять 9000 пар оснований, непосредственно внедряется в геном клетки-хозяина.

   Большинство ретровирусов эффективны только для делящихся клеток. Эти вирусы не применимы для клеток мышечной или нервной ткани, клеток печени и легких. Исключение составляют векторы лентивирусов. К их числу относятся вирусы ВИЧ-инфекции, которые также могут использоваться в генной терапии.

2. АДЕНОВИРУСЫ – имеют двухцепочечную ДНК и обычно позволяют доставлять существенно больший объём полезной генетической информации. Аденовирусы не внедряются в геном хозяйских клеток, и в процессе деления информация элиминируется. Эти вирусы эффективны при трансфекции, особенно в отношении клеток дыхательных путей, где может быть достигнута более чем 50%-я трансфекция, что на порядок выше, чем в случае ретровирусов.

Недостатки  использования вирусов:

- инициация иммунного ответа на введение инородного белка

- реактогенность самих вирусных препаратов

- часто – отсутствие тканевой специфичности

- трудности и дороговизна массового производства

- риск опухолеродных мутаций вируса или рекомбинации активных патогенных частиц  
 
 
 
 

5. Искусственные транспортные средства.
1. ПОЛИМЕРЫ.

    Полимерные молекулы, несущие избыточный катионный заряд, могут существенно повысить эффективность трансфекции.

Определённой  активностью обладают даже небольшие  молекулы (протамин, диметилсульфоксид, производные имидазола, грамицидин, липополиамин).

    Большую активность обычно проявляют синтетические полимеры (полиэтиленимин, полилизин, липополилизин или его конъюгаты с трансферрином, асиалоорозомукоидом, неогликопротеином, галактозой, маннозой), а также природные катионные белки (гистон Н1, галактозилированный гистон Н1, гистон Н4 в комплексе с ДНК и конъюгатом трансферрин-полилизин).

   Высокая эффективность богатых лизином пептидов и белков может быть обусловлена их сходством со специфическими сигнальными последовательностями, ответственными за транспорт из цитоплазмы в ядро. Полисахариды и белковые лиганды, входящие в состав перечисленных выше комплексов, определяют их сродство со специфическими рецепторами на поверхности клеток.

   Процессы взаимодействия таких комплексов с клетками имеет сходство с проникновением в клетку вирусных частиц.

2. ЛИПОСОМЫ.

   Обычно используются ДНК-липидные комплексы, содержащие плазмиду с "экспрессированной" кассетой.

   Преимущества ДНК-липидных комплексов по сравнению с вирусными векторами:

1. могут нести больший объём генетической информации;
2. не могут приобретать инфекционных свойств вследствие рекомбинации;
3. имеют более низкую вероятность инициации иммунного ответа или воспалительной реакции;
4. простота и дешевизна приготовления.

   Особенно перспективным представляется использование фосфолипидов, например, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина, образующих наряду с бислойными мембранами также инвертированные мицеллярные структуры, известные как кубические и гексагональные фазы, что определяет способность этих липидов инициировать слияние мембран. В присутствии катионов кальция или магния взаимодействие ДНК с фосфолипидами становится более прочным, липосомы агрегируют, и ДНК интернализуется во внутренний объём везикул. Использование высокомолекулярных катионных посредников, обеспечивающих формирование комплексов ДНК с фосфолипидами и взаимодействие этих комплексов с поверхностью клеток, потенциально могло бы улучшить их эффективность в трансфекции.

    Революцией явилось введение в практику первого низкотоксичного катионного липида ДОТМА (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан), синтезированного Фелгнером с соавторами. Одновременно был введён в практику новый термин "липофекция", подчёркивающий высокую эффективность генетической трансформации клеток, приближающую липосомальные препараты к инфекционным вирусным частицам.

   При введении в ткани "обнажённой" ДНК обычно экспрессировалась только одна молекула из нескольких миллионов, а ДОТМА увеличивал этот параметр примерно в 1000 раз.

6. МЕХАНИЗМЫ ЛИПОФЕКЦИИ.
1. ДОСТАВКА ДНК К ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК;

    ПРОБЛЕМА: ряд высокоэффективных катионных липидов инактивируется в присутствии даже незначительных количеств плазмы крови; некоторые органы имеют эндотелиальный барьер, препятствующий проникновению липосом.

   ВОЗМОЖНЫЕ РЕШЕНИЯ:

• Использование высокополимерных молекул (полиэтиленгликоля, например) на поверхности липосомы, что существенно увеличивает время циркуляции липосом в русле крови, делая их недоступными (невидимыми) для преципитации иммуноглобулинами.
• Для более направленной доставки поверхность липосом может нести антитела к клеткам-мишеням
• Могут быть использованы специфические клеточные рецепторы, например, рецепторы фолата, являющегося маркером опухолевых клеток.
• Могут использоваться вирусные белки слияния на поверхности липосом, что позволяет эффективно впрыскивать ДНК в цитоплазму (искусственные вирусы).

2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ  КОМПЛЕКСОВ С КЛЕТОЧНОЙ  ПОВЕРХНОСТЬЮ И ПРОНИКНОВЕНИЕ  В ЦИТОПЛАЗМУ;

    Природа механизма проникновения ДНК в цитоплазму до сих пор окончательно не исследована.

    Слияние липосом с плазматической мембраной на поверхности клетки, в результате чего внутреннее содержимое липосомы может попадать в цитоплазму, является наиболее простым и на первый взгляд очевидным механизмом транслокации ДНК.

    Однако имеются серьёзные аргументы в пользу того, что проникновение ДНК в цитоплазму происходит на значительно более поздних этапах, когда большая часть липосом интернализуется в цитоплазму.

   Этот процесс внешне напоминает эндоцитоз, так как в местах сорбции катионных везикул на поверхность клетки происходит инвагинация плазматической мембраны и отпочковывание внутрь цитоплазмы мембранного пузырька с катионными липосомами или ДНК-липидным комплексом во внутреннем пространстве. Инвагинация плазматической мембраны под воздействием сорбирующихся на её поверхности катионных липосом, очевидно, не требует специализированного механизма, так как наблюдается даже на поверхности эритроцитов.

3. ОСВОБОЖДЕНИЕ ДНК В ЦИТОПЛАЗМУ И ТРАНСПОРТ В ЯДРО.

    Большие массы эндоцитированного материала накапливаются в областях, примыкающих к ядру. Скопление большого количества материала в околонуклеарном пространстве свидетельствует о том, что именно этап освобождения ДНК из эндосом может быть фактором, лимитирующим эффективность трансфекции.

   Обычно эндосомы с захваченными внутри частицами, включая вирусы, трансформируются в лизосомы, с мембраной которых и происходит слияние вирусных частиц при низком рН. Напротив, в случае липофекции ингибирование функционирования лизосом за счёт увеличения рН хлористым аммонием или хлорохином повышало эффективность трансфекции в несколько раз. Освобождение ДНК в цитоплазму, по всей видимости, происходит из эндосом, минуя стадию образования лизосом. Более того, катионные липиды препятствуют попаданию ДНК в лизосомы.

    Существует гипотеза, что, механизм освобождения ДНК основан на обмене липидами между катионной липосомой и мембранами клетки, в результате чего катионный заряд нейтрализуется, и связь ДНК с липосомой ослабевает.

    При слиянии комплекса ДНК-катионный липид с мембранами анионного липида происходит фазовый переход в структуре комплекса, конечным этапом которого является распад комплекса на отдельные компоненты, состоящие из молекул ДНК, окружённых трубчатыми бислойными структурами липидов.

    Одной из возможных причин низкой эффективности трансфекции может быть то, что ДНК даже после освобождения из липосомы продолжает удерживать большое количество адсорбированного катионного липида.

    После освобождения в цитоплазму дальнейшее продвижение ДНК к ядру, возможно, происходит с использованием мало изученных механизмов клеточного транспорта. Возможно, что катионные липосомы способны освобождать ДНК непосредственно в ядро.

Однако  липофекция эффективна только на прикреплённых  культурах клеток. Комплексы в  значительной степени теряют активность при взаимодействии с плазмой крови и имеют весьма ограниченное применение in vivo.

7. ГЕНОТЕРАПИЯ РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
1. Моногенные наследственные заболевания.

   Наследственные заболевания, генокоррекция которых находится на стадии клинических испытаний (КИ), экспериментальных разработок (ЭК) и принципиально возможна (ПВ).

   Стадия клинических испытаний: иммунодефицит, гемофилия В, болезнь Гоше, муковисцидоз.

  Стадия экспериментальных разработок: гемофилия А, эмфизема лёгких, фенилкетонурия, мышечная дистрофия Дюшенна, талассемия, серповидноклеточная анемия, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хронический грануломатоз, респираторный дистресс-синдром.

   ПРИМЕР: Некоторые нарушения работы головного мозга (в частности, болезни Паркинсона и Альцгеймера) связаны с повреждением клеток, вырабатывающих нейромедиаторы. В результате мозг не может нормально регулировать двигательную деятельность человека.

   Такие болезни лечат препаратами медиаторной природы, однако, со временем организм утрачивает чувствительность к ним. Кроме того, они могут оказывать неблагоприятное побочное действие.

В последнее  время пытались лечить паркинсонизм пересадкой тканей, способных продуцировать  нейромедиаторы. Трансплантатом может  быть ткань мозга человеческих эмбрионов  или мозгового слоя надпочечников самого больного. Но при использовании чужеродных тканей возникают проблемы тканевой несовместимости, а также юридические и этические. Помимо этого такие операции далеко не всегда приводят к хорошим результатам.

    Ф. Гейдж с соавторами (Калифорнийский университет, Сан-Диего, США) в экспериментах на крысах использовал генную инженерию для борьбы с болезнями нервной системы. У животных забирали клетки кожи и вводили в них вирус, содержащий ген, кодирующий фермент тирозингидроксилазу. Фермент катализирует превращение аминокислоты тирозина в нейромедиатор L-ДОФА. Клетки со встроенным геном имплантировали в мозг крыс с предварительно разрушенным участком мозга, у которых наблюдались нарушения работы ЦНС, подобные болезни Паркинсона у человека. После пересадки модифицированных клеток у 40% животных состояние улучшилось. Авторы считают, что использование для пересадки собственных клеток реципиента перспективно для лечения больных     паркинсонизмом.