Введение
1 Обзор литературных данных
2 Материал и методика
исследования
3 Результаты и обсуждение
3.1 Цитогенетические исследования
3.1.1 Спонтанный мутагенез
3.1.2 Влияние неравномерного
фракционированного облучения на
прозанник пятнистый (Achyrophorus maculatus
L.)
3.1.2.1 Влияние на индуцированный
мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 5 Гр
3.1.2.2 Влияние на индуцированный
мутагенез γ-лучей 60Со в дозе 30 Гр
3.1.2.3 Значение временной
организации фракционированного
облучения в формировании радиологического
эффекта
3.2 Биохимические исследования
Заключение
Список использованной
литературы
Приложения
Введение
29 сентября 1957 года вследствие
теплового взрыва емкости с
радиоактивными отходами на Южном
Урале (химкомбинат «Маяк») произошла
одна из наиболее крупных ядерных
аварий. Суммарный выброс радионуклидов
был равен 7,4Ч1016 БкI. Исключительно
важное радиологическое значение
имело присутствие в составе
смеси долгоживущего радионуклида
– 90Sr с периодом полураспада
28,5 лет, что и предопределило
длительную опасность этого радиоактивного
загрязнения [5]. В результате указанного
выброса образовался ВУРСII –
уникальный полигон для изучения
эффектов хронического облучения
малыми дозами [7].
Изучение механизмов
радиорезистентности природных
популяций региона Кыштымской
аварии вносит вклад в разработку
проблемы накопления патологического
груза, механизмов адаптации к
радиационной среде, прогнозирования
отдаленных последствий и поиску
средств их коррекции [16]. Актуальность
этой проблемы определяется тем,
что на ясном понимании закономерностей
формирования биологических эффектов
малых доз ионизирующего излучения
должна основываться разработка
новой концепции радиационной
защиты человека и биоты [8].
В плане выяснения
природы явлений, наблюдающихся
при фракционировании дозы, значительный
интерес представляют работы
с описанием защиты от радиации
под действием предварительного
облучения малой дозой. Радиация
обладает многосторонним действием
на клетку и организм и наложение
двух доз отражается неодинаково
на отдельных составляющих радиационного
эффекта, влияя на выход цитогенетических
нарушений [12].
Целями настоящей работы
на высших растениях с территории
ВУРСа являются:
изучение влияния малых
доз ионизирующих излучений на
спонтанный мутагенез;
межвидовые сравнения
хромосомной нестабильности;
исследование эффекта
неравномерного фракционированного
облучения;
определение роли антиоксидантных
систем в формировании радиопротекторного
эффекта.
Для достижения целей
необходимо выполнение следующих
задач:
ознакомление с объектами
исследования и условиями их
обитания;
анализ состояния проблем
на сегодняшний день;
освоение методик исследований
и применение их на практике;
применение методов
вариационной статистики для
обработки и анализа эмпирических
данных.
1 Обзор литературных данных
Изучение мутационного
процесса в природных популяциях,
подвергающихся хроническому действию
ионизирующих излучений, важно
в связи c задачами, возникающими
в теории эволюции, с разработкой
проблем охраны окружающей среды,
для прогнозирования отдаленных
генетических последствий загрязнения
биосферы радионуклидами [4].
Среди классических
методов радиобиологии и радиационной
генетики наибольший интерес
представляет прием повторного
действия мутагенов. При взаимодействии
эффектов двух доз возможно
модифицирующее влияние предыдущего
облучения на результат последующего.
Фракционирование дозы облучения
является методом анализа процессов
восстановления [12, 25], кроме того, оно неодинаково
отражается на отдельных составляющих
радиационного эффекта. При повторном
облучении в определенных условиях возникает
эффект защиты, который наиболее легко
обнаружить при использовании первого
облучения в небольшой дозе [12]. Считается,
что хроническое облучение является частным
случаем фракционирования дозы [25].
Решающим фактором
в ответной реакции клетки
является доза. Клетка обладает
способностью устранить нанесенное
ей повреждение. Помимо суммарной
дозы на ход реакции восстановления
влияет и мощность доз. Как
правило, при уменьшении мощности
доз, т.е. при растягивании времени
облучения, процесс восстановления
выражен сильнее, а лучевое
поражение меньше [11].
Многие авторы указывают
на повреждающее действие повышенного
фона радиоактивности, однако
положительное действие малых
доз радиации также широко
известно: стимуляция биологических
процессов: роста, развития, выживаемости,
плодовитости, исцеления и др. [12,
21]. В популяциях дикорастущих
растений, произрастающих на загрязненных
радионуклидами территориях, произошли
адаптационные изменения, выражающиеся
в повышенной радиоустойчивости
по сравнению с популяциями
тех же видов, произрастающими
на чистых незагрязненных почвах
[3, 4, 17, 24]. Одним из механизмов
повышения радиоустойчивости облучаемых
организмов является увеличенное
содержание в их тканях антиоксидантов
[17]. Однако мутационный процесс
в облучаемых популяциях растений
протекает более интенсивно по
сравнению с контрольными [4, 24].
Сравнение биохимических
показателей у двух видов мелких
млекопитающих, обитающих на контрольных
и радиационно-загрязненных территориях
ВУРСа позволило отнести характеристики
окислительно-восстановительного метаболизма
к основным физиологическим детерминантами
(определителями) их радиорезистентности
к длительному низкоинтенсивному
воздействию [16].
Приступая к экспериментам
с предварительным облучением
малой дозой, авторы [13] предполагали,
что данное воздействие может
вызвать скрытые лучевые повреждения,
снижающие выживаемость объекта
после дополнительного облучения
массивной дозой, однако их
предположения не подтвердились.
Снижение частоты хромосомных
аберраций при фракционировании
дозы связано с обратимыми
физиологическими изменениями в
клетке, которые делают хромосомы
менее чувствительными ко второй
экспозиции [1]. Авторами [13] высказывается
предположение, что радиобиологические
эффекты радиостимуляции и повышения
радиорезистентности под влиянием
предварительного облучения малыми
дозами регулируются единым механизмом.
В основе радиационно-химических
изменений молекул могут лежать
два механизма. 1. Прямое действие,
при котором данная молекула
испытывает изменение непосредственно
при прохождении через нее
кванта энергии. 2. Косвенное действие
– изменяемая молекула непосредственно
не поглощает энергию падающего
излучения, а получает ее путем
передачи от другой молекулы [9,
25].
Ионизирующие излучения
характеризуются незадержанным
эффектом индуцирования аберраций
хромосом [12], что позволяет использовать
в качестве количественного показателя
радиочувствительности подсчет
клеток с хромосомными перестройками.
Оценка поражения может проводиться
путем мета- или анафазного анализа,
но первый из них весьма
трудоемок. При анализе анафаз
легко различимы «летальные»
для клетки аберрации – дицентрики
и фрагменты; достоинством этого
метода является относительная
простота, делающая его доступным
и в то же время достаточно
корректным для оценки радиочувствительности
[25]. Часть аберраций, как, например,
дицентрики, механически препятствует
делению клетки; появление ацентрических
фрагментов приводит к неравномерному
разделению и утрате генетического
материала, вызывающего гибель
клетки из-за нехватки метаболитов,
синтез которых кодировался ДНК
утраченной части хромосомы [11,
25]. Учет частоты фрагментов, однако,
не является достаточно надежным
показателем вследствие того, что
фрагменты могут вовлекаться
расходящимися хромосомами в
анафазные шапки, где они не
обнаруживаются, после чего элиминируются,
объединяясь в микроядра; к
тому же, фрагменты могут теряться
в процессе приготовления препаратов
[12, 25].
Структурно-метаболическая
теория (СМТ) в радиобиологии является
современным обобщением огромного
фактического материала и ранее
существовавших теорий в радиобиологии
в свете представлений о неразрывном
единстве и взаимовлиянии структуры
и метаболизма. СМТ исходит
из положения, что при действии
радиации на клетку первичные
процессы возникают во всех
ее структурах и затрагивают
многие метаболические процессы,
неразрывно связанные с этими
структурами. Любой радиобиологический
эффект возникает во времени
в результате взаимодействия
многих процессов, как развившихся
после облучения, так и нормально
протекающих в клетке. СМТ подчеркивает
значение фактора времени в
проявлении любых радиобиологических
эффектов. Скорость протекания процессов,
происходящих в клетке после
облучения, будет зависеть не
только от места и величины
поглощенной энергии, наличия
веществ, обрывающих цепные процессы.
Структурно-метаболическая теория
рассматривает механизмы поражающего
действия сублетальных и летальных
доз радиации, так и стимулирующего
действия малых доз радиации.
СМТ является общей теорией
действия радиации на биологические
объекты, начиная с клеточного
уровня и заканчивая высокоорганизованными
многоклеточными организмами [9].
2 Материал и методика
исследования
Объектами исследования
являются многолетние травянистые
растенияIII: Прозанник пятнистый
– Achyrophorus maculatus L. (семейство Сложноцветные;
2n = 10, рис. 1А; стр. I) и два вида
подорожника: Подорожник ланцетолистный
– Plantago lanceolata L. (2n = 12, рис. 1Б) и
Подорожник средний – Plantago media
L. (2n = 24, рис. 1В, оба из семейства
Подорожниковые) [13]. Семена всех
видов растений были собраны
на территории Восточно-Уральского
радиоактивного следа как с
контрольных участков, так и с
загрязнённых радионуклидами 90Sr–90Y
и 137Cs. В местах сбора материала
первоначальное загрязнение составляло
1500-2000 КиIV/км2; 90% дозы формируется
за счёт распада 90Sr и 10% –
за счёт 137Cs. В настоящее время
прошло 1,7 периодов полураспада радиостронция
и остаточное загрязнение составляет
525 Ки/км2 (интенсивность γ-излучения
0,8 рад/сутки) (рис. 2; стр. II) [15].
Реагенты: раствор гидроперита
(0,0025 М), раствор крахмала (0,125% по
массе), раствор йода (0,0125% по массе).
Оценка уровня спонтанного
мутагенеза проводилась на всех
указанных видах, эффекты фракционированного
облучения – на A. maculatus, биохимические
исследования – на двух видах
подорожника.
Семена A. maculatus провокационно
облучались γ-лучами 60Co при мощности
дозы 219 рад/минV. Применялось неравномерное
фракционированное облучение (начальная
доза 5 ГрVI; разрешающая доза 30 Гр) с
интервалами между фракциями
1 час или 1 сутки. Изучались
варианты: без облучения, с облучением
в малой дозе (5 Гр), с облучением
в массивной дозе (30 Гр), а также
варианты с различной временной
организацией облучения (сочетание
5 Гр + 30 Гр).
Исследуемые семена
проращивались, и фиксировались
проростки по достижении длины
корешка в 4-5 мм для прозанника
и 2-3 мм для подорожников в
смеси этанола и «ледяной»
уксусной кислоты в компонентном
отношении 3:1. Учитывались частоты
хромосомных аберраций в ана-телофазе
митоза в клетках корешков, для
чего растения окрашивали ацетокармином
в течение 5-15 минут на водяной
бане. Давленые временные микропрепараты
изготовлялись из кончика корешка
длиной около 2 мм. Наблюдения производили
при 600-кратном увеличении с водной иммерсией,
используя зеленый фильтр. В каждом варианте
просчитывалось в среднем по 500 ана-телофаз.
Микропрепараты фотографировались
по авторской методике без
применения аналогового цифрового
преобразователя при 900-кратном
увеличении с масляной иммерсией
с помощью цифрового фотоаппарата
мобильного телефона LG B2100 (рис. 3; стр.
III, IV).
Биохимические исследования
проводились на P. lanceolata и P. media методом
йодометрии (титрование), в основе
которого лежит реакция [6, 22]: 5H2O2
+ I2 = 4H2O + 2HIO3.
Отобранные для анализа
растения, тщательно очищенные от
земли и обсушенные фильтровальной
бумагой до постоянного веса,
взвешивались и растирались со
стеклянным порошком в фарфоровой
ступке. Полученная смесь разводилась
дистиллированной водой в расчете
9 мл воды на каждые 100 мг растения
и центрифугировалась на ручной
центрифуге в течение 5 минут
при скорости вращения 1200 об/мин.
В раствор гидроперита,
объёмом 5 мл, добавлялись 0,2 мл
надосадочной жидкости, и смесь
выдерживалась в течение 30 секунд,
после чего приливались 3 мл
раствора крахмала в качестве
индикатора. Смесь титровалась йодом
до получения эталонной голубой
окраски, сохраняющейся в течение
3 секунд, после чего регистрировался
объём затраченного йода.
Для статистической
обработки данных использовались
следующие методы: дисперсионный
анализ двухфакторных неравномерных
комплексов для качественных
признаков; дисперсионный анализ
однофакторных комплексов для
качественных признаков; критерий
χІ; точный критерий Фишера (F); критерий
Стьюдента (td); критерий «ФИ» (Fφ).
Для данной обработки в таблицах
Excel автором работы были созданы
алгоритмы вычисления необходимых
показателей с использованием
литературы [14, 23].
3 Результаты и обсуждение
3.1 Цитогенетические исследования
Результаты данных
исследований позволяют выявить
зависимость изменения радиочувствительности
высших растений как минимум
от трех факторов: хронического
β-, γ-облучения; числа хромосом
в кариотипе (плоидности); предварительного
γ-облучения при неравномерном
фракционировании дозы. Результаты
математической обработки данных
представлены в таблицах 1, 2 и
на рисунках 5-10.
3.1.1 Спонтанный мутагенез
Хроническое облучение
вызывает достоверное увеличение
частоты аберрантных анафаз в
опытных популяциях A. maculatus (p << 0,001)
и P. media (p < 0,01), в то же время,
в популяциях P. lanceolata отмеченного
феномена не наблюдается (p >
0,05), что не противоречит литературным
данным [22]. Возрастание частоты аберрантных
анафаз связано с ускоренным
накоплением мутационного груза
[2, 3, 4], так как фон от радионуклидов
более чем в 100 раз превышает
естественный радиационный фон.
В хронически облучаемых
популяциях прозанника по сравнению
с контрольными происходит достоверное
увеличение частоты дицентриков
(χІ = 26,96, ν = ∞, р < 0,001; рис. 6; стр.
VI). В эксперименте облучали покоящиеся
семена, поэтому двойные разрывы
хромосом, приводящие к образованию
дицентриков, оставались нереализованными
до начала прорастания, когда,
вследствие увеличения теплового
движения, обломки хромосом смещаются,
образуя разнообразные транслокации
(рис. 3-4; стр. III–IV), то есть из потенциальных
повреждения переходят в летальные
[12]. Однако в популяциях обоих
видов подорожника изменения
частоты дицентриков не происходит
(р >> 0,05; рис. 6; стр. VI).
Не обнаружены отличия
в частоте ацентрических фрагментов
в опытных и контрольных популяциях
A. maculatus (F = 0,98, ν = 27, р >> 0,05; рис.
7; стр. VI), в тоже время, в опытных
популяциях P. lanceolata наблюдается достоверное
увеличение частоты этого вида
аберраций по сравнению с контрольными
(p < 0,01; рис. 7; стр. V). Однако в хронически
облучаемых популяциях P. media отмечено
достоверное (р < 0,001) снижение
частоты ацентрических фрагментов по
сравнению с незагрязненными радионуклидами
популяциями.
Как известно, растения
с большей плоидностью обладают
повышенной неспецифической устойчивостью
к действию экстремальных абиотических
факторов среды обитания, например,
в более высоких широтах преобладают
полиплоидные формы, имеющие селективные
преимущества по сравнению с
диплоидными [18]. Дисперсионный анализ
показал достоверное (F = 15,0; ν =
1500; р < 0,001) влияние фактора плоидности
на радиоадаптивный ответ исследованных
растений: у P. media отмечена меньшая
частота аберрантных анафаз как
в контрольных (р < 0,001), так
и в опытных (р < 0,01) популяциях
по сравнению с популяциями
P. lanceolata, произрастающими в таких
же экологических условиях.
3.1.2 Влияние неравномерного
фракционированного облучения на
прозанник пятнистый (Achyrophorus maculatus
L.)
Из результатов двухфакторного
дисперсионного анализа следует,
что как хроническое облучение
(p < 0,01), так и различным образом
организованное дополнительное
радиационное воздействие (p <<
0,001), а также сочетания этих
факторов достоверно (p << 0,001) изменяют
радиобиологический ответ исследованных
растений.
3.1.2.1 Влияние на индуцированный
мутагенез γ-лучей 60Со в дозе
5 Гр
Облучение в дозе 5 Гр
в контрольных популяциях не
вызывает достоверного изменения
частоты как аберрантных анафаз
(td = 1,56, ν = ∞, р >> 0,05; рис. 8; стр.
VIII), так и частоты дицентриков
(Fφ = 1,56, ν = ∞, р >> 0,05; рис.
9; стр. IX) и ацентрических фрагментов
(F = 0,94, ν = 18, р >> 0,05; рис. 10; стр.
IX). Данные факты позволяют дозу
γ-лучей в 5 Гр считать малой
для данного вида.
В опытных популяциях
частоты аберрантных анафаз (td = 6,77,
ν = ∞, р < 0,001; рис. 8; стр. VIII) и
ацентрических фрагментов (F = 27,08, ν
= 19, р < 0,001; рис. 10; стр. IX) достоверно
возрастают, но частота дицентриков не
изменяется (Fφ = 0,69, ν = ∞, р >> 0,05; рис.
9; стр. IX).
3.1.2.2. Влияние на индуцированный
мутагенез γ-лучей 60Со в дозе
30 Гр
Влияние провокационной
дозы в 30 Гр на опытную и
контрольную популяции проявляется
в достоверном увеличении как
частоты аберрантных анафаз (р
< 0,001), так и общей частоты
аберраций (дицентрики + фрагменты).
Между контрольной и опытной
популяциями по указанным показателям
различий не наблюдается (p >>
0,05), что свидетельствует о достаточности
этой дозы для возникновения
устойчивого цитогенетического
эффекта. В то же время, обращает
на себя внимание отсутствие
различий в эффектах доз в
30 и 5 Гр в опытной популяции,
что может свидетельствовать,
на наш взгляд, о действии дополнительных
не учитываемых факторов при
воздействии малой дозой (рис.
8).
3.1.2.3 Значение временной
организации фракционированного
облучения в формировании радиологического
эффекта
Реакции, возникающие
в облученной клетке, подчиняются
кинетическим закономерностям, скорость
достижения конечного состояния
будет определяться не только
скоростью прямых, но и скоростью
обратных реакций (процессов восстановления).
Кинетика процесса будет зависеть
от ингибиторов и катализаторов
реакции, наличия веществ, обрывающих
цепные процессы и других условий
[9].
Из данных [20] следует,
что существует два механизма
адаптивного ответа у растений.
Первый – это повышение способности
репарировать повреждения ДНК
после воздействия малой дозой.
Второй – стимулированная репопуляция
– феномен, заключающийся в
замещении поврежденных клеток
неповрежденными.
При часовом интервале
между фракциями в контрольных
популяциях наблюдается радиологический
эффект, подчиняющийся принципу
аддитивности: эффекты двух фракций
суммируются, так как получено
достоверное (p < 0,001) увеличение
частоты аберрантных анафаз по
сравнению с эффектом дозы
в 30 Гр. В опытной популяции
не обнаружено отличий между
аналогичными вариантами (p > 0,05; рис.
8). Представленные данные свидетельствуют,
что у растений из опытной популяции процессы
восстановления протекают интенсивнее,
что может быть объяснено приспособлением
к действию повышенного фона радиации.
В обеих исследованных
популяциях наблюдается достоверное
снижение частоты аберрантных
анафаз при увеличении интервала
между фракциями (p < 0,001). Следует
обратить внимание, что в опытной
популяции частота аберрантных
анафаз в варианте с суточным
интервалом между фракциями достоверно
(Fφ = 4,21, ν = ∞, р < 0,05) меньше,
чем в контроле. Данные явления
могут быть объяснены процессом
стимулированной репопуляции, более
интенсивно протекающим в растениях
из загрязненной популяции.
3.2 Биохимические исследования
Результаты биохимических
исследований представлены в
таблице 3 и на рисунках 11, 12 (стр.
X), из которых следует, что при
добавлении 0,2 мл надосадочной жидкости,
содержащей антиоксидантные ферменты,
достоверно снижается расход
йода (р < 0,01), свидетельствующий
о работе антиоксидантных систем.
Эти же данные говорят о
том, что в пробах обоих видов
подорожника, обитающих на загрязненных
территориях, антиоксидантные системы
работают активнее (p < 0,001). Кроме
того, у вида с 2n = 24 (P. media) по
сравнению с видом с 2n = 12 (P.
lanceolata) расход йода в высшей
степени достоверно ниже как
в опытных, так и в контрольных
вариантах (p < 0,001) (рис. 12). Сказанное
свидетельствует о том, что,
во-первых, хроническое низкоинтенсивное
γ-облучение, вызывающее образование
в цитоплазме пероксидов и
свободных радикалов, способно
активировать антиоксидантные системы
у облучаемых растений; во-вторых,
у растений с большей плоидностью
антиоксидантные ферменты либо
активнее, либо присутствуют в
клетках в большем количестве.
Представленные данные доказывают
предположения авторов [16], что
характеристики окислительно-восстановительного
метаболизма являются основными
физиологическими детерминантами
радиорезистентности организмов
к длительному низкоинтенсивному
воздействию.
Вопрос о природе
повышенной радиоустойчивости хронически
облучаемых популяций растений
остается открытым. Несмотря на
то, что действие повышенного
фона радиации, индуцирующего накопление
мутационного груза, в исследованных
районах имеет место уже в
течение полувека, специфического
приспособления к мутагенному
действию данного экологического
фактора у организмов не выработалось.
Одним из ведущих механизмов выступает
активация хроническим β- и γ-облучением
репарационных систем [3, 17]. На выход индуцированных
мутаций влияют генотипические различия
организмов, которые обязательно имеют
место как внутри популяций, так и между
популяциями в особенности. Далее, вновь
возникающие наследственные изменения
в природных условиях будут подвергаться
естественному отбору, направленному,
прежде всего на повышение радиоустойчивости
[2, 4, 19, 24]. По мнению ряда авторов [2, 3, 4,
19], ионизирующие излучения способны выступать
не только мутагенным, но и новым экологическим
фактором, отбирающим радиорезистентные
фенотипы и гаметы, содержащие оптимальные
геномы [2, 19]. Кроме того, из полученных
нами данных следует, что еще одним механизмом
радиопротекторного эффекта является
активация антиоксидантных систем, разрушающих
продукты радиолиза воды и органических
веществ. Выяснено, что у растений с большей
плоидностью радиопротекторный эффект
выражен существенно ярче, объясняющий
более низкий уровень спонтанного мутагенеза
у подобных растений (рис. 5, стр. V; рис.
12, стр. X).
Заключение
На основании полученных
и проанализированных результатов
можно сделать следующие выводы:
Хроническое облучение
в течение 50 лет приводит к
достоверному повышению уровня
мутационного процесса в популяциях
многолетних растений: Achyrophorus maculatus
и Plantago media. В то же время,
в популяциях Plantago lanceolata аналогичный
эффект отмечен на уровне тенденции.
Радиорезистентность
высших растений на примере
родственных видов подорожника
зависит от их плоидности: вид
с 24 хромосомами (P. media) оказывается
более радиорезистентным по сравнению
с видом с 12 хромосомами (P. lanceolata).
Впервые на высших
растениях показана повышенная
эффективность работы антиоксидантных
систем у полиплоидных форм, вероятно,
объясняющаяся их большей неспецифической
устойчивостью.
В обеих популяциях
(контрольной и опытной) A. maculatus в
вариантах с часовым интервалом
между фракциями радиационный
эффект подчиняется принципу
аддитивности, в то же время,
при суточном интервале между
фракциями индуцируется высоко
достоверный радиопротекторный
эффект, особенно ярко проявляющийся
в опытной популяции.
Радиопротекторные механизмы
хронического и предварительного
низкоинтенсивного облучения схожи,
и основными из них являются:
а) активация репарационных систем;
б) отбор наиболее радиорезистентных
фенотипов и гамет с оптимальным
геномом; а также в) активация
антиоксидантных систем растений,
длительное время обитающих в
условиях хронического низкоинтенсивного
облучения.
