Клітинна селекція ярого ріпаку в умовах in vitro на стійкість проти посухи

Міністерство  освіти України

 

 

 

 

Кафедра селекції та насінництва

 

 

 

 

Курсовий проект на тему:

 

 

« Клітинна  селекція ярого ріпаку в умовах in vitro на

 

стійкість проти посухи »

 

 

 

 

 

 

 

                               

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Київ – 2008

 

 

Зміст..........................................................................................................................2

Вступ.........................................................................................................................3

1. Короткий огляд літератури ...............................................................................5
1. Ботанічна характеристика та біологічні характеристики ярого ріпаку..............................................................................................................5
2. Одержання посухостійких рослин в культурі in vitro.................................................................................................................8
3. Мікроклональне розмноження цінних генотипів ярого ріпаку............................................................................................................14

2. Експериментальна частина...............................................................................19

2.1. Вихідний матеріал та методика досліджень.............................................19

2.2. Вивчення стійкості проростків ріпаку до посухи та введення їх в культуру in vitro….......................................................................................22

2.3. Отримання асептичних рослин ярого ріпаку із насіння..........................23

2.4. Підбір поживного середовища для культивування ярого ріпаку...........27

2.5. Отримання калусу із різних експлантів....................................................29

2.6. Відбір посухостійких калусних ліній ярого ріпаку..................................31

2.7. Одержання посухостійких рослин-регенерантів ярого ріпаку...............33

2.8. Укоріненя посухостійких рослин-регенерантів ярого ріпаку.................34

2.9. Адаптація і висадження в умови відкритого грунту рослин ярого ріпаку............................................................................................................35

2.10. Досягнення сучасної селекції ярого ріпаку……………...........................37

3. Розрахункова робота  ………………………………………………………...38

Висновки................................................................................................................42

Список використаної літератури.........................................................................43

 

 

 

 

Вступ

Селекційні програми більшості країн світу щодо ріпака спрямовані на вирішення наступних завдань:

• створення високоврожайних сортів типу «00» і «000», технічних (типу «-0») сортів;
• покращення жирно-кислотного складу олії та якості шроту;
• створення гібридів ріпака на основі чоловічої стерильності, несумісності;
• підвищення стійкості сортів і гібридів до абіотичних, біотичних та едафічних факторів середовища;
• отримання трансгенних сортів і гібридів із господарсько цінними ознаками.

Нові селекційні завдання потребують повної та об'єктивної інформації про вже існуючий вихідний матеріал, який використовується в селекції, а також отримання нового, створення якого забезпечується значним потенціалом генотипової мінливості виду за ознаками адаптивності й господарської цінності.

Міжсортова  гібридизація і надалі залишається  основним методом, який використовується при створенні нових сортів ріпака. Успіх гібридизації багато в чому визначається правильним підбором для схрещування батьківських форм. Тому знання закономірностей мінливості господарсько цінних ознак, які визначають продуктивність і якість насіння в рослин ріпака, допоможе ефективніше підбирати вихідні форми для схрещування і проводити добір цінних генотипів.

Дослідженнями встановлено, що такі ознаки, як: тривалість вегетаційного періоду, висота рослин, довжина стручка, кількість насінин у стручкові, маса 1000 насінин, вміст олії, білка, пальмітинової та стеаринової кислот, а також олеїнової, лінолевої та ліноленової кислот в олії характеризується відносно слабкою сортовою мінливістю (до 9,4%). Середньою мінливістю відрізняються такі ознаки, як: урожай насіння, висота штамба, діаметр стебла біля основи, кількість гілок першого порядку, довжина центральної китиці, кількість стручків на головному суцвітті, довжина носика стручка і довжина стручка (до 17,2%). Сильною мінливістю (20,9-38,2%) характеризуються такі ознаки, як архітектоніка рослин, якість олії (вміст ейкозенової та ерукової кислот), шроту (вміст глюкозинолатів у насінні).

До оптимального набору ознак для добору рекомендується включати: висоту рослини, кількість гілок першого порядку, довжину центральної китиці, кількість стручків на головному суцвітті й на рослині, масу 1000 насінин і кількість насінин у стручкові.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Короткий  огляд літератури

1.1. Ботанічна  характеристика та біологічні  характеристики ярого ріпаку

Ріпак має озиму та яру  форми, що за морфологічними ознаками не різняться.

В озимого  ріпаку (Brassica napus L. Ssp. oleifera biennis D. C.) і ярого ріпаку (Brassica napus L. Ssp. oleifera annua Metzg.), який нерідко в Україні називають кользою, формується потужний кущ заввишки 160 см і більше, з діаметром біля основи стебла 14—18 мм [20]. Прикоренева розетка листків компактна. Корінь стрижневий, слабко розгалужений, проникає у глибину до 1 м. Коренева система ріпаку — могутній розпушувач підґрунтя, що має важливе значення для зниження ефекту ущільнення, зумовленого дією сільськогосподарських машин [12].

На одній  рослині ріпаку може утворюватися близько 4000 квіткових зачатків. На жаль, цей великий потенціал продуктивності насправді використовується лише на 5-10 %.

Ріпак - факультативний самозапильник, однак деякі автори вважають, що ця культура може мати різні співвідношення типів запилювання, що залежить від сортових особливостей тієї чи іншої форми. Зокрема, про здатність квіток ріпаку до перехресного запилення свідчать добре розвинені нектарники, розміщені біля основи пиляків з їх внутрішнього боку. При цьому нектар, що виділяється квітками, є принадою для комах, які відіграють важливу роль в його запиленні. За допомогою комах запилюється 4-20 % квіток [16].

У той же час  значна частина його квіток можуть самозапилюватися. Здатність до самозапилення має переважна більшість квіток ріпаку як в озимих, так і в ярих форм.

Цвітіння  ріпаку триває близько 30 днів. Він добрий медонос: з гектара посіву одержують 90-100 кг меду.

Ріпак у своєму розвитку проходить 4 періоди: І —  утворення листків; II — утворення генеративних органів; III — цвітіння; IV — достигання, що діляться на 12 етапів органогенезу та 20 фенофаз [14].

Основні фази вегетації ріпаку: проростання насіння, сходи, утворення розетки, стеблування, бутонізація, цвітіння, дозрівання [4].

Суцвіття  — нещільна китиця, що складається  з 20—40 квіток. Квітки жовті, бувають  різних відтінків. Квітконіжка завдовжки 1,4—2,5 см. Чашолистики квіток вузькі. Квітка має 4 пелюстки і 6 тичинок; чотири тичинки однакової довжини з маточкою, а дві — значно коротші. На пиляках усіх тичинок є чорно-бурі плями.

Плід - вузький  стручок завдовжки 5-10 см, завширшки 3—4 мм, з гладенькою або слабкогорбкуватою поверхнею. Носик стручка схожий на дзьобика. Стручок має дві стулки, розділені перетинкою. В одному стручку буває 18-40 насінин. Насіння діаметром 1,5-2,4 мм, округло-кулясте, чорного, сірувато-чорного або світло-коричневого кольору. Маса 1000 насінин — 3—7 грамів. Насіння у воді не ослизнюється. Розміри насіння залежать від сорту і умов вирощування.

Ріпак - рослина  холодостійка, волого- і світлолюбна. Вегетаційний період у ярого ріпаку триває 85-90.

Згідно з даними літератури, ріпак потребує грунтів з нейтральною або слабкокислою реакцією сольового розчину, що властиво чорноземам опідзоленим, темно-сірим та сірим лісовим грунтам, дерново-підзолистим, дерново-карбонатним, дерновим та дерново-глеюватим грунтам з легко- та середньосуглинковим механічним складом.

Ріпак погано росте на грунтах, важких за механічним складом, з водонепроникним підорним шаром. Торфовища, грунти, легкі за механічним складом, з недостатньою теплопровідністю та кислі без вапнування майже непридатні для вирощування ріпаку.

Найбільш  сприятливі для вирощування ріпаку грунти, поширені в Прикарпатті, Степу і Лісостепу.

Якщо грунт  під час передпосівного обробітку  не пересушений і посіяно ріпак в оптимальні строки, сходи з'являються на 6—8-й день.

Випадання дощу прискорює  появу сходів на 1—3 дні. Посуха у  фазі цвітіння може призвести навіть до опадання квіток, скорочення тривалості цвітіння, внаслідок чого знижується насіннєва продуктивність рослин.

Ріпак добре реагує на часті, але не сильні дощі. Експери ментально встановлено, що для формування однієї частини сухої речовини ріпак витрачає 500—700 частин води. Найбільш оптимальний водно-температурний режим для ріпаку у весняно-літній період.

Необхідна для  ріпаку сума активних температур – 1900—2100° С. Озимий ріпак можна вирощувати в регіонах, де взимку температура ґрунту на глибині залягання кореневої системи не буває нижчою мінус 10° С.

Ярий ріпак — холодостійка рослина. Його насіння проростає при температурі 1—3° С, дружні сходи (через 5—7 днів) з'являються при 9—12° С. Сходи витримують заморозки до мінус 3—4° С, а в стадії кількох листків — короткочасні заморозки до мінус 7-8° С [3].

Для наростання вегетативної маси необхідна температура 18—20° С, у період цвітіння і дозрівання насіння найбільш сприятлива — 23—25°С. Ярий ріпак вирощують у зоні з помірним і достатньо вологим кліматом, де максимум опадів припадає на другу половину літа. В Україні його можна вирощувати у досить великому західному регіоні і на Поліссі. Чим далі на північ — тривалість вегетаційного періоду ріпаку збільшується.

1.2. Одержання  посухостійких рослин в культурі in vitro.

Об'єктом для мутагенезу і селекції можуть бути калусні, суспензійні  культури або ізольовані протопласти. Вибір об'єкту залежить від наявності  розробленої технології стосовно до конкретної культури, а також від кінцевої мети дослідження.

Калусна тканина - доступний  матеріал, яким відносно легко одержують у лабораторних умовах. Використовують свіжовиділену калусну тканину, що не втратила регенераційної здатності. Відбір мутантів за допомогою калусних тканин часто використовують при селекції ліній, стійких до фітозахворювань і стресових факторів .

Клітинна суспензія - це поодинокі клітини або клітинні агрегати, які вирощують на рідкому  поживному середовищі в умовах постійної аерації. Аерація об'єктів забезпечується такими способами:

- культурою клітин, які  занурені у рідке пожинає середовище  на качалках ротаційного або  шейкерного типу (накопичувальне  культивування);

- вирощуванням шматків  калусу на містках-підтримках з фільтрувального паперу.

Більшість суспензійних культур одержують шляхом перенесення  шматочків пухкої калусної тканини  на рідке поживне середовище, яке  постійно перемішується. Бажано переносити великі шматки щоб вони забезпечували  достатню кількість у середовищі окремих клітин або маленьких агрегатів калусу. Швидкість обертання кругової качалки повинна бути у межах .30-150 об/хв з амплітудою обертання 2 - 4 см . Через певний проміжок часу процес зупиняють; системі дають відстоятись і піпеткою (шприцем) відбирають верхній шар суспензійної культури клітин [3].

Для вилучення великих  за розмірами агрегатів клітин існує  спосіб фільтрування культури крізь  нейлонове сито.

Ріст клітинної популяції  при циклічному вирощуванні накопичувальної  культури відображається S-подібною кривою. В процесі субкультивування клітини проходять наступні послідовні фази:

1. латентну або лаг-фазу;

2. експоненціальну (логарифмічну) фазу;

3. лінійну фазу;
4. стаціонарну фазу;
5. фазу загибелі клітини.

 

Цикл росту вимірюється  часом виходу культури на стаціонарну фазу.

Накопичувальні суспензії, як правило, культивують до стаціонарної фази росту, що у більшості випадків складає тривалість пасажу 21-28 днів (популяція з клітин 10⁶ – 5х10⁶ клітин/мл), Концентрація клітин в 1 мл суспензії - щільність клітинної популяції - один з найважливіших показніків стану суспензійної культури, який підраховують після нанесення суспензії на сітку лічильної камери Горяєва або Фукса-Розенталя [15].

Широкі можливості для  клітинної селекції спонтанних та індукованих  мутантів відкривають технології ізольованих протопластів. У великих однорідних популяціях гаплоїдних або диплоїдних протопластів проводять кількісні дослідження мутагенезу соматичних клітин, аналізують експресію індукованих фенотипових змін на клітинному і організменому рівні. Основними вимогами, що ставляться до модельних об'єктів у клітинній селекції, є швидкий ріст в культур in vitro, збереження регенераційної здатності, невелика кількість хромосом, наявність високоефективної методики виділення і культивування протопластів або клітин, існування справжніх гаплоїдів, короткий життєвий цикл рослин.

Необхідно відмітити, що оцінити внесок клітинної селекції в процес сомаклональної мінливості досить важко. Для цього бажано методично  чітко відокремлювати дві складові єдиного процесу формоутворення - сомаклональну варіабельність і селективний відбір.

Спадкова передача ознак  від батьківських клітин своїм нащадкам - процес консервативний, але ця консервативність не є абсолютною. У деяких випадках мають місце помилки, в результаті чого структура хромосом або послідовність нуклеотидів ДНК дочірних клітин стає іншою. Ці раптові, зміни спадкового матеріалу називають мутаціями. Клітини або організми, які є носіями змінених генів і відрізняються від вихідного (дикого) типу, називають мутантами. Мутації можуть стосуватись як ядерних генів, так і їх цитоплазматичних структур, що несуть у собі ДНК (мітохондрії, хлоропласти) [11].

 Розрізняють такі  типи мутацій:

1. Генні, або точкові,  мутації - спадкові зміни гена, які можна, ідентифікувати методами гібридологічного аналізу за характером ознак, що фенотипово виявляються у нащадків. Генні мутації частіше відбуваються в одному з двох алельних локусів пари гомологічних хромосом. По відношенню до алельних генів дикого типу мутантні гени є переважно рецесивними. Іноді вони виявляються домінантними. Гомозиготний стан рецесивних мутацій частіше буває летальним, іноді - нейтральним і дуже рідко може позитивно відбиватися на життєдіяльності особин.

Це положення справедливе  не тільки для генних, але й для всіх інших типів мутацій.

2. Хромосомні мутації  - одна або декілька хромосом  виявляють структурні зміни. Характеризуються  змінами у морфологічних структурах  хромосом, викликаними розривами  та перебудовами хромосомного матеріалу.

3. Геномні мутації обумовлені змінами числа хромосом в хромосомних наборах (геномах) або ж змінами кількості хромосомних наборів у мутованих клітинах. Геномні мутації, як правило, викликають явище поліплоїдії.

4. Плазмонні мутації виникають  внаслідок можливих, мутацій позахромосомних спадкових структур клітини, окрім локалізованих у пластидах.

5. Пластидні мутації характеризуються  змінами пластид, хлорофільних  зерен. Викликані мутаціями спадкових  факторів (генів), які локалізовані  у пластидах. Відрізнити плазмонні  мутації від пластидних методами гібридологічного аналізу неможливо. У цих випадках аналізують обумовлений пластидними мутаціями характер успадкування білоплямистості, строкатолистості у зелених рослин, Крім того, використовують тонкі методи біохімічного аналізу ДНК хлоропластів, білків тілакоїдних мембран та ін [11].

Мутація будь-якого гена може завершитися  повною або частковою втратою  його функціональної активності. Наслідком  цього може бути припинення синтезу  важливого для метаболізму білка, що обумовить летальний ефект. Якщо ж мутація вихідної структури гена тільки видозмінює білок, то це може прискорювати, або гальмувати, або змінювати метаболічні реакції, що неминуче позначиться у фенотовій ознаці.

Мутагенез - процес виникнення мутацій  під впливом різних фізичних і хімічних мутагенних факторів. Достатня фізіологічна гомогенність культури клітин і малий розмір клітинних агрегатів дозволяють мутагенам і селективним факторам ефективно впливати відразу на велику кількість клітин [6].

Серед хімічних супермутагенів in vitro використовують два класи речовин: клас НАК (нітрозоалкілсечовин) і ДАК (діазокетонів). Найбільш поширені супермутагени: етилметансульфонат (ЕМС); диметилсульфонах (ДМС); метилметансульфонат (ММС); етиленімін (ЕІ); N-нітрозометилсечовина (НМС), та ін. Розчини мутагенів готують, як правило, на середовищі для культивування і додають до суспензії клітин. Через певний час клітини промивають середовищем від мутагенів і ресуспензують у свіжому середовищі [21].

Причиною геномних мутацій  може бути і калусогенез. Відомо, що при заживанні фізичних травм у рослин утворюються калусні клітини, які в нормі не виявляються. Це означає, що у відповідь на травмування генотип реагує синтезом додаткових білків, ферментів або метаболітів, необхідних для репараційних процесів, Калусну тканину можна одержати відносно легко також in vitro. Якщо з калусної тканини виникають ембріоїди або пагони, то частина з них буває поліплоїдною, що свідчить про здійснення генних мутацій. На цьому принципі грунтується метод декапітації, який використовують для подвоєння хромосом [7].

Поряд з хімічними  мутагенами в експериментах з  культурами клітин широко використовують іонізуюче (рентгенівське, гамма-промені) і ультрафіолетове випромінювання. Найбільш широкий спектр мутацій  спостерігається при використанні іонізуючого випромінювання. При рентгенівському опроміненні клітин, вченими одержані пігмент-дефектні лінії дурману і петунії, хлоратстійкі лінії тютюну. Х- та γ-опромінення гаплоїдних протопластів сприяє виділенню ауксотрофних мутантів. Ауксотрофи - клітини, які втрачають здатність синтезувати одну речовину (з-поміж групи простих речовин), необхідну для їх росту [30]. Фенотип ауксотрофів у рослин позначають латинськими літерами, які символізують сполуку, необхідну для їх життєдіяльності. Наприклад, символами Ле^-, Меt, Тhi^- позначають ауксотрофи, які потребують ізолейцин, метіонін і тіамін, відповідно [1]. Для одержання мутантів в умовах in vitro пе обов'язково діяти на клітини мутагенами. Іноді відбувається спонтанний мутагенез, який пояснюють помилками в роботі ферментів матричного синтезу ДНК. У вищих рослин існує феномен наявності мобільних (мігруючих) генетичних елементів, які спричиняють спонтанні мутації ("стрибаючі гени"). Частота виникнення різних спонтанних мутацій може коливатись в межах 10^-5-10^-8. Природними чинниками спонтанного мутаційного процесу можуть бути також гени-мутатори, біохімічна активність яких збільшує частоту мутацій інших генів у декілька десятків разів (існують, крім того, гени-антимутатори, що діють у протилежному напрямку).

Поява окремих фенотипових  змін може бути вища, якщо відбувається мутація більш ніж одного гена. Одержанню спонтанних мутацій віддається перевага для сільськогосподарських  культур (коли небажані побічні мутації) [6].

Важливою перевагою  суспензійних культур клітин є можливість застосування в роботі стандартних мікробіологічних методів. Спонтанну та індуковану частоту виникнення мутацій визначають як відношення числа мутантних клонів до діяльності виживших клонів. Для оцінки ефективності мутагенезу часто використовують значення корисної частоти мутацій, яку випначають відношенням мутантних клонів до загальної кількості висіяних клітин [15].

При вивченні мутагенезу фенотиповими маркерами можуть бути такі показники: стійкість до токсичних  концентрацій амінокислот та їх аналогів; стійкість до антибіотиків, патотоксмнів, пуринових і піримідинових основ нуклеїнових кислот, а також хлорофілдефектність. Загальна методологія відбору мутантів in vitro складається з таких етапів;

1. Селекція необхідних  фенотипових варіантів на клітинному рівні.

2. Регенерація з клітин  рослин.

3. Експресія мутаційних  змін на рівні цілих рослин-регенерантів. При цьому необхідно довести  генетичну природу мінливості  та ретельно її визначити шляхом  гібридологічного аналізу.

Селекція мутантних клітин більш ефективна, якщо після обробки мутагеном проходить певний період. Селективний тиск (перенесення мутантів на селективні поживні середовища або в екстремальні температурні умови) застосовують на різних стадіях культивування клітин після мутагенезу - від 2-х годин до тижня. Вибір часу для проведення селекції залежить від кількості клітин у вихідних колоніях, типу мутацій, стадії клітинного циклу, числа поділів мутантних клітин до початку селекції.

Способи відбору необхідних фенотипових варіантів на клітинному рівні можна класифікувати так;

- пряма (позитивна)  селекція, при якій виживає лише  певний мутантний тип клітин;

- непряма (негативна)  селекція. Грунтується на вибірковій  загибелі клітин дикого типу  та виживанні метаболічно неактивних  клітин, які потребують додаткової ідентифікації у них мутаційних змін;

- візуальна селекція  та неселективний відбір, коли  ідентифікація лінії серед всієї  популяції клітин відбувається  візуально або за допомогою  біохімічних методів ( ізоферменти,  поліморфізм білків, вторинні метаболіти та ін.);

- тотальна селекція, яка  передбачає індивідуальне тестування  всіх клітинних клонів.

Пряма селекція - найбільш поширений метод виділення мутантів стійкості до посухи, до антибіотиків, гербіцидів, токсинів та інших антиметаболітів.

1.3. Мікроклональне  розмноження ярого ріпаку

Ярий ріпак відноситься  до економічно важливих сільськогосподарських  культур. Методи його селекції постійно потребують розробок та вдосконалення  нових ефективних способів розмноження  на різних стадіях онтогенезу з метою створення нових високопродуктивних форм рослин.

У селекційному процесі  ярого ріпаку з’являються значні ускладнення, що пов`язані з розмноженням та збереженням цінного, генетично ідентичного матеріалу [2].

Розробка методу мікроклонального розмноження ярого ріпаку являє собою великий інтерес для генетико-селекційних робіт з цією сільськогосподарською культурою. Роботи по культивуванню різноманітних ізольованих тканин та органів ярого ріпаку показали їх високу морфогенну активність [21].

В порівнянні з традиційними методами  що використовуються в сільськогосподарській практиці, мікроклональне розмноження в культурі in vitro має значні переваги.

• Підвищений коефіцієнт розмноження, з однієї бруньки за місяць можна отримати до 1000 рослин регенерантів;
• Депонування рослин-регенерантів при понижених позитивних температурах (+4^оС) дає змогу довгий час зберігати її, та при потребі включати в селекційний процес;
• Метод мікроклонального розмноження економічний – невелика лабораторна площа на якій можуть бути розташовані тисячі рослин, а також скорочення строків розмноження та незалежність від пори року;
• Метод культури тканин дозволяє вести відбір генотипів, стійких до несприятливих умов середовища, бактеріозів, вірусних захворювань, то що;

Весь процес мікроклонального розмноження складається з чотирьох етапів:

1. Введення меристем в стерильну культуру. Цей етап включає в себе стерилізацію посадкового матеріалу для отримання культури вільної від мікроінфекції, та експлантація на поживне середовище.
2. Саме мікроклональне розмноження. Індукція брунькоутворення та пасаж бруньок на нове поживне середовище для збільшення їх кількості.
3. Укорінення отриманих пагонів. Досягається пересадкою ізольованих пагонів на середовище, що викликає розвиток кореневої системи (ризогенез);
4. Перенесення стерильної культури в грунт. Етап проводиться поступово, потребує деякого часу для адаптації рослин регенерантів до нестерильних умов [9].

При створенні  нових форм рослин методами біотехнології  вагоме значення має ефективність регенерації з різних експлантів. Розробці таких систем регенерації та вивченню її залежності від різних факторів (генотип, вік та вид тканини експланту, склад культурального середовища та ін.) присвячено багато досліджень [27, 28, 36, 17]. У статтях, які описують регенерацію в ріпака, використовують різні типи експлантів, такі як сегменти листків, стебел та гіпокотилів, корінці, сім'ядолі, а також різні комбінації фітогормонів у поживних середовищах [27, 35, 17].

Проте конкретні  генотипи не завжди здатні до регенерації за протоколами, описаними для даної культури. У низці робіт показано, що використання меристемних тканин дає вищу частоту регенерації, ніж застосування в ролі експланту матеріалу з високодиференційованих тканин [22, 26, 32]. Морфогенез вичленених сім'ядольних листків на штучному середовищі значною мірою залежить від розміру ізолятів. Літературні дані свідчать, що чим більший вік проростка, тим менша його здатність до морфогенезу на поживному середовищі [18]. Існують також відомості про те, що довжина експланту сприяє морфогенезу останнього [8, 37].

Для отримання  маточних рослин ярого ріпака як експлант використовували сім'ядолі листків, ізольовані із 2-3-денних проростків із довжиною черешка 2 мм. Поживне середовище для пагоноутворення з ізольованих сім'ядолей містило речовину групи цитокінінів — БАП — у концентрації 0,5 мг/л, яка індукує розвиток пазушних бруньок в культурі та стимулює ріст органів, що перебувають у стані спокою. Рослини, вирощені із сім'ядолей ріпака, через 3-4 тижні після закладання досліду живцювали й використовували для подальших досліджень мікроживці довжиною 1-2 см з однією парою вкорочених листків, які мали пазушні меристемні тканини.

При вивченні регенерації озимого ріпака як експлант можна використовувати гіпокотилі та сім'ядолі, які виділяють з проростків, вирощених на безгормональному поживному середовищі. Використання молодих тканин дає більш високу частоту регенерації завдяки тому, що вони містять різні гормональні сполуки, які сприяють морфогенезу. Регенерація пагонів у ярого ріпака може відбуватись двома шляхами:

1. Експлант при посадці в поживне середовище з 2-3 мг/л БАП та 0,1-0,9 мг/л НОК збільшувався за розмірами, а на 5-7 добу починала утворюватись недиференційована щільна калюсна тканина з великою кількістю меристематичних зон; надалі в калюсній тканині формувалась брунька, з якої розвивався пагін, а потім біля його основи утворювались придаткові корені. Це виглядало наступним чином: у морфогенному калюсі виникали листковидні та стеблевидні структури, частина яких розвивалась у нормальні пагони, а інша припиняла рости. Іноді з кал юсу одразу виникав добре сформований пагін із швидким темпом росту.
2. При поміщенні експлантів у середовище, яке містило 3-4 мг/л БАП, спостерігали утворення соматичних ембріоідів без стадії калюсоутворення на сім'ядолях та гіпокотилях, а також пагонів шляхом прямого органогенезу. Ембріоїди розвивались у пагони без утворення кореневої системи. Пагони розміром 20-30 мм, які утворилися при регенерації, поміщали в середовище, доповнене БАП із концентрацією 2-3 мг/л, що призводило до активного утворення додаткових пагонів. Відділяючи окремі пагони або групи по 2-3 штуки і пересаджуючи їх на середовище того самого складу, можна за короткий термін одержати велику кількість нових пагонів (30-40 за 9-11 тижнів). Пагони, які знову утворились, є вегетативним потомством одного експланту і зберігають генетичну ідентичність.