ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ 
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. Н. П. ОГАРЁВА»

Факультет биологический

Кафедра ботаники и физиологии растений 

КУРСОВАЯ  РАБОТА

Культура  тканей в цветоводстве 
 

Автор курсовой работы                                Е.В. Фатеева

Специальность       биология

Обозначение курсовой работы 

Руководитель  работы                           

канд. биол. наук, доц.            Е. В. Мокшин

          Оценка  

Саранск

2011

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ 
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. Н. П. ОГАРЁВА»

Факультет биологический

Кафедра ботаники и физиологии растений

ЗАДАНИЕ НА КУРСОВУЮ РАБОТУ

Студент  Е.В. Фатеева

1 Тема  Культура тканей в цветоводстве

2 Срок  представления работы к защите: май 2011 года

3 Исходные  данные для научного исследования:  литературные источники

4 Содержание  курсовой работы

     4.1 Аналитический обзор

     4.1.1 Клональное микроразмножение растений 

     4.1.2 История метода

     4.1.3 Этапы и методы микроклонального  размножения растений

     4.1.4 Оздоровление растений в культуре  in vitro

     4.2 Особенности клонального микроразмножения  декоративных растений

4.2.1 Влияние  эндогенных факторов

4.2.2 Влияние  экзогенных факторов

Руководитель  работы  ___________________________   Е. В. Мокшин

Задание принял к исполнению _____________________

Реферат

     Курсовая  работа содержит 33 страниц, 45 использованных источников.

КЛОНАЛЬНОЕ  МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ,  МОРФОГЕНЕЗ,  ЭКСПЛАНТ, IN VITRO , КАЛЛУС, ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА, ОРГАНОГЕНЕЗ.

     Цель  работы – ознакомление с условиями культивирования in vitro декоративных растений по литературным данным.

     Методы  исследования – анализ литературных данных

     В результате исследования  было изучено  влияние  эндогенных и экзогенных факторов на морфогенез декоративных растений.

     Степень внедрения – частичная.

     Область применения – в  работе кафедры  ботаники  и  физиологии  растений  
 
 
 
 
 
 
 

… 
 
 

Содержание 

Введение                                                                                                               6                                                   

1 Аналитический  обзор                                                                                        8  

1.1 Клональное микроразмножение растений              8

1.2 Этапы  и методы микроклонального размножения  растений        10

1.3 Оздоровление  растений к культуре in vitro           17

2 Особенности  клонального микроразмножения декоративных  растений    21

2.1 Влияние  экзогенных факторов             23

2.2 Влияние  эндогенных факторов             24

Заключение                 28

Список использованных источников            29

Обозначения и сокращения 

2,4-Д – дихлорфеноксиуксусная  кислота 

6-БАП – 6-бензиламинопурин 

ИМК– индолилмасляная  кислота

ИУК – индолил-3-уксусная кислота 

КМР – клональное микроразмножение

МС – Мурасиге-Скуга

НУК – нафтилуксусная кислота  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Введение 

     Ассортимент декоративных растений с каждым годом  расширяется за счет интродукции  красивых дикорастущих видов и создания новых сортов. Это наиболее обширная группа культивируемых растений. Из них  травянистые декоративные многолетники открытого грунта представлены в  культуре примерно 6000 видов и десятками  тысяч сортов.

     В промышленном цветоводстве под стеклом  и пленкой выращивают многочисленные виды — представителей различных  семейств, происходящих из разных районов  земного шара, но преимущественно  из теплых субтропических и тропических  районов Америки, Африки и островов Тихого океана [1].

     Достижения  в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения растений – клонального микроразмножения. В настоящее время неоспоримо его преимущество перед традиционными методами вегетативного и генеративного размножения растений. При использовании метода клонального микроразмножения появляется возможность увеличить коэффициент размножения до сотен тысяч и даже миллионов растений-регенерантов в год с одного маточного растения. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки под влиянием экзогенных  воздействий регуляторов роста дать начало целому растительному организму. Культура тканей стала мощным инструментом расширения возможности процессов регенерации для различных видов растений [2, 3]. Так, коэффициент размножения луковиц некоторых сортов гиацинтов (Marconie, Anna Marie, Grand Maitre) в условиях in vitro в 40 раз больше, чем при размножении этих растений обычным способом, применяемым в цветоводстве [4]. Высокоэффективно использование метода культуры тканей и для другого растения - Saintpaulia ionanta, так как на одном листовом диске размером 1 см регенерировало 37 - 44 почек [5]. Используя листовые экспланты Peperomia scandes [6], chrisantemum [7] регенерируют и успешно размножают in vitro эти и другие виды растений.

      Приведенные выше примеры использования методов  клонального микроразмножения для  ряда растений убедительно показывают не только преимущество их перед традиционными  методами размножения, но и их особенность, которая заключается в том, что  до сих пор эти методы базируются на эмпирических подходах и поэтому  требуют спецификации основной методики. Эта особенность учитывается  как при работе с определенными  видами и сортами растений, так  и при использовании определенных типов эксплантов, изолированных  от исследуемых видов и сортов[8].

      Цель  данной работы – на основе литературных данных изучить особенности использования  культуры ткани в цветоводстве.

      Основные  задачи исследования:

      1) описать значение фундаментальных  исследований в области культуры  тканей;

      2) изучить этапы и методы микроклонального  размножения растений;

      3) выяснить роль экзогенных и  эндогенных факторов в процессе  клонального микроразмножения орхидных.  

  1.Аналитический обзор 

1. Клональное  микроразмножение растений

     Помимо традиционных черенкования, прививок, выращивания из семян, размножения корневищами, луковицами и т.д. в большинстве стран рассаду многих растений сегодня получают путем микроклонального размножения. Особенно широко этот способ применяется для выращивания растений, которые плохо поддаются размножению другими способами. Также этот метод незаменим, если необходимо постоянно получать в достаточно короткие сроки значительное количество качественной рассады[9]. В последнее время в нашей стране большое внимание озеленительных организаций  уделяется ландшафтному дизайну и в частности проблеме озеленения городов. На сегодняшний день данное направление получило широкое развитие и распространение. Особой популярностью в промышленном озеленении пользуются цветочно-декоративные растения[10]. 

           С помощью микроклонального размножения (другое название метода –  меристемное размножение) выращивают декоративные и плодово-ягодные  растения, комнатные и срезочные  цветы, картофель и прочие овощи.  

           Микроклональное размножение растений широко применяется в США, Голландии, Польше, Франции, Японии, Таиланде. В России также накоплен большой опыт по меристемному размножению важных для сельского хозяйства видов растений. Практически во всех российских научно-исследовательских институтах и селекционных центрах созданы лаборатории для микроклонального размножения и оздоровления селекционного материала. Относительно недавно меристемные технологии начали применяться крупными питомниками растений и сельхозпредприятиями. В России наиболее широкое применение меристемная технология пока нашла в получении здоровых семян картофеля.  

           Меристема (от греч. meristos - делимый) - это ткань растений, в течение всей жизни сохраняющая способность к образованию новых клеток. Именно за счет меристемы растения растут, образуют новые листья, стебли, корни, цветки.  

           В процессе роста меристемная  ткань в определенной степени  сохраняется в некоторых частях растения: в узлах побега, в почках, в кончиках корней, в основаниях черешков листьев или цветоносах и т.д.  

           Меристемным методом  растения размножают в 4 этапа:  

           1.  Введение: меристемные ткани отделяют от нужного экземпляра растения и помещают на специальные питательные среды в пробирки. Затем меристемные растения выдерживают в специальном шкафу в течение 20-40 дней при освещении до 14 ч. в сутки.  

           2. Размножение: через 1-1,5 месяца микрочеренки уже имеют размер горошины, у них образовались зачатки всех вегетативных органов растений. Подрощенные микрочеренки делят на пять-семь частей, а «кусочки» (вновь полученные меристемные черенки) снова проращивают в пробирках в течение 20-30 дней. 

           3. Укоренение и адаптация: когда меристемные микрочеренки образуют достаточную корневую систему, их извлекают из пробирок и пересаживают в горшочки, заполненные легким торфом. Затем горшочки устанавливают в защищенную среду - достаточно использовать небольшую пластиковую трубку. Через 4-6 недель микрочеренки привыкают к естественным условиям выращивания.  

           4. Подращивание: после укоренения и адаптации новые растения выращиваются при агротехнике, свойственной данной культуре, и могут быть высажены в теплицу, а затем и в открытый грунт.  

           На ранних стадиях  вегетативного развития меристемные  растения могут иметь некоторые  различия во внешнем виде, но по мере роста они исчезают. Полученные микроклональным  способом растения наследуют все  признаки, присущие данному сорту  и вполне могут в дальнейшем размножаться обычным вегетативным или семенным способом[9].

     В случаях применения изолированных  клеток и протопластов удается получать измененные варианты исходной формы, которые  передают полученные новые признаки потомству.

     Этим  добиваются возможностей искусственного создания новых форм растений, пригодных  для выборки, или селекции. В течение  последних лет биотехнологам  удалось массовое размножение культивируемых растений с

уникальными характеристиками, а выращивание  растительных клеток стало основой  для получения многих природных  веществ, образуемых различными растениями в качестве продуктов вторичного обмена (гликозиды,

алкалоиды и другие вещества).

     Таким образом, главными направлениями стали  создание новых форм полезных растений для сельского и лесного хозяйства,

разработка  промышленного производства химических веществ из растений, а также селекционирование декоративных растений[11]. 
 
 

            1.2 Этапы и методы микроклонального размножения растений

     Процесс клонального микроразмножения можно  разделить на четыре этапа:

• выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры;
• собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества мериклонов;
• укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+ 2°, + 10 °C);
• выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

     Существует  много методов клонального микроразмножения. Различные авторы проводя индивидуальные исследования по влиянию условий  культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания что в свою очередь привело к созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения. Исходя из предложенных в литературе методов микроразмножения растений, этот процесс возможно осуществлять следующими путями:

• Активация развития уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки и интеркамерные зоны стебля);
• Индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта;
• Индукция соматического эмбриогенеза;
• Дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях.

     Основной  метод, используемый при клональном микроразмножении растений — это активация развития уже существующих в растении меристем основывающийся на снятии апикального доминирования

     Второй  метод — это индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и, таким образом, регенерировать целые растения. Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их удается получить свободными от инфекции. Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1 в качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют бета-индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или альфа нафтилуксусную кислоту (НУК). Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинт, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Brassica (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи — из сегментов гипокотиля, семядолей, листьев; лук, чеснок — из верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томаты — из апикальных или пазушных меристем; салат цикорный — из сегментов листовых пластинок; петуния — из сегментов корней; глоксиния, фиалки — из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений — из изолированных зрелых и незрелых зародышей.

     Достаточно  хорошо разработана технология клонального  микроразмножения земляники, основанная на культивировании апикальных меристем. Меристематические верхушки изолируют из молодых, свободных от вирусных болезней, растений и выращивают на модифицированной питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей БАП в концентрации 0,1—0,5 мг/л. Через 3—4 недели культивирования меристема развивается в самостоятельное растение, в основании которого формируются адвентивные почки, которые быстро растут и дают начало новым почкам. В течение 6—8 недель образуется конгломерат почек, связанных между собой соединительной тканью и находящихся на разной стадии развития. Появляются листья на коротких черешках, в нижней части которых формируются новые адвентивные почки. Эти почки разделяют, и пересаживают на свежую питательную среду. На среде с цитокинином продолжается пролиферация придаточных побегов, а на среде без регуляторов роста в течение 4—6 недель формируются нормальные растения с корнями и листьями. Морфогенетическая активность экспланта сохраняется в течение 3—4 лет. Таким образом, от одного материнского растения можно получать несколько миллионов растений-регенерантов в год.

     Несомненный интерес у исследователей вызывает вопрос, связанный с происхождением адвентивных почек, и, в частности, какие клеточные слои участвуют  в дифференциации меристем. Единого  мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран Тан Ван в своих работах  с тканями табака показала, что  именно эпидермис является наиболее активной тканью, способной образовывать почки, каллус или корни в зависимости от гормонального баланса питательной среды. Цитологические исследования, проведенные на сегментах базальной части донца луковиц тюльпанов и нарциссов показали, что адвентивные побеги формируются из поверхностных слоев меристематических клеток, прилегающих к донцу, а для растений глоксинии процесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в субэпидермальных клеточных слоях листовых пластинок. Единого мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей, работающих с древесными растениями. Так, было показано, что образование почек на изолированной хвое ели обыкновенной происходит в эпидермальном слое культивируемого экспланта, для псевдотсуги — в субэпидермальных слоях, а при культивировании семядолей сосны замечательной на среде, содержащей один цитокинин (БАП), этот процесс происходит одновременно как в эпидермальном, так и в субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было отмечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпидермальном слоях семядолей зародыша и этот процесс для сосны не зависит от применяемых цитокининов.

     Третий  метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название — соматический эмбриогенез. Основное отличие образования зародышей in vitro от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биополярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят три стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию к развитию в проросток. Это явление впервые было отмечено в культуре клеток моркови ещё в середине 50-х годов XX в., а в настоящее время используется для размножения большинства растений из семейства Orchidaceae и Rutaceae, некоторых представителей злаковых (пшеница, ячмень), люцерны, редиса, винограда, а также некоторых видов древесных пород (осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная)[9].

     В настоящее время известно, что  соматические зародыши образуют-

ся у  растений, относящихся к разным таксонам и произрастающих в раз-

ных экологических  зонах. Данные литературных источников подтверж-

дают, что  за последние десятилетия для  ряда древесных растений, таких

как Acacia koa Gray [12], Aesculus hippocastanum L. [13,14], Albizia

richardiana King. [15], Castanea sativa Mill. [16], Citrus sp. [17], Cocos nucifera L. [18], Eucalyptus sp. [19], Feijoa sellowiana Berg. [20,21], Juglans cinerea L. [22], Juglans regia L. [23], Liriodendron tulipifera L. [24], разработаны способы их регенерации in vitro через соматический эмбриогенез.

     Формирование  эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа. На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за счет добавления в питательную среду  ауксинов, как правило, 2,4-дихлорфеноксиуксусной  кислоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриональные. На следующей стадии необходимо заставить  сформировавшиеся клетки развиваться  в эмбриоиды, что достигается  уменьшением концентрации ауксина  или полного его исключения из состава питательной среды. Соматический эмбриогенез возможно наблюдать  непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной  культуре. Причем последний способ менее пригодный при клональном микроразмножении, так как посадочный материал, полученный таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Как  правило, соматический эмбриогенез  происходит при культивировании  каллусных клеток в жидкой питательной  среде (суспензия) и является наиболее трудоемкой операцией, так как не всегда удается реализовывать свойственную клеткам тотипотентность. Однако этот метод размножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением  последнего (третьего) этапа клонального  микроразмножения, не требующего подбора  специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений, так как соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей  техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные  семена[9].

     Четвёртый метод клонального микроразмножения — дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани. Он мало используется для получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на свежую питательную среду часто наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками. Наряду с генетическими изменениями растений наблюдаются и морфологические: низкорослость, неправильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, образование укороченных, утолщенных междоузлий, уродливость, пониженная устойчивость к болезням и вредителям. Причем длительное культивирование каллусных клеток усугубляет эти изменения, поэтому период неорганизованного роста при микроразмножении должен быть сведен к минимуму.

     Однако, несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет положительные  стороны и преимущества. Во-первых, он является эффективным и экономически выгодным, так как в процессе размножения  из каждой индивидуальной каллусной  клетки при благоприятных условиях культивирования может сформироваться адвентивная почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев  он является единственно возможным  способом размножения растений в  культуре тканей. В-третьих, представляет большой интерес для селекционеров, так как растения, полученные данным методом, различаются генетически  и морфофизиологически. Это дает возможность селекционерам проводить  отбор растений по хозяйственно-важным признакам и оценивать их поведение  в полевых условиях. Этот метод  целесообразно применять лишь к  тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной  ткани, а вариабельность между растениями-регенерантами  не превышает уровня естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести  амариллис, томаты, спаржу, некоторые  древесные породы и другие культуры. Через каллусную культуру были размножены: сахарная свекла, некоторые представители  рода Brassica, кукуруза, рис, пшеница и  другие злаковые, подсолнечник, лен, разработаны  условия, способствующие регенерации растений из каллуса огурца, картофеля, томатов[9].

     Преимущества  растений полученных методом микроклонального размножения:

       · значительно более высокие коэффициенты размножения (можно получить до 100 000-1 000 000 мериклонов в год, тогда как при обычном размножении – 5-100 растений за тот же срок;