Влияние металлов на рост и развитие растений

Введение

Загрязнение среды тяжелыми металлами происходит в результате сжигания топлива, деятельности горнодобывающей промышленности, сбрасывания сточных вод и внесения в почву удобрений. Однако в последующие годы, в связи с бурным развитием промышленности и глобальным техногенным загрязнением окружающей среды, наибольшее внимание стали привлекать аномалии элементов, в большей степени тяжелые металлы, имеющих индустриальное происхождение. Уже сейчас во многих регионах мира окружающая среда становится все более химически «агрессивной» [Геохимия, 1986; Лепнева, 1987; Ильин и др., 1988, 1997; Kabala, Singh, 2001; Kathryn andetc..., 2002] .

В последние десятилетия основными объектами биогеохимических исследований стали территории промышленных городов и прилегающих к ним земель [Геохимия., 1986; Лепнева, 1987; Ильин и др., 1988, 1997; Kabala, Singh, 2001; Kathryn and etc., 2002], особенно если на них выращиваются, а затем используются в пищу сельскохозяйственные растения [Рэуце, Кырстя, 1986; Ильин, 1985, 1987; Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989; Черных, 1996 и др.,].

Появление в литературе термина «тяжелые металлы» было связано, главным образом, с проявлением токсичности и опасности некоторых из них для живых организмов. Однако в группу «тяжелых» вошли и микроэлементы, жизненная необходимость и широкий спектр биологического действия которых неопровержимо доказаны [Чернавина,1970; Алексеев,1987; Краснокутская и др., 1990; Сает и др., 1990; Ильин,1991; Кадмий: экологические...,1994; Тяжелые...,1994; Снакин, 2000]. С давних пор в небольших количествах микроэлементы используются в сельском хозяйстве, так как необходимы для роста и развития растений [Школьник, 1950, 1974, Кокин, 1951; Тойкка и др., 1973; Курдюмов, 1999].

Так тяжелые  металлы оказывают влияние на рост и развитие растений, на ферменты. Активность фермента очень сильно зависит от pH среды, присутствия электролитов и других веществ, активирующих или наоборот ингибирующих их действие. Различные загрязнения окружающей среды вызывают изменения ферментативной деятельности [Николаевский,1979].

Основные функции в  регуляторной деятельности клетки выполняют  пероксидаза и каталаза, обеспечивающие нормальный ход окислительных процессов  при различных  неблагоприятных  воздействиях. Эти ферменты наряду с цитохромоксидазой способны осуществлять функции активаторов кислорода на заключительном этапе дыхания [Петрова, Милеустина, 1976; Николаевский, 1979, 1998].

Цель: исследование влияние эндофитных штаммов Bacillus subtilis на активность ферментов-антиоксидантов пшеницы в условиях воздействия тяжелых металлов.

Задачи:

1. Изучить литературу по влиянию тяжелых металлов на активность ферментов-антиоксидантов культурных растений.
2. Провести анализ экспериментальных данных, полученных разными авторами по влиянию B. subtilis на активность ферментов растений при воздействии тяжелых металлов.

Глава I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Влияние металлов на рост и развитие растений

1.1. Характеристика тяжелых металлов и их опасность для растений, человека

Тяжелые металлы – это группа химических элементов с относительной атомной массой более 40. Появление в литературе термина «тяжелые металлы» было связано с проявлением токсичности некоторых металлов и опасности их для живых организмов. Однако в группу «тяжелых» вошли и некоторые микроэлементы, жизненная необходимость и широкий спектр биологического действия которых неопровержимо доказаны [Алексеев, 1987; Минеев, 1988; Краснокутская и др., 1990; Сает и др., 1990; Ильин, 1991; Кадмий: экологические…, 1994; Тяжелые…, 1997; Пронина, 2000].

Заметное загрязнение атмосферного воздуха и почвы происходит за счет транспорта. Большинство ТМ, содержащихся в пылегазовых выбросах промышленных предприятий, как правило, более растворимы, чем природные соединения [Большаков и др., 1993]. Среди наиболее активных источников поступления ТМ выделяются крупные индустриально развитые города. Металлы сравнительно быстро накапливаются в почвах городов и крайне медленно из них выводятся: период полу удаления цинка - до 500 лет, кадмия - до 1100 лет, меди - до 1500 лет, свинца - до нескольких тысяч лет [Майстренко 1996]. Во многих городах мира высокие темпы загрязнения ТМ привели к нарушению основных агроэкологических функций почв [Орлов и 1991; Касимов 1995].

Выращивание сельскохозяйственных растений, используемых в пищу вблизи этих территорий потенциально опасно, поскольку культурами накапливаются избыточные количества ТМ, способные приводить к различным заболеваниям человека и животных. Кадмий способен накапливаться в организме человека и животных, т.к. сравнительно легко усваивается из пищи и воды и проникает в различные органы и ткани. Токсичное действие металла проявляется уже при очень низких концентрациях. Его избыток ингибирует синтез ДНК, белков и нуклеиновых кислот, влияет на активность ферментов, нарушает усвоение и обмен других микроэлементов (Zn, Cu, Se, Fe), что может вызывать их дефицит [Авцын и др., 1991].

Обмен кадмия в  организме характеризуется следующими основными особенностями [Авцын и др., 1991]: отсутствием эффективного механизма гомеостатического контроля; длительным удержанием (кумуляцией) в организме с очень долгим периодом полувыведения (в среднем 25 лет); преимущественным накоплением в печени и почках; интенсивным взаимодействием с другими двухвалентными металлами как в процессе всасывания, так и на тканевом уровне [Авцын 1991].

Хроническое воздействие  кадмия на человека приводит к нарушениям почечной функции, легочной недостаточности, остеомаляции, анемии и потере обоняния. Существуют данные о возможном канцерогенном эффекте кадмия и о вероятном участии его в развитии сердечно-сосудистых заболеваний. Наиболее тяжелой формой хронического отравления кадмием является болезнь итай-итай, характеризующаяся деформацией скелета с заметным уменьшением роста, поясничными болями, болезненными явлениями в мышцах ног, утиной походкой. Кроме того, отмечаются частые переломы размягченных костей даже при кашле, а также нарушение функции поджелудочной железы, изменения в желудочно-кишечном тракте, гипохромная анемия, дисфункция почек и др., [Авцын и др., 1991].

Растительная пища является основным источником поступления ТМ в организм человека и животных. С ней поступает от 40 до 80 % ТМ, и только 20-40 % - с воздухом и водой. [Панин, 2000; Ильин, Сысо, 2001]

 Поэтому от уровня  накопления металлов в растениях,  используемых в пищу, в значительной степени зависит здоровье населения. [ Зырин Н.Г. Задачи и перспективы развития учения о микроэлементах в почвоведении. /Биологическая роль микроэлементов в почвах. – М.: Наука, 1983. С. 149-154.], степень загрязнения почв ТМ правильнее оценивать по содержанию их наиболее биодоступных мобильных форм. Однако предельно допустимые концентрации подвижных форм большинства ТМ в настоящее время не разработаны. Поэтому критерием для сравнения могут служить литературные данные по уровню их содержания, приводящего к неблагоприятным экологическим последствиям. Наиболее существенное загрязнение среды вызывают мощные тепловые станции [Майстренко и др., 1996].

Ежегодно только при  сжигании угля в атмосферу выбрасывается ртути в 8700 раз больше, чем может быть включено в естественный биогеохимический цикл, урана в 60, кадмия в 40, иттрия и циркония в 10, олова в 3-4 раза. 90 % кадмия, ртути, олова, титана и цинка, загрязняющих атмосферу, попадает в нее при сжигании каменного угля. Свойства металлов, касающихся особенностей их поведения в почвах.

Подвижность кадмия в почве зависит  от среды и окислительно-восстановительного потенциала [Тяжелые …, 1997]. Среднее содержание кадмия в почвах мира равно 0,5 мг/кг [Сает и др., 1990]. Концентрация его в почвенном покрове европейской части России составляет 0,14 мг/кг в дерново-подзолистой почве, 0,24 мг/кг в черноземе [Цинк и кадмий…, 1992], 0,07 мг/кг в основных типах почв Западной Сибири [Ильин, 1991]. Ориентировочно-допустимое содержание (ОДК) кадмия для песчаных и супесчаных почв в России составляет 0,5 мг/кг, в Германии ПДК кадмия 3 мг/кг [Kloke, 1980].

Загрязнение почвенного покрова кадмием  считается одним из наиболее опасных  экологических явлений, так как  он накапливается в растениях  выше нормы даже при слабом загрязнении почвы [Кадмий …, 1994; Овчаренко, 1998]. Наибольшие концентрации кадмия в верхнем слое почв отмечаются в горнорудных районах – до 469 мг/кг [Кабата-Пендиас, Пендиас, 1989], вокруг цинкоплавилен они достигают 1700 мг/кг [Рэуце, Кырстя, 1986].

1.2. Общая характеристика кадмия и его влияние на растения

Кадмий –  элемент 2-ой группы периодической системы. Атомный номер 48. Серебристо-белый металл, плотность 8,65 г\см³. В соединениях кадмий проявляет степень окисления +2. При высокой температуре сгорает, образуя коричневую окись кадмия. Устойчивый по отношению к воде. Соединения кадмия играют важную роль в процессе жизнедеятельности животных и человека. В повышенных концентрациях кадмий токсичен, особенно в сочетании с другими токсичными веществами. ПДК составляет 0.001 мг/дм3, ПДК вредности - 0.0005 мг/дм3 (лимитирующий признак вредности - токсикологический).

Содержание  кадмия в земной коре составляет 1×10^-3 % [Стругацкий, 1965; Чернобельская, 1991]. Существует тенденция к увеличению естественного фона кадмия во всех компонентах окружающей среды [Ровинский, 1982].

Токсичность кадмия для растений проявляется в нарушении  активности ферментов, нарушении транспирации, а также ингибировании восстановления NО₂ до NО. Кроме того, в метаболизме растений он является антагонистом ряда элементов питания (Zn, Cu, Mn, Ni, Se, Ca, Mg, P). При токсичном воздействии металла у растений наблюдаются задержка роста, повреждение корневой системы и хлороз листьев. Кадмий достаточно легко поступает из почвы и атмосферы в растения. По фитотоксичности и способности накапливаться в растениях в ряду ТМ он занимает первое место (Cd > Cu > Zn> Pb) [Овчаренко и др., 1998].

Химический состав растений, как известно, отражает элементный состав почв. Поэтому избыточное накопление ТМ растениями обусловлено, прежде всего, их высокими концентрациями в почвах. В своей жизнедеятельности растения контактируют только с доступными формами ТМ, количество которых, в свою очередь, тесно связано с буферностью почв. Однако, способность почв связывать и инактивировать ТМ имеет свои пределы, и когда они уже не справляются с поступающим потоком металлов, важное значение приобретает наличие у самих растений физиолого-биохимических механизмов, препятствующих их поступлению.

Механизмы устойчивости растений к избытку ТМ могут проявляться по разным направлениям: одни виды способны накапливать высокие концентрации ТМ, но проявлять к ним толерантность; другие стремятся снизить их поступление путем максимального использования своих барьерных функций. Для большинства растений первым барьерным уровнем являются корни, где задерживается наибольшее количество ТМ, следующий – стебли и листья, и, наконец, последний – органы и части растений, отвечающие за воспроизводительные функции (чаще всего семена и плоды, а также корне- и клубнеплоды и др.) [Гармаш Г.А. 1982; Ильин, Степанова, 1982; Гармаш Н.Ю., 1986; Алексеев, 1987; Тяжелые…, 1987; Горюнова, 1995; Орлов и др, 1991 и др.; Ильин, Сысо, 2001].

1.3. Проникновение металлов и влияние на растения

Растительная пища является основным источником поступления ТМ в

организм человека и животных. По разным данным [Панин, 2000; Ильин, Сысо, 2001], с ней поступает от 40 до 80 % ТМ, и только 20-40 % - с воздухом и водой. Поэтому от уровня накопления металлов в растениях, используемых в пищу, в значительной степени зависит здоровье населения.

Химический состав растений, как известно, отражает элементный состав почв. Поэтому избыточное накопление ТМ растениями обусловлено, прежде всего, их высокими концентрациями в почвах. В своей жизнедеятельности растения контактируют только с доступными формами ТМ, количество которых, в свою очередь, тесно связано с буферностью почв. Однако, способность почв связывать и инактивировать ТМ имеет свои пределы, и когда они уже не справляются с поступающим потоком металлов,  важное значение приобретает наличие у самих растений физиолого-биохимических механизмов, препятствующих их поступлению [Панин, 2000; Ильин, Сысо, 2001].

Механизмы устойчивости растений к избытку ТМ могут проявляться  по разным направлениям: одни виды способны накапливать высокие концентрации ТМ, но проявлять к ним толерантность; другие стремятся снизить их поступление путем максимального использования своих барьерных функций. Для большинства растений первым барьерным уровнем являются корни, где задерживается наибольшее количество ТМ, следующий стебли и листья, и, наконец, последний органы и части растений, отвечающие за воспроизводительные функции (чаще всего семена и плоды, а также корне- и клубнеплоды и др.,) [Гармаш Г.А. 1982; Ильин, Степанова, 1982; Гармаш Н.Ю., 1986; Алексеев, 1987; Тяжелые…, 1987; Горюнова, 1995; Орлов и др, 1991 и др.; Ильин, Сысо, 2001].

Несмотря на существенную изменчивость различных растений к накоплению ТМ, биоаккумуляция элементов имеет  определенную тенденцию, позволяющую упорядочить их в несколько групп: 1) Cd, Cs, Rb элементы интенсивного поглощения; 2) Zn, Mo, Cu, Pb, As, Co средней степени поглощения; 3) Mn, Ni, Cr слабого поглощения и 4) Se, Fe, Ba, Te элементы, труднодоступные растениям [Тяжелые …, 1987; Кадмий …, 1994; Пронина, 2000].

Другой путь поступления ТМ в растения - некорневое поглощение из воздушных потоков. Оно имеет место при значительном выпадении металлов из атмосферы на листовой аппарат, чаще всего вблизи крупных промышленных предприятий. Поступление элементов в растения через листья (или фолиарное поглощение) происходит, главным образом, путем неметаболического проникновения через кутикулу. ТМ, поглощенные листьями, могут переносится в другие органы и ткани и включаться в обмен веществ.

1.4. Изменение активности ферментных систем при воздействии тяжелых металлов

Окислительно-восстановительные  процессы играют большую роль в устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды. При изменении  условий существования растений изменяются активность и направленность действия ферментов, содержание аскорбиновой кислоты и некоторых других элементов окислительно-восстановительной системы [Мерзляк, 1989, 1999].

Значительная  роль в стрессовых ответных реакциях на воздействия неблагоприятных  факторов среды принадлежит свободно радикальным реакциям, связанные с участием кислородных радикалов [Чиркова, 1997].

Образование активных форм кислорода (АФК), в частности супероксида  и пероксида водорода, на клеточной  поверхности («окислительный взрыв») является одним из ранних клеточных ответов на стрессовое воздействие. Эти радикалы и продукты их превращения представляют серьезную угрозу, так как могут подавлять активность ферментов, разрушать нуклеиновые кислоты, вызывать деградацию биополимеров, изменять проницаемость мембран. Клетки защищаются от АФК с помощью антиоксидантов [Мерзляк, 1989, 1999].

К антиоксидантным  ферментам относятся супероксидисмутаза, каталаза и пероксидаза. Их синтез индуцируется в ответ на повышение уровня свободных  радикалов. [Кузнецов, Дмитриева, 2005].

В развитии окислительного стресса играют роль активные формы  кислорода: О₂, О₂, Н₂О₂, НО∙, НОСl и др., [Зенков, Меньшиков, 1993]. Накопление АФК в клетках приводит к нарушению протекания процессов транскрипции и репликации, изменяет состав липидов мембран. Супероксидные радикалы модифицируют белки [Дубинина, Шугалей, 1993], нарушают структуру ДНК, разрушают гормоны и другие, функционально активные вещества [Владимиров, Арчаков, 1972].

При прорастании семян  в них генерируются активные формы кислорода, защита от которых осуществляется за счет использования высокоактивной антиоксидантной системы, состоящей из низко- и высокомолекулярных соединений [Inze, Van Montagu, 1995]. К группе низкомолекулярных антиоксидантов относятся дигоксин, аскорбиновая кислота, гидрохинон, мочевая кислота, мелатонин, глутатион и др. В комплекс высокомолекулярной системы  антиоксидантной   защиты  входят  ферменты: каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза и др.,[Андреева, 1988; Калашникова и др.,1999]. Действие компонентов системы  антиоксидантной защиты в основном сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов в тканях [Бурлакова и др., 1975; Кения и др., 1993].

Являясь компонентами единой антиоксидантной системы  растений, низко- и высокомолекулярные антиоксиданты способны оказывать  взаимное влияние. Однако механизм этого  взаимодействия недостаточно изучен.

Ферментами называются коллоидные органические соединения, которые образуются в животных и растительных организмах и являются катализаторами протекающих в них биохимических процессов. По своей химической природе ферменты принадлежат к белковым веществам. Физические и химические свойства ферментов обусловлены их белковой природой: они термолабильны, способны высаливаться, и дают характерные для белка качественные реакции. Активность фермента очень сильно зависит от pH среды, присутствия электролитов и других веществ, активирующих или наоборот ингибирующих их действие. Различные загрязнения окружающей среды вызывают изменения ферментативной деятельности. [Николаевский, 1979].

Основные функции в  регуляторной деятельности клетки выполняют  пероксидаза и каталаза, обеспечивающие нормальный ход окислительных процессов при различных  неблагоприятных воздействиях. Эти ферменты наряду с цитохромоксидазой способны осуществлять функции активаторов кислорода на заключительном этапе дыхания [Петрова, Милеустина, 1976; Николаевский, 1979, 1998].

Как и в случае пероксидазы, имеются основания рассматривать каталазу в качестве одной из терминальных оксидаз растительной клетки, ответственной за разложение перекисей, регулирующих смену фаз аэробных и анаэробных процессов и участвующих в окислении перекисей в перокси-сомах при фотодыхании [Артамонов, 1986; Кузнецов, Дмитриева, 2005].

По данным В.С. Николаевского (1979), одно из проявлений защитных реакций  тканей в условиях промышленного загрязнения атмосферы - усиление аэробного дыхания и возрастание активности терминальных оксидаз. Изменение качества и активности окислительно-восстановительных ферментов может служить определенным показателем реакции растительного организма к неблагоприятным факторам среды и для оценки приспособления растений к условиям существования.

Пероксидаза входит в состав  антиоксидантной  системы  растений, активность которой определяет их уровень устойчивости к различным воздействующим факторам в процессе онтогенеза. Обладая широкой субстратной специфичностью,  фермент  может проявлять свойства оксидазы [Березин и др., 1975].

Пероксидаза – это один из главных ферментов, контролирующих рост растений, их дифференциацию и развитие. Он участвует в формировании, реологии и лигнификации клеточных стенок, биосинтезе этилена из 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты и пероксида водорода, регуляции уровня ауксина, защите тканей от поражения и инфекции патогенными микроорганизмами, а также катализирует окисление индолил-3-уксусной кислоты [Dunford, 1999].

Это двухкомпонентный фермент класса оксидоредуктаз, состоящий  из гематина (низкомолекулярного кофермента, содержащего железо) и апофермента (белковой частицы, составляющей основную часть фермента) [Уильямс, 1975]. В настоящее время известно, что пероксидаза выполняет две функции: пероксидазную и оксидазную.

Выполняя пероксидазную функцию, этот фермент катализирует реакции окисления различных субстратов определенной химической природы, перекись выполняет роль акцептора электронов: H₂O₂ = H₂O + O. К субстратам, окисленным пероксидазой в присутствии перекиси, могут быть отнесены следующие соединения: практически все фенолы (пирокатехин, пирогаллол, галловая кислота, гваякол и др.); ароматические амины (аланин, бензидин, парафенилоидиамин, белирубин и др.); йодистый водород, легко окисляемые вещества типа аскорбиновой кислоты, нитритов и других [Рубин, 1976].

Активность  пероксидазы возрастает с увеличением  дыхания семян при выходе их из состояния вынужденного покоя. Однако мало изучена роль пероксидазы в  механизме действия антиоксидантной системы в процессе прорастания семян пшеницы и не раскрыта роль низкомолекулярных антиоксидантов в формировании механизмов покоя семян пшеницы.

Одним из ферментов, который входит в состав антиоксидантов системы органов, обеспечивающих защиту от ксенобиотиков – является каталаза. Это двухкомпонентный фермент, состоящий из белка и соединенный с ним простетической группы. Кристаллическая каталаза содержит 0,09% железа, что соответствует четырем его атомам на молекулу.

Каталаза всегда присутствует в системах, где происходят процессы клеточного дыхания с участием флавиновых дегидрогеназ, в результате деятельности которых образуется токсичная для клетки перекись водорода. Поэтому каталаза выполняет важную роль, разлагая токсичную для клеток перекись водорода. Кроме того, весьма существенной должна быть признана роль каталазы в снабжении молекулярным кислородом тех участков ткани, куда доступ его в силу тех или иных причин затруднен. Например, ткани перикарпия сочных плодов, многослойная паренхима и другие [Кретович, 1986].Оптимальная величина рН для каталазы находится в интервале значений 6,0 – 8,0. Активность фермента зависит от вида растения, возраста клеток, типа ткани и других факторов. Методы, используемые для определения активности каталазы, основаны главным образом на количестве кислорода, образующегося в результате действия фермента [Кретович, 1986].

Каталаза  широко распространена в тканях животных, в т.ч. человека,  растений и в микроорганизмах (однако фермент полностью отсутствует у некоторых анаэробных микроорганизмов). В клетках каталаза локализуется в специальных органеллах - пероксисомах.

Биологическая роль каталазы заключается в деградации перекиси водорода, образующейся в клетках в результате действия ряда флавопротеиновых оксидаз (ксантиноксидазы, глюкозооксидазы, моноаминоксидазы и др.), и обеспечении эффективной защиты клеточных структур от разрушения под действием перекиси водорода [Кретович, 1986].

Глава II. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

II.1 Объект исследования

В качестве объекта исследования была выбрана пшеница мягкая «Омская-35» (Triticum aestivum L.).

Пшеница мягкая, или пшеница летняя (Tríticum aestívum L.) — вид однолетних травянистых растений рода пшеница (Triticum L.) семейства злаки (Poaceae L.).

Растение достигает  высоты 40—100 см, редко до 150 см. Соломино тонкая, полая внутри. Узлы голые или опушены лишь на ранних этапах жизни растения. Листовая пластинка 6—16 мм шириной, сначала мягкая, опушённая, но потом становится голой и жёсткой.

Старые соцветия безостые, 6-18 дюймов длиной, длина по крайней мере в 3 раза больше ширины. Оно густое и квадратное в поперечном сечении. Оси колосьев не отличаются ломкостью (отсюда название вида — пшеница мягкая).

Пшеница мягкая используется как хлебный злак для приготовления хлебобулочных изделий, а также для производства солода (пшеничного пива). Побочным продуктом молотьбы являются пшеничные отруби, которые используются в животноводстве как корм для скота или же употребляются в пищу.

Небольшое количество мягкой и твёрдой пшеницы используют для промышленного производства крахмала. [Невский С. А.Triticum aestivum L. — Пшеница летняя или мягкая Гл. ред. акад. В. Л. Комаров; Ред. тома Р. Ю. Рожевиц и Б. К. Шишкин, 1934 с. 687—688. — 778].

II.2 Обработка семян бактериями Bacillus subtilis

Для посадки  были отобраны крупные ровные семена. Для исследования использовали бактерии B. subtilis шт. 26Д и 11ВМ. Обработку семян бактериями проводили в стерильных условиях (в ламинарном- боксе). Часть семян обрабатывалась бактериями B. subtilis шт. 26Д и 11ВМ, остальная часть семян не обрабатывалась и служила контролем. Готовый препарат бактерий B. subtilis (10⁹ кл/мл) разводили в растворе KCl (0,01%) до концентрации 10⁶ кл/мл. Семена обрабатывали раствором бацилл из расчета на 1 г семян 20 мкл клеток бактерий, выдерживались в течение часа, затем использовали в экспериментах в почве или водной культуре (Мубинов, 2006).

II.3 Выращивание растений в водной культуре

Эксперименты  проводились в лабораторных условиях.

Обработанные  бактериями и контрольные семена проращивали в чашках Петри в дистиллированной воде. Перед посевом чашки Петри стерилизовали в сушильном шкафу в течение 45 минут при температуре 120 °С. Наклюнувшиеся семена раскладывали в вегетационные сосуды по 30 семян. Для эксперимента использовали стеклянные сосуды емкостью 750 мл.

В каждый сосуд наливали по 500 мл дистиллированной воды, и добавляли соли тяжелых  металлов, отмечали уровень жидкости. Резинкой фиксировали марлю на шейку сосуда, так чтобы марля погружалась в раствор на 1-2 мм. На марлю помещали пластиковый круг (d=4 см) и фильтровальную бумагу до погружения их в водный раствор. На фильтровальную бумагу раскладывали наклюнувшиеся семена.

Кадмий в виде соли Cd(NO₃)₂*4H₂O добавляли в конечной концентрации (в пересчете на ионы металла) 0,1 мг/л, 5 мг/л. Сосуд с водой без металла использовали в качестве контроля.

Водную культуру выращивали при равномерном освещении  в течение 14 дней, каждый день доливали дистиллированную воду до метки. На 14 день проводили измерение биомассы побегов и корней растений. В каждом опыте делали три биологические повторности.

II.4 Определение активности ферментов

Получение растительных экстрактов, содержащих белки и ферменты. Отбирали проростки пшеницы, выращенные в растворах с различной концентрацией тяжелых металлов. Проростки тщательно промывали в дистиллированной воде, удаляли избыток воды легким обжатием растений фильтровальной бумагой. Проростки взвешивали.

Рассчитывали  объем 0,1 М фосфатного буфера,  необходимого для экстрагирования белков и  ферментов, исходя из соотношения навеска: экстрагент 1:10 (мл). В предварительно охлажденную в холодильнике ступку помещали проростки, гомогенезировали.

Центрифугировали 10 минут при 6-8 тыс. об./мин. Отбирали над осадочную жидкость, не взмучивая осадок. Затем еще раз центрифугировали экстракт 10 минут при 16-18 тыс. об./мин.

Определение содержание белка в растительном экстракте. К 1 мл экстракта добавляли 4 мл биуретового реактива. Через 30 минут оценивали степень окраски на спектрофотометре при длине волны 540-560 нм. По построенной калибровочной кривой определяли концентрацию белка в 1 мл экстракта.

Определение активности пероксидазы в экстракте [Хайруллин, 2005]. Готовили 0,016%-ный раствор перекиси водорода, 0,1%-ный раствор ортофенилендиамина, раствор 4NH₂SО₄

В пробирку объемом 10 мл вносили 4,95 мл 0,1 М фосфатного буфера pН 6,0. Отбирали 50 мкл экстракта и вносили его в пробирку, перемешивали (произведено разбавление фермента 1:50). В пробирку вносили по 3 мл разбавленного экстракта, затем добавляли по 1 мл раствора ортофенилендимаина, 1 мл Н₂О₂. Через минуту реакцию останавливали 1 мл H₂SО₄. Оптическую плотность образцов оценивали на  спектрофотометре UNICO, при длине волны 492 нм. В контрольную пробу вносили 3 мл буфера.

Определяли  активность фермента по формуле:

 Активность = (А₄₉₂ конечное – А₄₉₂ начальное) 100/t·С,     ед. мг^-1·с^-1;

где: А₄₉₂ конечное - средний показатель оптической плотности раствора в трех лунках после остановки реакции;

А₄₉₂ начальный показатель оптической плотности раствора в трех лунках (принять за 0);

t – промежуток времени в секундах (или минутах), в течение которого проходила реакция окисления субстрата;

С - концентрация  белка в 1 мл экстракта;

100 - коэффициент  разбавления экстракта (1:100)

Определение активности каталазы в экстракте. Активность каталазы определяли в корнях (проростках) согласно методике, описанной в работе [Королюк с соавторами, 1988]. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.

В пробирки к 2 мл раствора 0,03% Н₂О₂ вливали по 0,1 мл растительного экстракта, полученного гомогенизацией материала в 0,05 М трис-НCl буфере рН 7,8 (0,1 г ткани на 1 мл буфера). В холостую пробу вместо растительного экстракта вносили 0,1 мл воды. Реакцию останавливали через одинаковые для всех образцов промежутки времени (10 мин) добавлением 1 мл 4%-го раствора молибдата аммония. Интенсивность развивавшейся окраски измеряли при длине волны 405 нм на спектрофотометре.