Выделение казеина из молока и альбумина из яичного белка

Министерство  образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное

Образовательное учреждение

Высшего профессионального  образования

ТУЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА БИОТЕХНОЛОГИИ

КУРСОВАЯ  РАБОТА ПО ОБЩЕЙ БИОТЕХНОЛОГИИ НА ТЕМУ:

«Выделение казеина из молока и альбумина из яичного белка».

            Выполнил:

              студент группы 430891  Кобякова А. А.

              Научный руководитель:  

              асс. каф. биотехнологии Акатова Е. В.                                    

Тула 2013

Содержание

Введение

Белок - наиболее важный компонент пищи человека. Основные источники пищевого белка: мясо, молоко, рыба, продукты переработки зерна, яйца хлеб, овощи. Для повышения пищевой ценности продуктов питания необходимо увеличение доли белкового компонента, сбалансированности его аминокислотного состава. Один из путей решения этой задачи - получение белковых продуктов из белоксодержащих продуктов, например семян масличных после удаления масла (шрот), отходов мясной и молочной промышленности, и их использование для улучшения биологической ценности существующих продуктов или создание новых продуктов питания.

   Казеин – важный пищевой белок. Хорошим источником этого белка служат молоко и сыр. Казеин используется в некоторых добавках к рациону, предназначенных для обогащения последнего белком. Такие добавки часто предписываются при различных патологических состояниях, например при тяжелых ожогах, лихорадке или затяжных заболеваниях. Казеин находит разнообразное применение в промышленности. Его используют как водостойкое вещество, обеспечивающее адгезию клея на склеиваемых поверхностях, как связующее вещество в производстве клеевых красок и при проклеивании бумаги, а также в качестве стабилизатора в различных эмульсиях. Обрабатывая казеин формальдегидом, можно получить пластик, из которого раньше изготавливали пуговицы и щетки.

Еще одним представителей пищевых белков - яичный альбумин. Кристаллический яичный альбумин (овальбумин, сухой яичный белок)  представляет собой мелкодисперсный гигроскопичный порошок от белого до светло-желтого цвета. Хорошо растворяется в воде, солевых растворах, кислотах и щелочах. Его широко применяют в пищевой промышленности при производстве кремов, зефира, суфле, безе, пирожных и т.п. 
В кондитерском производстве альбумин находит применение в тех случаях, когда требуется высокое мастерство создания стойкой пены, эмульгирования жиров, равномерности распределения составляющих производства, а также обогащения изделий полноценными животными белками. 
Его характеризуют повышенная взбиваемость и стойкость пены. Один килограмм альбумина заменяет приблизительно три сотни белков куриных яиц.

      Цель  работы: Выделение казеина из молока и альбумина из яичного белка с целью использования полученных веществ в лаборатории.  

1. Литературный обзор

1.1. Белки и их основные признаки

     Белки –  это высокомолекулярные биополимеры,  состоящие из остатков аминокислот. Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.

1. Различия  белков по форме молекул

Как уже говорилось выше, по форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большинстве своём спрятаны в гидрофобное ядро, и они значительно лучше растворимы в жидкостях организма, чем фибриллярные белки (исключение составляют мембранные белки).

2. Различия  белков по молекулярной массе

Белки - высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков - и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц).

3. Суммарный  заряд белков

Белки имеют в своём  составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются α-амино- и α-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apг и Гис.

Степень ионизации функциональных групп этих радикалов зависит  от рН среды. При рН раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся  в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (Н+) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшению отрицательного заряда белков: -СОО^- + Н⁺ → -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН" с протонами, образующимися при диссоциации NH₃⁺с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков:

-NH₃⁺ +ОН^- → -NH₂ + H₂O.

Значение рН, при котором  белок приобретает суммарный  нулевой заряд, называют "изоэлектрическая точка"  и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии.

Так как большинство  белков в клетке имеет в своём  составе больше анионогенных групп (-СОО^-), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, - гистоны, входящие в состав хроматина.

Белки, имеющие суммарный  положительный или отрицательный  заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Суммарный заряд увеличивает  количество диполей воды, способных  связываться с белковой молекулой, и препятствует контакту одноимённо заряженных молекул, в результате растворимость белков увеличивается. Заряженные белки могут двигаться в электрическом поле: анионные белки, имеющие отрицательный заряд, будут двигаться к положительно заряженному аноду (+), а катионные белки - к отрицательно заряженному катоду ( - ). Белки, находящиеся в изоэлектрическом состоянии, не перемещаются в электрическом поле.

4. Соотношение  полярных и неполярных групп на поверхности нативных молекул белков

На поверхности большинства  внутриклеточных белков преобладают полярные радикалы, однако соотношение полярных и неполярных групп отлично для разных индивидуальных белков. Так, протомеры олигомерных белков в области контактов друг с другом часто содержат гидрофобные радикалы. Поверхности белков, функционирующих в составе мембран или прикрепляющиеся к ним в процессе функционирования, также обогащены гидрофобными радикалами. Такие белки лучше растворимы в липидах, чем в воде.

5. Растворимость  белков

Растворимость белков в  воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать выпадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.

По структурным  признакам общепринято деление белков на две большие группы:

- простые белки (синонимы - протеины, апопротеины), структура которых представлена только полипептидной цепью;

- сложные белки (синонимы - протеиды, голопротеиды), которые содержат небелковый компонент.

1.1.2. Простые белки

К простым белкам относят  гистоны, протамины, альбумины, глобулины, проламины, глютелины и протеиноиды (или склеропротеины).

Гистоны (от греч. histos - ткань) - тканевые белки многоклеточных организмов, связанных с ДНК хроматина. Это белки небольшой молекулярной массы (11000-24000); по электрохимическим свойствам относятся к белкам с резко выраженными основными признаками (изоэлектрическая точка у разных гистонов колеблется в пределах 9,5-12,0). Гистоны имеют только третичную структуру. Выделяют 5 главных типов или фракций гистонов: Н₁, Н_2а, Н_2b, Н₃, Н₄. Деление основано на ряде признаков, главным из которых является соотношение лизина и аргинина во фракциях.

Основные функции гистонов - структурная и регуляторная. Структурная  функция состоит в том, что  гистоны участвуют в стабилизации пространственной структуры ДНК, а  следовательно, хроматина и хромосом. Четыре фракции гистонов, за исключением Н₁, составляют основу нуклеосом, являющихся структурными единицами хроматина; фракция Н₁ заполняет фрагменты ДНК между нуклеосомами. Регуляторная функция заключается в способности блокировать передачу генетической информации от ДНК к РНК.

Протамины - своеобразные биологические заменители гистонов, но качественно отличающиеся от них аминокислотным составом и структурой. Это самые низкомолекулярные белки (М 4000-12000), они обладают резко выраженными основными свойствами. Протамины - поликатионные белки; они связываются с ДНК в хроматине спермиев. Замена гистонов на протамины в хроматине спермиев наблюдается не у всех животных.

Проламины - группа растительных белков, содержащаяся в клейковине семян злаковых растений. Для проламинов характерна нерастворимость в воде, солевых растворах, кислотах и щелочах.

Глютелины - тоже растительные белки, нерастворимые в воде, растворах солей и этаноле. Они растворимы в слабых щелочах, очевидно, потому, что в них значительно больше, чем в проламинах, содержится аргинина и меньше пролина.

Альбумины и глобулины - групповое название белков, высаливающихся при разном насыщении нейтральными солями (сульфатом аммония или натрия). При 50%-ном насыщении раствора соли выпадают в осадок глобулины, а при полном (100%-ном) насыщении - альбумины. Альбумины и глобулины содержатся в плазме крови, в клетках и биологических жидкостях организма. Каждая из этих двух групп белков настолько разнородна, что среди них имеются белки с самыми разнообразными функциями.

Глобулины - белки с большей, чем альбумины, молекулярной массой (свыше 100000). В отличие от альбуминов они нерастворимы в чистой воде; растворимы в слабых солевых растворах. Глобулины - слабокислые или нейтральные белки (изоэлектрическая точка лежит в интервале рН 6-7,3); содержат меньше, чем альбумины, кислых аминокислот. Это слабогидратированные белки, поэтому и осаждаются они в менее концентрированных растворах сульфата аммония. Некоторые из глобулинов обладают способностью к специфическому связыванию веществ (специфические переносчики), другие, как и альбумины, к неспецифическому связыванию липидорастворимых веществ.

Протеиноиды - белки опорных тканей (костей, хрящей, связок и сухожилий, ногтей, волос и т. д.). Все они относятся к фибриллярным белкам (фиброин, коллаген, кератин, эластин). Они растворимы только в специальных растворителях.

1.1.3 Сложные белки.

Сложные белки или белок - небелковые комплексы (прежнее название - протеиды) содержат два компонента - простой белок и небелковое вещество. Последнее называют простетической группой (от греч. prostheto - присоединяю, прибавляю). Простетические группы, как правило, прочно связаны с белковой молекулой. Ниже представлены сведения о химической природе и биологической роли некоторых сложных белков.

Хромопротеины состоят из простого белка и связанного с ним окрашенного небелкового компонента, откуда и произошло их название (от греч. chroma - краска). Среди хромопротеинов различают гемопротеины (содержащие в качестве простетической группы железо), магний-порфирины и флавопротеины (содержащие производные изоаллоксазина). Хромопротеины наделены рядом уникальных биологических функций: они участвуют в таких фундаментальных процессах жизнедеятельности, как фотосинтез, дыхание клеток и целостного организма, транспорт кислорода и углерода, окислительно-восстановительные реакции, свето- и цветовосприятие и др. Таким образом, Хромопротеины играют исключительно важную роль в процессах жизнедеятельности.

Трансферрины (сидерофилины) - группа сложных белков, полученных из разных источников и характеризующихся способностью специфично, прочно и обратимо связывать ионы железа Fе (III) и других переходных металлов.

Флавопротеины содержат прочно связанные с белком простетические группы, представленные изоаллоксазиновыми производными - окисленными флавинмононуклеотидом (ФМН) и флавинадениндинуклеотидом (ФАД). Флавопротеины входят в состав оксидоредуктаз - ферментов, катализирующих оксилительно-восстановительные реакции в клетке. Некоторые флавопротеины содержат ионы металлов.

Нуклеопротеины состоят из белков и нуклеиновых кислот. Последние рассматриваются как простетические группы. В природе обнаружено два типа нуклеопротеинов, отличающихся друг от друга по составу, размерам и физико-химическим свойствам: дезоксирибонуклеопротеины (ДНП) и рибонуклеопротеины (РНП). Названия нуклеопротеинов отражают только природу углеводного компонента (пентозы), входящего в состав нуклеиновых кислот. У РНП углевод представлен рибозой, у ДНП - дезоксирибозой. Название "нуклеопротеины" связано с названием ядра клетки, однако ДНП и РНП содержатся и в других субклеточных структурах.

Липопротеины. Этот класс сложных белков состоит из белка и простетической группы, представленной каким-либо липидом. Липопротеины широко распространены в природе, в растениях, тканях животных и у микроорганизмов и выполняют разнообразные биологические функции. Липопротеины входят в состав клеточной мембраны и внутриклеточных биомембран ядра, митохондрий, микросом (это структурированные липопротеины), а также присутствуют в свободном состоянии (главным образом в плазме крови). К липопротеинам относятся, кроме того, тромбопластический белок ткани легких, липовителлин желтка куриного яйца, некоторые фосфолипиды молока и т. д. Установлено, что липопротеины участвуют в структурной, комплексной организации миелиновых оболочек, нервной ткани, хлоропластов, фоторецепторной и электронно-транспортной систем, палочек и колбочек сетчатки и др.

Фосфопротеины занимают особое положение в биохимии фосфорсодержащих соединений не только в результате своеобразия структурной организации, но и вследствие широкого диапазона функций в метаболизме. Большое количество фосфопротеинов содержится в ЦНС.

Характерной особенностью структуры  фосфопротеинов является то, что фосфорная  кислота оказывается связанной  сложноэфирной связью с белковой молекулой через гидроксильные группы β-оксиаминокислот, главным образом серина и в меньшей мере треонина.

К белкам этого класса относятся  казеиноген молока, в котором содержание фосфорной кислоты достигает 1%, вителлин, вителлинин и фосвитин, выделенные из желтка куриного яйца, овальбумин, открытый в белке куриного яйца, ихтулин, содержащийся в икре рыб, и др.

Гликопротеины. Белки это класса весьма прочно связаны с углеводами и их производными. Связь между углеводным компонентом и белковой частью в разных гликопротеинах осуществляется через одну из трех аминокислот: аспарагин, серии или треонин. К биологически активным гликопротеинам относятся открытые в последнее десятилетие интерфероны, синтезируемые в животных клетках в ответ на возбуждение экзогенным стимулятором. Из других гликопротеинов, выполняющих ряд важнейших биологических функций, следует отметить все белки плазмы крови (за исключением альбуминов), некоторые ферменты, а также гликопротеины в составе слюны (муцин), хрящевой и костной тканей и яичного белка (овомукоид).

1.1.4 Альбумины.

 Альбумины - белки относительно небольшой молекулярной массы (15-70 тыс.); они имеют избыточный отрицательный заряд и кислые свойства (изоэлектрическая точка 4,7) из-за большого содержания глутаминовой кислоты. Это сильно гидратированные белки, поэтому они осаждаются только при большой концентрации водоотнимающих веществ. Характерным свойством альбуминов является высокая адсорбционная способность. Они адсорбируют полярные и неполярные молекулы. Благодаря высокой неспецифической адсорбции различных веществ альбумины плазмы крови играют физиологически важную транспортную роль. Яичный альбумин или яичная белковина составляет главную часть органического вещества, заключенного в белке птичьих яиц.

Свойства сухого альбумина. Сухой альбумин представляет полупрозрачную массу белого или бледно-желтого цвета, твердую и ломкую, которая легко растирается в белый порошок. Масса эта не имеет ни вкуса, ни запаха. Она растворяется в воде, но довольно медленно; впрочем, растворимость ее идет быстрее, когда вода содержит какую-нибудь щелочную соль. Сухой альбумин можно подогревать до 100°, и он все еще будет растворяться в воде; при 140° теряет 4% воды, но по-прежнему сохраняет растворимость.

Свойства водяного раствора альбумина. — При нагревании раствор становится мутным при 60°, а между 60° и 75° альбумин переходит в белое нерастворимое вещество, известное под названием свернувшегося альбумина. Вращающая способность раствора очищенной белковины = 38°. Раствор чистого альбумина не изменяет растительных красок. Альбумин не растворяется в спирте и эфире. Крепкий спирт, прибавленный в избытке, осаждает альбумин в свернувшемся состоянии, а небольшое количество разбавленного спирта дает осадок, который вполне растворяется в воде. Если взболтать эфир с раствором альбумина умеренной крепости, то некоторая (малая) часть его свертывается. Азотная кислота осаждает альбумин и служит для обнаружения присутствия растворимого альбумина; нагревание способствует быстрейшему осаждению альбумина. Разбавленная серная кислота дает осадок альбумина только по прошествии некоторого времени. Небольшое количество соляной кислоты не осаждает альбумина, но с большим количеством ее образуется осадок вещества, содержащего эту кислоту. Метафосфорная кислота или раствор ее соли с уксусной кислотой осаждают альбумин. Пирофосфорная, ортофосфорная, уксусная и угольная кислоты не осаждают альбумина. Слабые растворы едкого кали и едкого натра не осаждают альбумина. Кислоты и щелочи производят изменения в свойствах альбумина; изменения эти будут ниже описаны под заглавием альбуминная кислота и альбуминная щелочь. Растворы хлористого натрия и других тому подобных щелочных солей не осаждают альбумина; но если прибавить уксусной кислоты к раствору альбумина, содержащему одну из этих солей, или же прибавить щелочной соли к раствору, содержащему уксусную кислоту, то получается осадок альбумина. Осадок образуют также многие металлические соли, прибавленные в раствор альбумина, например сернокислая соль закиси железа, хлористое железо, серно-медная соль, азотно-серебряная, нейтральные и основные уксуснокислые соли свинца и хлористая ртуть.

Железисто-синеродистый калий осаждает из раствора альбумина, содержащего  уксусную кислоту, преципитат, свободный  от калия. Хлор, бром и фенол свертывают альбумин. Закваска сычуга не дает осадка при обыкновенных температурах.

Кровяной альбумин или белковина крови находится в кровяной сыворотке, в мышечной сыворотке, в лимфе, в млечном соке и в большом изобилии в молозиве (colostrum).

1.1.5. Казеин

 Казеин  (от лат. caseus - сыр), основная белковая фракция коровьего молока. Представляет собой смесь нескольких фосфопротеидов (основные компоненты - α_s, β- и (-казеины) сходной структуры. В коровьем молоке содержание казеина составляет 2,8-3,5% по массе (от всех белков молока – около 80%), в женском - в два раза меньше. Содержание α_s-, β- и (-казеинов от всего казеина составляет соотв. 54,2, 30,1 и 13,3%. В фракцию казеина входит также γ-казеин (2,5% от всего казеина) - продукт частичного протеолиза β-казеина, катализируемого протеиназой молока. Основные компоненты казеина имеют генетические варианты, отличающиеся несколькими аминокислотными остатками. Изучена первичная структура всех казеинов и их физико-химические свойства. Эти белки имеют молекулярную массу около 20 тыс., изоэлектрическую. точку (рI) около 4,7. Содержат повышенные количества пролина (полипептидная цепь имеет β-структуру), устойчивы к действию денатурантов. Остатки фосфорной кислоты образуют сложноэфирную связь главным образом с гидроксигруппой остатков серина. Высушенный казеин - белый порошок без вкуса и запаха, практически не растворим в воде и органических растворителях, растворимы в водных растворах солей и разбавленных щелочей, из которых выпадает в осадок при подкислении. Казеин обладает способностью к створаживанию. Этот процесс имеет ферментативную природу. У новорожденных в желудочном соке содержится особая протеиназа-реннин, или химозин, который отщепляет от (-казеина гликопептид с образованием так называемым пара-(-казеина, обладающего способностью к полимеризации. Этот процесс - первая стадия створаживания всего казеина. У взрослых животных и человека образование пара-(-казеина происходит в результате действия пепсина. По способности к створаживанию казеин сходен с фибриногеномплазмы крови, который при действии тромбина превращается в легко полимеризующийся фибрин. Считается, что фебриноген является эволюционным предшественником казеина. Способность к створаживанию имеет большое значение для эффективной ассимиляции новорожденными молока, т.к. обеспечивает его задержку в желудке.

Казеин легко доступен для пищеварительных протеиназ  уже в нативном состоянии, в то время как все глобулярные белки приобретают это свойство при денатурации. При частичном протеолизе казеина, происходящем при ассимиляции молока новорожденными, образуются физиологически активные пептиды, регулирующие такие важные функции, как пищеварительную, кровоснабжение мозга, активность центр. нервной системы и др. Для выделения казеина снятое молоко подкисляют до рН 4,7, что вызывает выпадение казеина в осадок. Казеин содержит все необходимые организму аминокислоты (в т. ч. незаменимые), является главной составной частью творога и сыра; служит пленкообразователем в производстве клеев и клеевых красок, а также сырьем для пластмасс и волокон.

2. Методы выделения и очистки белков

Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует  проведения последовательных операций, включающих:

• дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;
• фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;
• экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);
• разделение смеси белков на индивидуальные белки.

1. Методы разрушения тканей и экстракции белков

Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.

Гомогенизация биологического материала

Ткань, находящуюся в  буферном растворе с определённым значением  рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

Метод замораживания  и оттаивания ткани

В результате попеременного  замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

После разрушения ткани  нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование  гомогената с разной скоростью позволяет  получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и  другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.

Экстракция  белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на протомеры

Если искомый белок  прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют додецилсульфат натрия. При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.

Удаление из раствора небелковых веществ

Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно  удалить из раствора, используя их Особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.

2. Методы очистки белков

Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков - их очистка от других белков, находящихся  в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора. Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах. На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.

Очистка белков избирательной денатурацией

Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при  кратковременном нагревании раствора до 50-70 °С или подкислении раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок-белки, или осадить их центрифугированием.

Высаливание

Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости  при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных  металлов вызывают обратимое осаждение  белков, т.е. после их удаления белки  вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH₄)₂SO₄. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Для разделения белков часто  используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ  между двумя фазами, одна из которых  подвижная, а другая неподвижная. В  основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают, пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул. Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет сказано ниже).