Диагностика наследственных заболеваний

Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта

Медицинский Институт

Факультет среднего профессионального образования

Кафедра фармации

 

 

 

 

 

 

 

Доклад на тему:

Диагностика наследственных заболеваний

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Работу выполнили:

Студентки 1 курса

Группы 1ФАРМ

Королева Анна

Свитко Анастасия

Силантьева Светлана

Швецкова Наталья

 

Содержание_____________________________________________

1.Введение

2.Клиническая диагностика наследственных болезней

2.1Основные принципы

2.2Общеклинические методы

2.3Клинико-генетические методы

3. Лабораторные методы диагностики:

3.1 Цитогенетика

3.2 Биохимические исследования

     3.3Молекулярно-генетические исследования

4.Заключение

 

Введение:_______________________________________ 

 

    Среди наследственных заболеваний человека одно из самых значительных мест занимают наследственные болезни обмена. Это довольно большая группа заболеваний, включающая в себя около 700 различных болезней. Для 200 из них в настоящее время установлена непосредственная причина, т. е. генетическая мутация, ее расположение в хромосоме человека. Большая часть обменных расстройств заключается во врожденной недостаточности определенного фермента, причиной чего и является генетическая мутация. При недостаточности фермента он либо не образуется в организме человека вообще, либо образуется, но отличается от нормального низкой активностью, что и приводит к нарушениям обмена. Фермент представляет собой вещество, без которого не могут протекать различные химические реакции, составляющие основу обмена веществ. Выпадение данной функции фермента создает блок в соответствующей химической реакции. В результате этого наблюдается накопление метаболитов, непосредственно предшествующих блоку, и дефицит конечных продуктов реакций; метаболический блок может также приводить к нарушению транспорта отдельных соединений.

    Накапливаемые  до блока химические вещества  довольно часто являются токсичными. Так, при недостаточности определенного  фермента в крови и тканях  скапливается не только аминокислота  фенилаланин, но и фенилпировиноградная кислота, оказывающая токсическое действие на мозг ребенка при таком заболевании, как фенилкетонурия. Наследственные нарушения синтеза мочевины могут привести к накоплению в крови и тканях аммиака, что также сопровождается токсическим поражением центральной нервной системы.

    Многие заболевания  обусловлены дефицитом конечных  продуктов обмена веществ, остановленных  в результате определенного блока. Примером могут служить наследственные  болезни синтеза гормонов (адреногенитальный  синдром, гипотиреоз, гипопаратиреоз).

    Целый ряд наследственных  болезней обмена обусловлен недостатком  в организме витаминов. В некоторых  случаях отсутствие или снижение  активности соответствующего фермента  может быть частично восстановлено  путем введения повышенных доз  витамина. Подобные нарушения обмена  веществ носят название врожденных  витаминзависимых. Когда в результате генетической мутации образование фермента полностью нарушается или образуется фермент с нарушенной структурой, лишенный своей активности, то введение повышенных доз витамина не дает какого-либо эффекта. Такие нарушения обмана веществ носят название витаминрезистентных (устойчивых к введению витаминов) врожденных нарушений.

    Причиной ряда  наследственных болезней обмена  может быть дефицит микроэлементов. Более 180 ферментов человеческого  организма представляют собой  металлопротеины, т. е. имеют в своем составе молекулы или ионы металлов. Такими металлами являются, к примеру, медь, цинк, марганец, магний, молибден, кобальт, селен. Дефицит микроэлементов может быть обусловлен особенностями среды, в которой живет человек, хотя в большинстве случаев он чаще связан с нарушениями всасывания или транспорта металлов в организме.                           

      Распознавание наследственных болезней обмена по возникающим симптомам представляется довольно затруднительным. Изменение активности ферментов обусловливает различные расстройства обмена, что ведет к появлению большого разнообразия симптомов. В некоторых случаях возникающие у человека признаки заболевания могут быть связаны с очень тяжелой патологией и вести к летальному исходу еще в периоде новорожденности, некоторые приводят к стойкой умственной отсталости и инвалидности. Иногда нарушения обмена сопровождаются менее выраженными симптомами либо протекают с полным их отсутствием.

     Несмотря на многообразие симптомов наследственных болезней обмена, можно выделить общие признаки, на основании которых можно делать выводы о наличии нарушения у ребенка. К таким признакам относятся: задержка умственного развития, нарушения со стороны нервной системы, повторные судороги и коматозные состояния, специфический запах мочи и тела (потных ног, кошачьей мочи, мышиный запах, запах кленового сиропа), поражение мышц, аномалии скелета, изменения волос и кожи, катаракта, увеличение размеров печени и селезенки, нарушения пищеварения, необъяснимые случаи смерти братьев (сестер).

    Ранняя диагностика наследственных болезней обмена до появления характерных симптомов, наличие которых говорит уже о необратимости процессов в организме человека, необходима прежде всего для своевременной коррекции обменных нарушений, а также для предупреждения возможных грозных последствий. С этой целью в последние десятилетия широкое распространение получили программы просеиваний (screening). Они применяются для выявления у населения отдельных видов наследственных болезней обмена. Массово обследуют всех новорожденных детей, а также лиц из особых групп риска, например детей, имеющих различные нарушения в развитии. Скрининг-программы включают в себя два этапа. На первом этапе выявляются предположительные больные или носители отдельных наследственных болезней обмена, на втором — осуществляется более полное обследование и окончательное распознавание болезни. В современных программах массового скрининга используются в основном способы определения патологических продуктов обмена в крови.

 

 

 

 

 

 

 

Клиническая диагностика наследственных болезней______________

 

1. Основные принципы.

До настоящего времени диагностика нередко начинается с жалоб больного, клинического осмотра и характеристики фенотипа, а затем подтверждающей диагностики с использованием разнообразных клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования.

 Использование традиционных  общеклинических методов базируется на оценке закономерностей проявления наследственной патологии, которая обусловлена взаимодействием генов и окружающей среды. Знание этих закономерностей помогает врачу не только в диагностике, но и в лечении больных. Проявления наследственных болезней отличаются широкой вариабельностью, они разнообразны по направленности и глубине изменений многих органов и систем, что обусловлено большим числом нозологических форм и тяжестью течения.

Клиническая диагностика наследственных заболеваний основывается на данных клинического обследования больных, генеалогического анализа и результатах широкого комплекса лабораторно-функциональных исследований.

Традиционно и исторически диагностика до недавнего времени осуществлялась от описания фенотипа и приближалась к исследованию генотипа, то есть от клинической характеристики патологии к определению этиологического фактора (генной, геномной или хромосомной мутации). Однако уровень научных исследований в настоящее время таков, что позволяет проводить диагностику наследственных болезней в двух прямо противоположных направлениях: от генотипа к фенотипу или от фенотипа к генотипу и все более начинает базироваться на исследовании генотипа. Появилась возможность на пути от генотипа к фенотипу использовать соответствующие методы лабораторной диагностики наследственных болезней.

    Принципы диагностики  наследственных болезней базируются  на результатах врачебного осмотра  и лабораторно-функциональных исследований. У врача должна быть «генетическая  настороженность». Вместе с тем  существуют особенности сбора  анамнестических данных, осмотра  больного с подозрением на  наследственное заболевание, выбора  клинико-генетического метода диагностики, путей формирования диагностического  поиска и т.д. Врач должен постоянно  пополнять свой багаж генетических  знаний.

 

 

1.2. Общеклинические методы диагностики

1. характеристика клинических проявлений патологии
2. использование общих принципов клинической диагностики
3. применение рутинных клинико-лабораторных и инструментальных исследований (клинический анализ крови, ЭКГ, ЭЭГ, УЗИ и др.)

  Использование общеклинических методов является традиционным для медицинской практики. Полученные в результате клинического обследования данные могут вполне использоваться для диагностики наследственных заболеваний. Следует лишь добавить, что «визуальное» клиническое обследование должно быть особенно тщательным, поскольку оно постоянно направлено на поиск микросимпмтомов или слабо выраженных фенотипических проявлений наследственной патологии.

 

1.3.Клинико-генетические методы диагностики

1. физикальное обследование пациента и его родственников
2. клинико-генеалогический метод, включающий в себя

составление родословной и ее анализ

3. синдромологический подход к диагностике
4. использование специальных лабораторных методов (исследование кариотипа, хромосомный анализ, применение ДНК-зондов, секвенирование и др.).

 

    До настоящего времени точная диагностика врожденных и наследственных болезней представляется сложной не только для врача-педиатра и неонатолога, которые первыми встречаются с данными патологическими состояниями, но и для врача-генетика. Сложность диагностики обусловлена прежде всего громадным многообразием наследственной патологии, большим удельным весом наследственных факторов в патологии детского возраста и в то же время редкостью отдельных ее форм, а также сходством симптомов наследственных заболеваний с клинической картиной ненаследственной патологии (перекрываемость симптомов). С наследственными болезнями встречается врач любой специальности: в неврологии насчитывается более 600 наследственных заболеваний, в дерматологии - более 300, в офтальмологии -более 350 и т.д. Одному врачу знать все наследственные болезни не представляется возможным, даже в пределах одной специальности. Однако врач должен овладеть общими принципами диагностики, чтобы своевременно заподозрить наследственную патологию и направить больного на генетическое обследование.

 

 

 

 

Лабораторные методы диагностики__________________________

 

3.1.Цитогенетический метод

Клиническая цитогенетика — относительно молодая наука.

    Благодаря использованию  цитогенетических маркеров появилась  возможность более эффективной  диагностики отдельных моногенных синдромов. Кроме того, методы цитогенетики нашли широкое применение в диагностике различных онкологических и гематологических заболеваний, в репродуктивной медицине, для пренатальной и преимплантационной диагностики.

    Цитогенетическую диагностику проводят с помощью микроскопа и это обследование, вовремя проведенное опытными специалистами, способно спасти огромное количество человеческих жизней. Эта диагностика способствует установлению правильного диагноза, благодаря чему можно своевременно начать лечение. Суть проводимого анализа заключается в проведении окрашивания некоторых участков хромосом, которые повреждены, используя для этого специальные зонды. Это предоставляет возможность обнаружить даже самые маленькие изменения, которые невозможно определить при помощи какой-либо другой диагностики, анализов. Результат этого исследования не нужно ждать несколько дней или даже недель, как при использовании других методов. Такое заключение, которое выдает генетик, можно получить в течение нескольких часов: сначала берется образец, с помощью реактивов проводится анализ, делаются цифровые снимки, которые исследуются специалистом.

     Показания к проведению  цитогенетических методов :

1. Нарушение репродуктивной  функции у мужчин и женщин  неясного генеза, а также мужская и женская стерильность при исключении гинекологической патологии женщин

2. Наличие у ребенка  множественных врожденных пороков  развития (МВПР)

3. Задержка умственного  и физического развития у ребенка

4. Подозрение на хромосомную  болезнь по клинической симптоматике:

• Изменение формы и размеров черепа (долихоцефалия, микроцефалия, гидроцефалия, краниостеноз)
• Изменение вида лица и его пропорции
• Аномалии конфигурации и расположении лба (низкий, выступающий, килевидный, в форме трилистника )
• Аномалии глаз (антимонголоидный разрез глаз, гипертелоризм, страбизм и др.)
• Аномалии подбородка (маленький, массивный, выступающий)
• Аномалии носа (седловидный, массивный, открытые и расширенные вверх ноздри и т.д.)

5. Подозрения на синдромы, характеризующиеся хромосомной  нестабильностью

6. Оценка мутагенных воздействий

 

Непрсредственно методами цитогенетики являются:

  1.G-banding (метод дифференциального окрашивания хромосом, включающий обработку хромосомных препаратов трипсином (GTG-бэндинг) или солевыми растворами (GAG-бэндинг) и последующей окраской красителем Гимза, позволяет получать интенсивную исчерченность хромосом (десятки чередующихся светлых и тёмных, а также "серых" полос на одной хромосоме). G-бэндинг является наиболее распространенным методом, обеспечивающим идентификацию отдельных хромосом, и используется во всех случаях стандартизации кариотипов.

2.Флуоресцентная in situ гибридизация , зачастую называемый FISH, позволяет выявлять хромосомные аномалии. Его преимущества состоят в том, что он позволяет исследовать клетки крови и костного мозга в том виде, в каком они находятся в данный момент, не переводя их в особую фазу деления, которая необходима для классических методов исследования хромосомных аномалий. Метод FISH используют в преимплантационной , пренатальной и постнатальной генетической диагностике ,в диагностике онкологических заболеваний, в ретроспективной биологической дозиметрии.

  3.Метод сравнительной геномной  гибридизации (Comparative Genomic Hybridization или CGH) –это  молекулярная цитогенетическая технология, объединившая стандартную цитогенетическую методику кариотипирования  и FISH-анализ. Преимуществом метода CGH является возможность проведения полного анализа структурных хромосомных аномалий всего генома в пределах одного эксперимента. Методика основана на сравнительном анализе. Одна из ДНК-проб берется из тканей пациента, другую получают из тканей здорового человека. Сравнительный анализ проводится путем одновременной гибридизации со стандартными хромосомами человека. Соответственно, если в результатах имеются различия, то это позволяет определить уменьшение или увеличение количества копий. Этот метод имеет ряд достоинств по сравнению с другими методами анализа изменений генома. Во-первых, он не зависит от источника исследуемого материала, и может быть успешно проведен с малым количеством тестируемой ДНК, включая архивный материал. Во-вторых, он позволяет получить детальную информацию о потерях или увеличении числа копий генетического материала по всему геному в одном эксперименте. Наконец, метод CGH не требует приготовления препаратов метафазных хромосом из исследуемой ткани, то есть не зависит от процесса культивирования клеток и связанных с ним артефактов.

    Медицинских ограничений для применения цитогенетических методов нет. Однако необходимо помнить ,что эти методы трудоёмкие и дорогие, назначение их наугад не оправдано . Правильнее назначать такие исследования по рекомендации врача-генетика после проведения медико-генетического консультирования.

 

3.2.Биохимические исследования

   В отличие от  цитогенетического метода, наследственные  заболевания, обусловленные генными  мутациями, а также полиморфизм  по нормальным первичным продуктам  генов изучают с помощью биохимических  методов.

  Эти методы позволяют  определить место и характер  мутации по изменениям в составе  затронутых мутацией белков. Например, при мутации, ведущей к замене  всего одной аминокислоты в  огромной молекуле переносчика  кислорода — гемоглобина, возникает  наследственное заболевание, получившее  название серповидной анемии, при  котором эритроциты принимают  форму полумесяца. Исследовав аминокислотный состав гемоглобина и обнаружив замену, можно сразу поставить диагноз.

Впервые эти методы стали применять для диагностики генных болезней еще в начале XX в. В последние 30 лет их широко используют в поиске новых форм мутантных аллелей. С их помощью описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ. Для многих из них выявлен дефект первичного генного продукта. Наиболее распространенными среди таких заболеваний являются болезни, связанные с дефектностью ферментов, структурных, транспортных или иных белков.

   Необходимо подчеркнуть, что биохимические методы  многоступенчаты. Для их проведения требуется  аппаратура разных классов. Материалом  для биохимической диагностики  могут быть моча, пот, плазма и  сыворотка крови, форменные элементы  крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты). При использовании просеивающего  метода в биохимической диагностике  можно выделить два уровня: первичный  и уточняющий. Каждый из этих  уровней может быть по-разному  «нагружен» реакциями в зависимости  от возможностей лаборатории.

   Основная цель  первичной диагностики заключается  в том, чтобы выявить здоровых  людей и отобрать пациентов  для последующего уточнения диагноза. В таких программах первичной  диагностики в качестве материала  используются моча и небольшое  количество крови. Программы первичной  биохимической диагностики наследственных  болезней могут быть массовыми  и селективными

   Селективные диагностические  программы предусматривают проверку  биохимических аномалий обмена (моча, кровь) у пациентов с подозрением  на генные наследственные болезни.

  В селективных программах  могут использоваться простые  качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для выявления фенилкетонурии) или более точные методы, позволяющие обнаруживать большие группы отклонений. Современные высокоточные технологии (высокоэффективная жидкостная хроматография, хроматомасс-спектрометрия, газовая хроматография, тандемная спектрометрия) позволяют идентифицировать любые метаболиты, специфичные для конкретной наследственной болезни.

Для определения содержания в крови, моче или амниотической жидкости промежуточных, побочных и конечных продуктов обмена кроме качественных реакций со специфическими реактивами на определенные вещества используют хроматографические методы исследования аминокислот и других соединений. Газовая хроматография применяется для выявления наследственных болезней обмена органических кислот. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируют все заболевания из группы гемоглобинопатий.

   Применение биохимических  исследований для диагностики  заболеваний в пренатальном периоде или непосредственно после рождения позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия. Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорожденных являются судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, ацидоз, нарушенное кислотно-основное равновесие, остановка роста. У детей биохимические методы используют во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, клиническая картина, специфичная для какой-либо наследственной болезни).

 Для диагностики многих  болезней биохимические методы  заменяют молекулярно-генетическими  в связи с их большей точностью  или экономичностью.

 

3.3. Молекулярно-генетические исследования

     Это новая эра в области ранней диагностики заболеваний и единственная на сегодняшний день возможность выявить предрасположенность к болезням задолго до их появления.

     Наиболее адекватные методы, обеспечивающие точную диагностику моногенных заболеваний, основаны на исследовании ДНК в районе определенных генов. Несмотря на то, что молекулярно-генетические методы, как правило, весьма сложны, трудоемки и дорогостоящи, данные, полученные в процессе ДНК-диагностики намного точнее и информативнее данных других анализов. Известно, что ДНК остается неизменной на протяжении всей жизни организма и одинакова во всех ядерных клетках, что позволяет использовать для анализа практически любые клетки организма, полученные на разных стадиях онтогенеза.

Основные этапы исследований:

1. Получение образцов  ДНК (или РНК) является исходным  этапом всех методов. Этот этап  реализуется в двух вариантах:

       а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток;

       б) накопление определенных фрагментов, которые предполагается                                                                                           анализировать с помощью полимеразной цепной реакции.

2. Рестрикция ДНК на  фрагменты

3. Электрофорез фрагментов ДНК

4. Визуализация и идентификация фрагментов ДНК

       Источником геномной ДНК могут быть дюбые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма. Поэтому такие образцы называются геномной ДНК. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК. Для этого требуется действительно небольшое количество биологического материала: например, 20-40 мг хориона, 1 мл крови, 5-10 мг культуры клеток. Для осущевствления некоторых методов достаточно 1 каплю крови или соскоб эпителия со щеки, или несколько волосяных луковиц. Возможность проведения молекулярно- генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов названной группы. К этому еще можно добавить, что выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов методов и может долго сохраняться в замороженном виде.

    Рестрикция ДНК на фрагменты является необходимым этапом в молекулярно-генетической диагностике. Этот процесс осуществляется рестриктазами. В генетике человека используется несколько десятков разных рестриктаз. Основное их свойство - разрывать двухцепочечную ДНК в пределах строго определенных для каждого фрагмента последовательностях нуклеотидов протяженностью 4-6 пар оснований (редко больше). При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.

    Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещенном в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно опрелелить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.

     Визуализация и идентификация фрагментов ДНК в геле является либо конечным этапом диагностики, либо необходимым элементом дальнейшего анализа. Визуализация фрагментов ДНК после ПЦР осуществляется сравнительно легко.

 

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР)

    Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в биологическом материале (пробе).

    За создание метода ПЦР Керри Мюллису в 1993 году была присуждена Нобелевская премия.

 

     Метод включает несколько этапов:

• расплетание двойной спирали ДНК
• расхождение нитей ДНК и последующее
• комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента

   ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C

Ход реакции:

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий

1.Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (денатурацией), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК.

2.Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров.

3. Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу.

  

Преимущества:

• ПЦР можно провести всего за один день, ее легко автоматизировать, реакция сравнительно недорога и чрезвычайно специфична.

• Метод ПЦР служит основой для дальнейших исследований амплифицированной последовательности:

- расщепления рестриктазами;

- определения нуклеотидной  последовательности;

- исследования экспрессии  in vitro с целью поиска мутаций, укорачивающих молекулу белка.

 

 

 

 

Заключение:________________________________________________

 

    Таким образом, при диагностике наследственных болезней следует учитывать как общие признаки, характерные для группы наследственных заболеваний, так и выявлять специфические признаки, характерные для отдельной нозологической формы. Поэтому, можно выделить две группы методов диагностики - общеклинические и специальные «генетические» методы.

   Принципы диагностики наследственных болезней базируются на результатах врачебного осмотра и лабораторно-функциональных исследований. У врача должна быть «генетическая настороженность». Вместе с тем существуют особенности сбора анамнестических данных, осмотра больного с подозрением на наследственное заболевание, выбора клинико-генетического метода диагностики, путей формирования диагностического поиска и т.д. Врач должен постоянно пополнять свой багаж генетических знаний.