Метод цифровой голографической микроскопии

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Разрешающая способность человеческого глаза  соответствует примерно 100 микрометрам, и для того чтобы человеку увидеть более мелкие предметы, требуются специальные устройства.

В конце XVII века был изобретен микроскоп, который открыл человеку новые миры, и в первую очередь мир живой клетки. К сожалению, у оптического микроскопа есть естественный физический предел разрешения приблизительно равный длине волны света(0,5 мкм), и к концу XIX века этот предел был достигнут. Электронный микроскоп стал следующим этапом позволившим человеку заглянуть вглубь микромира, в роли луча света в таком микроскопе выступает пучок электронов. Благодаря его разрешению, которое достигает несколько ангстрем (0,1 нм), ученым удалось получить изображение вирусов, отдельных молекул и даже атомов. Но и оптический и электронный микроскоп дают лишь плоскую картинку.

Цифровая  голографическая микроскопия дает человеку возможность увидеть трехмерную структуру микромира. Как известно, микроскоп с большим увеличением имеет небольшую глубину поля зрения, поэтому с его помощью можно одновременно наблюдать только небольшие участки сцены, которые находятся в непосредственной близости от фокальной плоскости микроскопа. Для того что бы была возможность наблюдения всей сцены по глубине необходимо производить перефокусировку микроскопа. Что достаточно сложно при условии, если предметом изучения являются движущиеся микрообъекты, например, живые организмы в некотором объеме жидкости. Так как за время перефокусировки микроскопа объекты могут перемещаться в пределах сцены, что может дать искаженное представление об изучаемых микрообъектах и их количестве. Техника голографической микроскопии позволяет преодолеть эту трудность. Для этого необходимо через объектив микроскопа, имеющий большую глубину резкости, чем весь микроскоп в целом, и с помощью импульсного источника излучения либо с помощью скоростной кинокамеры при непрерывной излучении произвести голографирование изучаемой области. Полученное в результате объемное изображение следует рассматривать через окуляр микроскопа, который можно фокусировать на различные плоскости полученной объемной картины.

В настоящее время существует множество экспериментальных данных, касающихся возможностей практического применения голографической микроскопии в самых различных областях науки и техники.[1] 

1. ГОЛОГРАФИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ.

1. Общие сведения о голографической микроскопии.

Современный, неинвазивный метод для изучения микрообъектов и процессов микроуровня, в том числе и динамических.

Метод чувствителен к изменениям оптического пути, который варьируется при незначительных изменениях коэффициента преломления и формы образца, поэтому для наблюдения прозрачных и полупрозрачных образцов не требуется применять какие-либо методы увеличения контраста. Кроме того, интенсивность света, применяемого при цифровой голографической микроскопии, в несколько тысяч раз меньше, чем применяемого в конфокальной микроскопии. [2] 

2. Достоинства цифровой голографической микроскопии.

1. Большая глубина резкости в двадцать и более раз превышающая значения характерные для обычного микроскопа, позволяет наблюдать одновременно несколько объектов, находящихся на разном фокусном расстоянии, за счет возможности реконструкции произвольного сечения объема. 
2. Непосредственный доступ к информации об амплитуде и фазе волнового фронта дает широкие возможности для фильтрации и автоматического анализа объектов (их положения в трехмерном пространстве, размеров, формы). 
3. Метод является неразрушающим: не требуется никакой предварительной подготовки образцов, никакого окрашивания. [2]

3.  Применение и области применения методов цифровой голографии.

Области применения методов цифровой голографии:

1. Медицина, биология, экология, океанология.
2. Микроэлектроника, микроэлектромеханические (MEMS) и микрооптоэлектромеханические (MOEMS) системы, нанотехнологии.

Применение методов цифровой голографии:

1. Измерение трехкомпонентных скоростей нестационарных пот оков и микропотоков в трехмерном пространстве (D-HPIV). 
2. Отслеживание траектории движения частиц в трехмерном пространстве и изучение процессов агломерации частиц. 
3. Измерение распределения по размерам аэрозольных частиц, пыли или частиц суспензии (особенно актуально, если частицы имеют форму отличную от сферической, когда непосредственное применение теории Ми некорректно). 
4. Бесконтактный контроль топологии и шероховатости поверхности с точностью до нескольких нанометров (в системах контроля качества). 
5. Измерение малых деформаций и перемещений вплоть до нескольких нанометров. 
6. Исследование физики микрокапель (droplets). 
7. Неинвазивный метод для изучения динамических процессов в живых клетках. В том числе при исследованиях раковых клеток и клеток крови. 
8. Изучение планктонных организмов, динамики поведения и способов их передвижения (океанология, биология, экология). [2]

2. ОБЗОР МЕТОДОВ ДЛЯ  ИЗУЧЕНИЯ ДИНАМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЖИВЫХ  КЛЕТКАХ.

1. Конфокальная микроскопия:

Современный метод регистрации флуоресцентных микрообъектов, с использованием оптического микроскопа, диафрагма которого, обеспечивает регистрацию флуоресценции только от объектов, расположенных в фокальной плоскости.  

Принцип действия: 

Луч лазера с помощью селективного зеркала направляется в объектив микроскопа и фокусируется на точке в глубине исследуемого объекта. Флуоресценция, излучаемая из этой точки, собирается объективом и фокусируется линзой в сопряженной фокальной плоскости объектива, проходя через отверстие в  

Рисунок 1. Схема конфокального микроскопа. 

конфокальной диафрагме к фотоэлектронному умножителю. Флуоресценция, излучаемая из других точек объекта, дефокусирована на конфокальной диафрагме и к фотоэлектронному умножителю не проникает. Тем самым обеспечивается подавление флуоресценции, испускаемой из точек образца, расположенных выше и ниже фокуса объектива, и улучшается разрешение вдоль оптической оси объектива. Информация об объекте по каждой линии сканирования передается в компьютер, где с помощью программы реконструируются объёмные изображения объектов. [3]

«+»

• Высокое разрешение вдоль оптической оси объектива и в плоскости объекта, которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации отраженных от образца лучей.
• Высокая контрастность изображения.
• Возможность проведения объемной реконструкции объекта и получение его трехмерного изображения.
• Исследования  динамических процессов, происходящих в живых клетках, возможны при помощи записи серии оптических срезов, из которых можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение. [4]

«-»

• В конфокальном микроскопе существуют случайные флуктуации сигнала или шумы, имеющие разнообразную физическую природу. Высокочастотные шумы проявляются на изображении как яркие или темные точки,  и их источниками являются лазеры,  фотоприемники,  электронные блоки, волоконно-оптические кабели. Низкочастотные шумы видны как горизонтальные полосы.  Эти шумы могут возникать из-за наводок по электрической сети,  вибраций и других причин. 
• При попытке повышения яркости изображения, при помощи увеличении мощности лазера, может произойти  «выцветание»  препарата,  а также повреждение живых клеток.
• Большое время получения объемного изображения – от десятков минут до нескольких часов. [5,6]

2. Ультрафиолетовая микроскопия:

Разновидность световой микроскопии.

Метод основан на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов и тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волны. В ультрафиолетовом микроскопе используют короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах. [7] 

 Принцип действия:

Живая клетка освещается ультрафиолетовыми  лучами, некоторые вещества (нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты и т.д.), входящие в состав клетки поглощают ультрафиолетовое излучение. В результате получается в ультрафиолетовых

Рисунок 2. Схема ультрафиолетового микроскопа.

лучах невидимое глазом изображение, которое преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств таких как люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь. Изображение представляет собой свечение вызванное только тем ультрафиолетовым светом, которое осталось не поглощенным при прохождении через живую клетку. 

Метод используется для исследования живых объектов и их изменений в процессе жизнедеятельности. 
 
 

«+»

• Позволяет увеличить предельную разрешающую способность (порядка 0,1 мкм).
• Частицы прозрачные в видимом свете, хорошо поглощают ультрафиолетовое излучение определенных длин волн, и, следовательно, хорошо различимы на ультрафиолетовых изображениях.

«-»

• Не цветное изображение или изображение в условных цветах (препарат фотографируется в трех   длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определенного цвета (например, синим, зеленым и красным), и все они одновременно проецируются на один экран. В результате на экране создается цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете).
• Необходимость применения дорогих кварцевых линз вследствие интенсивного поглощения ультрафиолетового излучения стеклом.
• Необходимость применения для фокусировки флуоресцентного окуляра и пластинки покрытой флуоресцентными кристаллами. [8,9]

3. Фазово-контрастная  микроскопия:

Передовой метод диагностики живой клетки. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Повышение контраста позволяет видеть все структуры, различающиеся по показателю преломления. [7]

Фазово-контрастная микроскопия находит применение в микробиологии, паразитологии, при исследовании микроорганизмов, простейших клеток растений и животных, при изучении клеток культуры тканей. 

Рисунок 3. Схема фазово-контрастного микроскопа.

Принцип действия:

При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменяется фаза колебания световой волны. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные. При помощи фазово-контрастного конденсора и фазового объектива часть света, проходящего через микроскоп, сдвигается по фазе на половину длины волны относительно другой части, благодаря чему

достигается контраст на изображении. 
 

«+»

• Неинвазивный метод.
• Позволяет получить контрастное изображение прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при использовании обычных методов микроскопии.
• Возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки.
• Возможность применения метода на обычном микроскопе, путем использования специальных компонент (окуляры, конденсор). Примерная стоимость компонент 32 000 рублей. [10]

«-»

• Наличие светящихся ореолов вокруг объектов.
• Не увеличивает разрешающей способности микроскопа.
• Позволяет наблюдать только контуры объектов. [11,12]

4. Интерференционная микроскопия:

Метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). С помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Интерференционная микроскопия дает возможность определять толщину живых объектов, концентрацию в них воды и сухого вещества и т. д. На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования.[13] 

Принцип действия:

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. [14]

Три основные схемы с использованием которых построены интерференционные микроскопы – это схема Линника, Маха-Цендера и Миро. Для каждой схемы выделяют свои достоинства и недостатки. [15]

 
«+»

• Неинвазивный метод.
• Возможность изучения деталей прозрачного объекта.
• Возможность рассчитывать общую массу и концентрацию сухого вещества в объекте, а так же его размеры.
• Возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки. [16]

«-»

• Необходимость точной настройки и высокая чувствительность к вибрациям (в интерференционных    микроскопах построенные по схеме Линника).
• Значительные потери света при многократных отражениях (в интерференционных микроскопах построенные по схеме Миро).
• Сложность реализации, большое количество оптических элементов высокой стоимости (в интерференционных микроскопах построенные по схеме Маха-Цендера). [15]

5. Двухфотонная микроскопия:

Метод регистрации флуоресцентных микрообъектов с помощью оптического микроскопа.

Принцип действия:

Для того что бы индуцировать флуоресценцию, объект возбуждают следующим образом: два фотона, обладающие низкой энергией, возбуждают флуорофор(способную к флуоресценции молекулу или часть молекулы) в течение одного квантового события. Результатом этого возбуждения является последующее испускание возбужденными молекулами флуоресцентного фотона. Поскольку вероятность одновременного поглощения двух квантов света пропорциональна квадрату интенсивности света, сфокусированного на образец, необходим большой поток возбуждающих фотонов, который можно получить при помощи лазера, испускающего фотоны с большой частотой следования импульсов (80 МГц). Результат двухфотонной флуоресценции будет наблюдаться только в фокусной плоскости микроскопической системы. [17]

«+»

• Высокая проникающая способность, составляющая более одного миллиметра.
• Использование длинных волн, обеспечивает высокое пространственное разрешение, так как они рассеиваются меньше, чем короткие.
• Возбуждающие фотоны имеют маленькую энергию, следовательно, они менее разрушительны для тканей.

«-»

• Высокая стоимость оптического оборудования.
• Двухфотонный спектр поглощения флуорофора может сильно меняться в отличие от однофотонного спектра поглощения.
• Луч с длиной волны более 1400 нм значительно поглощается водой в живых тканях. [18]

3. ОБЗОР МЕТОДОВ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПО РАЗМЕРАМ АЭРОЗОЛЬНЫХ ЧАСТИЦ, ПЫЛИ ИЛИ ЧАСТИЦ СУСПЕНЗИИ.

1. Метод электронной микроскопии:

Электронная микроскопия - это прямой, локальный метод измерения размеров и концентрации аэрозольных частиц. Метод дает сведения о размере частиц только непосредственно в поле наблюдения, поэтому изучаемый участок вещества или материала должен быть характерным для всего вещества. Размеры и концентрация аэрозольных частиц во многом определяют их свойства. [19]

Методом электронной микроскопии можно изучать порошки, микрокристаллы, частицы аэрозолей, нанесённые на подложку: тонкую плёнку для исследования в просвечивающей электронной микроскопии или массивную подложку для исследования в растровой электронной микроскопии. 

Принцип действия:

Просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия (ПЭМ) – прямой метод измерения размеров структурных элементов.

В просвечивающем электронном микроскопе при воздействии пучка электронов и образца, происходит рассеяние электронов, которое регистрируется,  после увеличения магнитными линзами, на  флуоресцентном экране, фотоплёнке или сенсорном приборе с зарядовой связью (ПЗС-матрице). [20] 

Растровый электронный микроскоп (РЭМ) основан  на использовании предварительно сформированного  тонкого электронного луча, управление положением которого ведется с помощью электромагнитных полей.

Электронный зонд последовательно проходит по поверхности исследуемого образца. 

При воздействием электронов пучка и объекта происходит ряд процессов, характерных для  данного материала и его структуры. Это, например, рассеяние первичных электронов, испускание (эмиссия) вторичных электронов, появление электронов, прошедших сквозь объект, возникновение характеристического излучения. Синхронно с разверткой электронного зонда осуществляется построение изображения на мониторе компьютера. По яркости пикселя на мониторе можно узнать величину регистрируемого сигнала, так как они пропорциональны. Растровый электронный микроскоп позволяет получить увеличение 5 – 1 000 000 крат при достаточной контрастности изображения.[21] 

К недостаткам метода электронной микроскопии можно отнести высокую трудоемкость и большое время анализа и сложности в приготовлении образцов.[22]

2. Метод  лазерной дифракции:

Рассеяние Ми и дифракция Фраунгофера:

При взаимодействии лазерного света с частицей наблюдаются  процессы рассеяния света, характеризующие размер частицы, такие как дифракции, рефракции, отражения и поглощения.

Теория  Ми описывает это явление относительно оптических свойств (рефракция и  абсорбция) частиц. Чем меньше частицы, тем выше роль рефракции и абсорбции  в модели рассеяния света. Для определения размеров для таких частиц, рассеянный свет должен детектрироваться под большими углами. Интерпретация модели рассеяния света по теории Ми распространяется на весь диапазон размеров частиц, включая дифракцию Фраунгофера как частный случай. Если все частицы в пробе больше чем длина волны света, часть теории Фраунгофера доминирует в Теории Ми при расчетах размеров частиц. Расчеты в соответствии с теорией Ми позволяют использовать только один метод расчетов для полного спектра размеров. В основе теории лежат два допущения, принципиальные с точки зрения получаемых результатов:

Предполагается, что частицы сферичны. Это является важным, поскольку сферичность для  реальных частиц встречается крайне редко. Лазерная дифракция – метод, который чувствителен к объёму частицы. Поэтому диаметры частиц вычисляются на основании измеренного объёма частиц, в предположении сфер эквивалентного объёма. 

Суспензия достаточно разбавлена. Концентрация частиц предполагается малой для  обеспечения непосредственного  измерения рассеянного света детектором (т.е. однократного рассеяния) и отсутствия повторного рассеяния перед попаданием на детектор (т.е многократного рассеяния).[23] 

 Дифракция Фраунгофера.

Если  частица относительно больше чем  длина волны падающего света (для частиц размером до нескольких микрон), то происходит преимущественно процесс дифракции. Информация о размере частицы заключается в маленьком угле дифракции. Лазерные дифрактометры для определения размеров частиц используют эту теорию, прежде всего для измерения интенсивности распределения в прямом направлении для малых углов (<35°) и используют эту информацию для расчета распределения размеров частиц. 
Если размер частиц такой же или меньше чем длины волн падающего света, то гораздо больше света рассеивается под большими углами по сторонам и  отражается назад.[24]

Принцип действия:

В основе метода лазерной дифракции лежит  фундаментальный принцип зависимости  углового распределения рассеянного  частицами света от размера частиц. С уменьшением размера частиц интегральная интенсивность рассеянного вперёд света уменьшается, при этом, значительнее становится вклад рассеяния на большие углы. Таким образом, для больших частиц характерна высокая интенсивность рассеяния в прямом направлении при малых углах рассеяния, а для маленьких – меньшая интенсивность рассеяния в прямом направлении и меньшая разница между интенсивностью рассеяния на малых и больших углах рассеяния.

Луч лазера освещает частицы, которые диспергированны  в прозрачном газе. Угловая зависимость  интенсивности света, рассеянного частицами определяется их размерами и оптическими характеристиками. Свет, рассеянный частицами на различные углы, регистрируется многоэлементным фоточувствительным детектором. Регистрируемая дифракционная картина называется индикатрисой (диаграммой) рассеяния образца. На основании измеренного распределения интенсивности, с использованием теории светорассеяния Ми, осуществляется восстановление функции распределения частиц по размерам. Поскольку прибор измеряет множество частиц, а не единичные частицы, то в зоне измерения анализатора (например, для частиц размерами порядка 10мкм) во время измерения находятся миллионы частиц, что определяет высокую статистическую значимость получаемых результатов. [25]

3. Метод диффузионных батарей:

Метод основан на определении коэффициента диффузии частиц и восстановлении их распределения по размерам из известной зависимости коэффициента диффузии частиц от их размера.  

Принцип действия:

Коэффициент диффузии частиц определяется измерением коэффициента осаждения аэрозольных частиц, происходящего за счет диффузии при прохождении анализируемого потока воздуха или другого газа, содержащего аэрозольные частицы, через пористую среду или капиллярные трубки. Обычно в качестве пористой среды используется ряд сеточек, установленных перпендикулярно двухфазному потоку газа с частицами. Скорость осаждения зависит от коэффициента диффузии частиц в газе, а диффузия однозначно связана с размером частиц. Восстановить распределение по размерам позволяет развитая математическая модель диффузионного осаждения частиц в таких процессах. Для регистрации и счета частиц, прошедших данную секцию диффузионной батареи, они направляются в конденсационную камеру, где увеличиваются до оптически регистрируемого размера и далее поступают в оптический счетчик. Регистрация концентраций аэрозоля, взятого последовательно с каждой секции диффузионной батареи, происходит в ходе цикла накопления первичных данных. Далее проводится компьютерная обработка набора коэффициентов проскока и в результате определяется распределение частиц по размерам. [26]

4.   Метод каскадных импакторов:

Метод, основанный на инерционном осаждении  аэрозольных частиц на волокнах фильтра  при скоростях фильтрации от долей  до нескольких м/с, известный как  метод многослойных фильтров (ММФ) позволяет определить дисперсность аэрозолей в диапазоне размеров от 100 нм до нескольких мкм. Следовательно, для оперативного определения дисперсного состава аэрозолей наиболее подходящими являются каскадные импакторы и пакеты фильтров.[27] 

Принцип действия:

Импакторы - это селективные пробоотборные  устройства. Частицы в инпакторах разделяются на размерные фракции  в диапазоне от долей до десятков мкм, это происходит за счет инерционного осаждения на препятствиях (коллекторах) при скоростях потоков до нескольких десятков м/с.

Импакторы состоят из каскадов, каждый из которых  содержит разгонные сопла и коллекторы для осаждения аэрозольных частиц. Существенно затрудняет его использование  то, что для осаждения частиц с  размерами менее 1 мкм требуется  значительное увеличение гидродинамического сопротивления этих устройств. При этом эффективность осаждения аэрозольных частиц становится ниже, а искажение гидродинамических параметров несущей среды приводит к ошибкам в определении дисперсного состава, особенно в диапазоне от долей мкм до 1 мкм.