Методы генной инженерии. 2
Федеральное бюджетное учреждение высшего профессионального образования
Нижегородский
Государственный Технический
Факультет: «Экономики, менеджмента и инноваций»
Реферат
по дисциплине: «Основы биотехнологии»
на тему: «Генная инженерия»
1.История развития генной
2.Методы генной инженерии……………
2.1.Рестриктазы………………………………………
2.2.Плазмиды………………………………………………
2.3. Встраивание фрагмента чужеродной ДНК в плазмиду…………………………………………………..8
3.Значение
генной инженерии……………………………………
3.1.Генная инженерия в
3.2.Генная инженерия животных…
3.3.Первое клонированное животное…………………………………………………………
3.4.Генная инженерия человека…………………………………………………………
4.Проект «Геном человека»……………
5.Научные факты опасности генной
инженерии………………………………………………………
6.Список
литературы……………………………………………………
1.История развития генной инженерии
Генетическая инжене́рия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.
Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.
На рубеже
50 - 60-х годов были выяснены свойства
генетического кода, а к концу
60-х годов его
Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа.
Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.
1938 г.-Г. Шпеманн использует ядра клеток зародыша саламандры для клонирования идентичных близнецов.
1945-1950 гг.–выращиваются первые клеточные культуры животных.
1953 г.-Р. Бриггс и Т. Кинг сообщили об успешной разработке метода «нуклеотрансфера»-переноса ядра клетки в гигантские икринки африканской шпорцевой лягушки «ксенопус».
50-е годы 20 века - выращены первые клеточные культуры человека; проводится искусственное оплодотворение домашнего скота с помощью замороженной спермы; обнаружены плазмиды бактерий.
1970 г.-Г. Смит и В. Арбер выделили рестриктазу.
1972 г.-П. Берг получил in vitro рекомбинантную ДНК, состоящую из фрагментов ДНК вируса обезьян sv-40, ДНК бактерии E.coli и ДНК фага λ.
Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.
1973 г.-Л. Шетлз из Колумбийского университета Нью-Йорка заявил, что он готов произвести на свет первого «бэби из пробирки», после чего последовали запреты Ватикана и пресвитерианской церкви США.
1975 г.-Ф. Сэнгер предложил первый прямой метод определения последовательности ДНК.
1975г.-Э. Саузерн и Р. Дейвис разработали метод, который позволяет идентифицировать конкретные гены и другие рестрикционные фрагменты ДНК после их электрофоретического разделения.
1977 г.-Дж. Коллинзом и Б. Холманом разработан метод клонирования ДНК с использованием космид.
1977 г.-А. Максамом и У. Гилбертом разработан метод секвенирования ДНК.
1978г.-создан генно – инженерный инсулин, который практически полностью идентичен естественному белку. Это открытие позволило спасти миллионы жизней больных диабетом.
1978 г.- синтезирован генно-инженерный гормон роста человека.
1978г.- рождение в Англии Луизы Браун, первого ребенка «из пробирки».
Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных. Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.
1979 г.- завершена публикация серии статей о работах профессора Оксфордского университета Дж. Гердона, в ходе которых было клонировано 50 лягушек.
1981 г.- К. Илмензе и П. Хоппе получили серых мышей, перенеся ядра клеток серого зародыша в цитоплазму яйцеклетки, полученной от черной самки, после чего эмбрионы были перенесены в белых самок, которые и выносили потомство.
4 января 1985 г.- в одной из клиник Лондона родилась девочка у миссис Коттон-первой суррогатной матери («бэби Коттон», как назвали девочку, была зачата не из яйцеклетки миссис Коттон). Был вынесен парламентский запрет на эксперименты с человеческими эмбрионами старше 14 дней.
1986 г.- создана генно-инженерная вакцина против гепатита В и генно-инженерный интерферон против различных вирусных заболеваний и злокачественных новообразований.
1987 г.- первые полевые испытания генетически модифицированных сельскохозяйственных растений (томат, устойчивый к вирусным заболеваниям).
1990 г.- начало международного проекта по созданию генетической карты человека (Human Genom Project).
1990 г.- проведена успешная генная терапия, спасшая жизнь четырехлетней девочке, с нарушением иммунитета.
1993 г.- генетически измененные продукты допущены на прилавки магазинов мира.
1993 г.- К. Мюллис за разработку метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) удостоен звания лауреата Нобелевской премии.
1997 г.- журнал «Сайенс» сообщает о рождении шести овец, полученных по рослинскому методу. Три из них, в том числе и овечка Полли, несли человеческий ген «антигемофильного фактора IX».
1998 г.- успешно выращиваются эмбриональные стволовые клетки; создана полная генетическая карта животного (секвенирование генома «Круглого червя»).
1998 г.- французские ученые объявили о рождении клонированной телочки.
2001 г.- создана первая полная генетическая карта сельскохозяйственного растения (риса).
2002 г.- почти полностью расшифрован геном человека.
2.Методы генной инженерии
Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.
Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.
Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
-специфическое расщепление
-быстрое секвенирование всех
нуклеотидов очищенном
-конструирование
-гибридизация нуклеиновых
-клонирование ДНК:
-введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
2.1.Рестриктазы
В середине 70-х годов было сделано странное и не сразу понятое во всей своей значительности открытие. Из некоторых бактерий удалось выделить ферменты, обладающие способностью «разрезать» двойную спираль ДНК любого происхождения, т. е. способностью разрывать сахаро-фосфатные цепочки в обеих нитях. Условием такого разрезания оказалось наличие в этой ДНК короткой, но вполне определенной последовательности нуклеотидов (считая по одной из нитей в направлении 51--3'), так называемого «сайта узнавания» рестриктазы. Этот сайт может насчитывать от 4-х до 8 нуклеотидов. Ошибочно думать, что столь короткие последовательности должны встречаться очень часто. Даже серия из 4-х, наперед заданных нуклеотидов имеет реальный шанс появиться лишь один раз на отрезке ДНК длиной в 44 = 256 пар оснований. Для одной из наиболее часто используемых рестриктаз (EcoRl), сайт которой (ГААТТЦ) насчитывает 6 нуклеотидов, такой шанс появляется в среднем один раз на участке ДНК длиной в 46 = 4 096 пар оснований. Для некоторых рестриктаз (тип I и III) место разреза не однозначно связано с положением сайта узнавания. Такие рестриктазы неудобны для исследовательских целей. У типа II разрез локализован в самом сайте узнавания, что делает эту операцию определенной.
Два последних
десятилетия поиск новых
Некоторые из рестриктаз разрезают обе нити ДНК в одном месте, точно ножом. У других -- места разреза могут быть сдвинуты на одной нити ДНК относительно другой (в пределах сайта узнавания). В первом случае говорят о «тупых» концах разреза, во втором -- о «липких» концах обеих нитей в области разреза. Название «липкие» отражает тот факт, что образующиеся в этом случае на каждой из нитей короткие однонитевые последовательности нуклеотидов, очевидно, комплементарны друг другу и могут, вообще говоря, вновь соединиться водородными связями между основаниями. Хотя это, конечно, не восстановит целостности разрезанного участка ДНК. По крайней мере до тех пор, пока уже знакомый нам фермент ДНК-лигаза не «зашьет» сделанные рестриктазой разрезы на каждой из нитей.
Могущество
новообретенного инструмента
2.3.Плазмиды
Было обнаружено, что у многих видов бактерий помимо основной массы ДНК, находящейся в «бактериальной хромосоме» (несколько миллионов пар оснований) имеются еще «крошечные» кольцевые, двунитевые и суперскрученные молекулы ДНК. Они были названы плазмидами -- по месту расположения их в протоплазме клетки. Количество пар оснований в плазмидах ограничено диапазоном от 2-х до 20-ти тысяч. Некоторые бактерии имеют только по одной плазмиде. В других -- их обнаруживается несколько сотен.
В норме плазмиды
редуплицируются при делении
бактериальной клетки одновременно
с основной ДНК хромосомы. Для
своего размножения они используют
«хозяйские» ДНК-полиме-разы I, III и
другие ферменты. Плазмиды синтезируют
свои специфические белки, для чего
используется РНК-полимераза и рибо-сомы,
также принадлежащие бактерии-
Очищенные плазмиды способны проникать из питательной среды внутрь клеток чужеродных бактерий, там обосновываться и нормально размножаться. Правда, для этого приходится предварительно увеличивать проницаемость оболочек этих бактерий, обрабатывая их раствором хлористого кальция.
Успешное встраивание чужой плазмиды удается лишь для ничтожного меньшинства клеток обрабатываемой популяции. Однако если бактерия-реципиент не обладала устойчивостью к определенному антибиотику, а «прижившаяся» плазмида эту устойчивость ей сообщает, то даже из единичных успешно «трансформированных» бактерий на питательной среде с добавкой антибиотика можно вырастить вполне полноценные колонии, наследственно обладающие встроенной плазмидой.
Наконец, самое важное. Если в ДНК плазмиды (до начала трансформации) удастся «встроить» фрагмент вовсе чуждой для нее ДНК (например ген животного происхождения), то этот фрагмент вместе с плазмидой войдет внутрь клетки реципиента, вместе с ней будет размножаться и направлять внутри бактерии синтез «псевдоплазмидных» белков, закодированных в этом гене!
Остается
решить проблему встраивания именно
избранного гена в плазмиду. А также
и получения первоначально
Но сначала несколько слов о выделении самих плазмид из клеток их нормальных бактерий-хозяев. Из бактерии можно очистить суммарную ДНК, как это было описано раньше. Потом одним из физических методов отделить низкомолекулярную ДНК плазмид от сравнительно высокомолекулярной ДНК бактериальной хромосомы. Надо только позаботиться о том, чтобы при вскрытии клетки не появились малые обломки основной ДНК. В частности, не следует пользоваться для разрушения оболочек бактерий ультразвуком.
Можно поступить
проще. Сферопласты бактерий обработать
слабой щелочью + DDC-Na или прокипятить
в течение 1 минуты. ДНК бактериальной
хромосомы, вместе со связанными с ней
белками, денатурируется и выпадает
хлопьями в осадок. Ее легко удалить
центригурированием. ДНК кольцевых
плазмид также сначала
За последние годы выделены и очищены сотни плазмид. Их описание, естественно, начинается с представления полной нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК. Современные автоматические «секвенаторы» позволяют расшифровать последовательность 4-х-5-ти тысяч пар нуклеотидов за неделю. В 80-е годы, когда секвенирование ДНК производили вручную, такая работа занимала несколько месяцев.
2.3.Встраивание фрагмента чужеродной ДНК в плазмиду
С помощью библиотеки плазмид можно без труда отыскать такую плазмиду, в ДНК которой имеется (случайно) сайт узнавания для одной из доступных рестриктаз. Для рестриктаз тоже есть своя библиотека и, как уже упоминалось, порядка 300 их видов имеется в продаже. Таким образом у исследователя имеются широкие возможности выбора наиболее удобной комбинации плаз-миды и рестриктазы.
Далее разрезают выбранной рестриктазой удобную плазмиду так, чтобы образовалось два «липких» конца. Затем нужно снабдить такими же концами фрагменты встраиваемой ДНК. Хорошо, если по обоим концам этого фрагмента расположатся сайты узнавания выбранной рестриктазы. Но это случай маловероятный. Поступают следующим образом. К собственным окончаниям имеющегося фрагмента ДНК наращивают двунитевые участки искусственных (синтезированных химически) олигонуклеотидов. Заведомо содержащих сайты узнавания выбранной рестриктазы. Затем действием этой самой рестриктазы их превращают в «липкие» концы -- в точности соответствующие липким концам плаз-миды по обе стороны сделанного в ней разреза. (Рассказать о том как наращивают концы фрагмента ДНК было бы, пожалуй, слишком сложно для нашего курса. Зато я немного позже постараюсь пояснить каким образом синтезируются искусственные олигонук-леотиды с наперед заданной последовательностью пар оснований.)
Итак, далее в буферном растворе смешивают две ДНК, -- плазмиды и вставки, -- и выдерживают их при оптимальной температуре «гибридизации». Чужеродная ДНК «встраивается» в ДНК плазмиды, хотя и может превышать ее по длине, т. е. д ос-тигать размера в несколько тысяч пар оснований. Окончательное слияние, «приживание» новой ДНК, разумеется, обеспечивают ДНК-лигазы.
Я употребил
термин «гибридизация». Что он обозначает
в данном случае? Условимся называть
так образование двухните-вой
структуры в результате контакта
двух комплементарных однонитевых
последовательностей
Может возникнуть вопрос: а почему сама разрезанная плаз-мида не восстанавливает кольцевую структуру путем гибридизации своих собственных липких концов? Ну, во-первых для сравнительно короткой ДНК плазмиды не так-то просто, распрямившись, самопроизвольно снова свернуться в кольцо. Во-вторых, встраиваемый фрагмент ДНК берется в большом избытке с тем, чтобы процесс встраивания в плазмиду имел конкурентное преимущество по отношению к процессу восстановления плазмиды. С этой же целью 5'-фосфатные группы из места разреза плазмиды убирают действием еще одного фермента -- «щелочной фосфата-зы». Поначалу достаточно, чтобы соединилась одна пара липких концов, принадлежащих плазмиде и встраиваемой ДНК. Со временем, непременно, благодаря тепловым движениям соединится и вторая пара.
И все-таки поставленный
вопрос не напрасен. Полностью избежать
«реставрации» пустых плазмид, действительно,
не удается. К счастью найден способ
различать среди колоний
3.Значение генной инженерии
Генная инженерия берет свое начало в 1973 году, когда генетики Стэнли Кохен и Герберт Бойер внедрили новый ген в бактерию кишечной палочки (E. coli).
Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. Клонированные гены человеческого инсулина были введены в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали.
Около 200 новых
диагностических препаратов уже
введены в медицинскую
3.1.Генная инженерия в сельском хозяйстве
К концу 1980-х удалось успешно внедрить новые гены в десятки видов растений и животных — создать растения табака со светящимися листьями, томаты, легко переносящие заморозки, кукурузу, устойчивую к воздействию пестицидов.
Одна из важных задач - получение
растений, устойчивых к вирусам, так
как в настоящее время не существует
других способов борьбы с вирусными
инфекциями сельскохозяйственных культур.
Введение в растительные клетки генов
белка оболочки вируса, делает растения
устойчивыми к данному вирусу.
В настоящее время получены трансгенные
растения, способные противостоять
воздействию более десятка
Еще одна задача
связана с защитой растений от
насекомых-вредителей. Применение инсектицидов
не вполне эффективно, во-первых, из-за
их токсичности, во-вторых, потому, что
дождевой водой они смываются
с растений. В генно-инженерных лабораториях
Бельгии и США были успешно
проведены работы по внедрению в
растительную клетку генов земляной
бактерии Bacillus thuringiensis, позволяющих
синтезировать инсектициды
Генные инженеры вывели трансгенные растения с удлиненным сроком созревания плодов. Такие помидоры, например, можно снимать с куста красными, не боясь, что они перезреют при транспортировке.
Список растений, к которым успешно применены методы генной инженерии, составляет около пятидесяти видов, включая яблоню, сливу, виноград, капусту, баклажаны, огурец, пшеницу, сою, рис, рожь и много других сельскохозяйственных растений.
3.2.Генная инженерия животных
Мощное развитие
животноводства за последние десятилетия
привело к появлению выдающихся
пород животных. Продуктивность молочного
скота у некоторых пород
За предшествующие 100 лет в деле улучшения растений и животных селекция сделала поразительные успехи. Сегодня во многих развитых странах получают рекордные урожаи пшеницы, риса, кукурузы. Считается, что конечный результат в растениеводстве на 50% зависит от уровня урожайности сорта, на такую же величину от совершенства технологии земледелия и возделывания растений. Столь же внушительные результаты получены и в животноводстве. В процессе селекции созданы породы крупного рогатого скота, дающие более 10 тыс. кг молока на корову за год. Естественно, что и в животноводстве, кроме породы, большую роль играет
технология содержания и кормления животных. Однако как у растений, так и у животных определяющей компонентной конечной продуктивности является биологический потенциал сортов и пород, созданный в процессе селекции. В качестве иллюстрации рассмотрим очень распространенную культуру – картофель. Сегодня создаются и возделываются

- Методы генной инженерии
- Методы географических исследований
- Методы геофизического мониторинга
- Методы государственного воздействия на общество
- Методы государственного и муниципального управления
- Методы Государственного и Муниципального Управления
- Методы государственного регулирования
- Методы выявления рисков
- Методы выявления тренда в рядах динамики
- Методы выявления фальсификации и защиты от нее
- Методы генерации текстов
- Методы генетики
- Методы генной инженерии
- Методы генной инженерии