Методы генной инженерии. 4

Методы генной инженерии 

2009 

Введение: 
 

Современный экспериментатор  нередко располагает лишь ничтожными количествами исходных препаратов индивидуального  белка или ДНК. Например, в случае биопсии ткани человека или редкого  штамма бактерии, плохо поддающейся выращиванию в объеме. 

Между тем физические методы исследования требуют, хотя и  на порядок величины меньшего количества биологического материала, чем два  десятилетия назад, но, все-таки, зачастую во много раз большего, чем имеется  в наличии. Кроме того, многие эксперименты имеют поисковый характер, когда необходимо обследовать сотни, если не тысячи, параллельных проб, варьируя условия поиска. 

Все это привело  к разработке методов многократного  и точного воспроизводства структуры  индивидуального белка или фрагмента ДНК, например отдельного гена. Ради экономии времени эти методы в значительной степени автоматизированы. Большинство из них используют подходы генной инженерии. Поэтому эта глава будет посвящена знакомству с понятиями и методами этой сравнительно новой области биологической науки. 
 
 

Некоторые приемы экспериментальной микробиологии 

Мне только что  пришлось использовать термины: «чашка с агаром», «колонии бактерий». Поскольку  специализация в области молекулярной биологии требует понимания методов и хорошего владения приемами микробиологии, следует пояснить о чем идет речь. 

Когда для лабораторных нужд наращивают значительное количество бактерий, это делают в больших  колбах, наполненных жидкой питательной  средой. Такие среды готовят и  продают в сухом виде специализирующиеся на этом фирмы. Для сохранения доступа воздуха колбы закрывают ватными тампонами (обернутыми в марлю) и стерилизуют в автоклаве. После «инокуляции» -- внесения в них малой порции бактерий колбы выдерживают в «теплой комнате», где поддерживается температура 37°С, в течение ночи. При этом их устанавливают на механической качалке ради улучшения аэрации. За ночь среда становится мутной -- такое в ней нарастает количество бактерий. Их нетрудно собрать центрифугированием. В микробиологической промышленности в огромных стальных ферментерах с принудительной аэрацией наращивают тонны (1) бактерий. Затем из них выделяют вещества, используемые в качестве пищевых добавок к корму скота или в фармакологии. 

Если же стоит  задача отобрать в лаборатории бактерии, отличающиеся определенными свойствами (например устойчивостью к действию антибиотиков) поступают прямо противоположным образом. Следят за нарастанием потомства единичных бактерий. Для этого используют особое вещество -- агар. Его выделяют из определенного вида морских водорослей. Уже смешанный с питательной средой «бакто-агар» поставляется в высушенном виде. Его растворяют в горячей воде, стерилизуют в автоклаве и разливают в стерильные «чашки Петри». Это -- круглые, плоскодонные пластмассовые чашки диаметром в 9 и высотой в 1 сантиметр с крышками. Бакто-агар застывает в виде очень пористой твердой массы, поры которой заполнены питательным бульоном. 

Исследуемую популяцию  бактерий многократно разбавляют с  таким расчетом, чтобы в 2-3-х миллилитрах суспензии, которые выливают на поверхность агара, содержалось лишь порядка сотни бактерий. Они случайным образом распределяются по поверхности агара. Далее закрытые чашки на 12--14 часов оставляют в теплой комнате. (Перевернув, для того чтобы питательный бульон притекал к поверхности агара.) Каждая бактерия дает многочисленное потомство, которое хорошо видно глазом. Это и есть «колонии» бактерий. Начальное разбавление и время инкубации выбирают так, чтобы колонии не сливались друг с другом. 

Остается добавить, что при всех описанных операциях выполняются требования строгой стерильности. Инокуляцию колб с питательной средой, разлив бакто-агара в чашки, разбавление суспензий бактерий и нанесение пробных аликвотов на агар производятся в специальном, так называемом «ламинарном» застекленном шкафу. Через который непрерывно, в направлении из шкафа в комнату прокачивается стерилизованный прохождением через фильтр возд 
 
 

Достижения генетики 

Если век 19-й  по праву вошел в историю мировой  цивилизации как Век Физики, то стремительно завершающемуся веку 20-му, в котором нам счастливилось жить, по всей вероятности, уготовано место Века Биологии, а может быть, и Века Генетики.  

Действительно, за неполных 100 лет после вторичного открытия законов Г. Менделя генетика прошла триумфальный путь от натурфилосовского понимания законов наследственности и изменчивости через экспериментальное накопление фактов формальной генетики к молекулярно-биологическому пониманию сущности гена, его структуры и функции. От теоретических построений о гене как абстрактной единице наследственности - к пониманию его материальной природы как фрагмента молекулы ДНК, кодирующего аминокислотную структуру белка, до клонирования индивидуальных генов, создания подробных генетических карт человека, животных, идентификации генов, мутации которых сопряжены с тяжелыми наследственными недугами, разработки методов биотехнологии и генной инженерии, позволяющих направленно получать организмы с заданными наследственными признаками, а также проводить направленную коррекцию мутантных генов человека, т.е. генотерапию наследственных заболеваний. Молекулярная генетика значительно углубила наши представления о сущности жизни, эволюции живой природы, структурно-функциональных механизмов регуляции индивидуального развития. Благодаря ее успехам начато решение глобальных проблем человечества, связанных с охраной его генофонда.  

Середина и  вторая половина XX столетия ознаменовались значительным уменьшением частоты  и даже полной ликвидацией ряда инфекционных заболеваний, снижением младенческой смертности, увеличением средней продолжительности жизни. В развитых странах мира центр внимания служб здравоохранения был перемещен на борьбу с хронической патологией человека, болезнями сердечно-сосудистой системы, онкологическими заболеваниями.  

Стало очевидным, что прогресс в области медицинской  науки и практики тесно связан с развитием общей и медицинской  генетики, биотехнологии. Потрясающие  достижения генетики позволили выйти  на молекулярный уровень познания генетических структур организма, и наследования, вскрыть сущность многих серьезных болезней человека, вплотную подойти к генной терапии.  

Получила развитие клиническая генетика – одно из важнейших направлений современной  медицины, приобретающих реальное профилактическое значение. Выяснилось, что множество хронических болезней человека есть проявление генетического груза, риск их развития может быть предсказан задолго до рождения ребенка на свет, и уже появились практические возможности снизить давление этого груза.  

Генетический груз включает, с одной стороны, патологические генные мутации, наследуемые от родителей и прародителей, и называемые серегационным грузом, если в виде болезни проявляются рецессивные или нелетальные доминантные мутации генов (от латинского segregatio – выщепление) .  

С другой стороны, определенную часть этого груза  составляют новые, вновь возникшие  генные мутации (в результате мутагенных влияний внешней среды) . Они не прослеживаются в восходящих поколениях и составляют так называемый мутационный  генетический груз.  

Согласно данным Н. П. Дубинина, частота спонтанных генных мутаций установлена в пределах 10-10 на геном на поколение. В геноме человека имеется около 100000 генов. Расчеты  показывают, что примерно у 10% людей  возникают новые мутации, вызванные мутагенным воздействием факторов окружающей среды (радиационный фон Земли, действие продуктов сжигания топлива, влияния вирусов) . Безусловно, частота мутаций будет значительно выше в условиях антропогенного загрязнения внешней среды. Каждый человек наследует, как минимум, 10 скрытых мутаций, опасных для здоровья. В целом по А. Кнудсону (1986) , величина постнатального генетического груза составляет 0.2 т.е. у 20% членов популяции существует вероятность развития наследственных болезней (моногенных, полигенных или связанных с мутациями генов соматических клеток) .  

Генетический  груз проявляется, как бесплодие  и спонтанные аборты, выкидыши и  мертворождения, врожденные пороки и  умственная отсталость. Он определяет риск гемолитической болезни новорожденных, проявления несовместимости матери и плода по ряду антигенов.  

Суммарная частота  моногенных наследственных болезней пока не может быть точно оценена, она  колеблется в зависимости от уровня диагностических возможностей и  различна в разных этнических группах. Отдельно взятые моногенные наследственные болезни редки, но, учитывая колоссальное число нозологических форм, можно определенно сказать, что наследственные болезни вносят существенный вклад в общую патологию человека. Кроме того, по выражению Г. Фанкони, редкие болезни редки до тех пор, пока они нам мало известны. В целом суммарная частота моногенных наследственных болезней в Европейских популяциях может достигать 10%, и не менее 10% приходится на полигенно наследуемые болезни. 
 
 
 

История генетической инженерии 
 

Генная инженерия  появилась благодаря работам  многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики.  

На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу.  

Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти  показали, что носителем наследственной информации является ДНК.  

С этого времени  начинается интенсивное изучение нуклеиновых  кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии. 

На рубеже 50-60-х  годов были выяснены свойства генетического  кода, а к концу 60-х годов его  универсальность была подтверждена экспериментально.  

Шло интенсивное  развитие молекулярной генетики, объектами которой стали кишечная палочка (E. Coli), ее вирусы и плазмиды.  

Были разработаны  методы выделения высокоочищенных  препаратов неповрежденных молекул  ДНК, плазмид и вирусов.  

ДНК вирусов  и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов.  

В 70-х годах  был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии  принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам. 

Историю развития генетической инженерии можно условно  разделить на три этапа: 

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование. 

Второй этап связан с началом работ по получению  рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности. 

Третий этап - начало работ по включению в  векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные  встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных. 

Формально датой  рождения генетической инженерии следует  считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг и С. Коэн с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli. 
 

Генетическая  инженерия 
 

Одним из разделов молекулярной генетики и молекулярной биологии, который нашел наибольшее практическое приложение, является генная инженерия. 

Генная инженерия – это сумма методов, позволяющих переносить гены из одного организма в другой, или – это технология направленного конструирования новых биологических объектов. 

Родившись в  начале 70-х годов, она добилась сегодня  больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства любого белка.  

Это дает возможность  детально анализировать структуру  и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.  

В настоящее  время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин.  

Ранее инсулин  получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его  была очень высока. Для получения 100г кристаллического инсулина требуется  800-1000кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200-250грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. 

Инсулин состоит  из двух полипептидных цепей А  и В длиной 20 и 30 аминокислот. При  соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин.  

Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается.  

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см.  

Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете  на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был  неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.  

Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных  недостатков. В 1982 году гормон роста  человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР.  

Цели и методы генетической инженерии 
 

Цель прикладной генетической инженерии заключается  в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.  

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение  высокоспецифичных ДНК-зондов, с  помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний. 

Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход «белок-ген», получивший название «обратная генетика». При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Таким способом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания. 

Если гибридную  ДНК ввести в оплодотворенное  яйцеклетку, могут быть получены трансгенные  организмы, передающие мутантный ген  потомками.  

Генетическая  трансформация животных позволяет  установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах.  

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы: 

·              специфическое расщепление ДНК  рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами; 

·              быстрое секвенирование всех нуклеотидов  очищенном фрагменте ДНК, что  позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им; 

·              конструирование рекомбинантной ДНК; 

·              гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая  выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью  и чувствительностью; 

·              клонирование ДНК: амплификация in vitro с  помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий; 

·              введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.  
 

Ферменты генетической инженерии 
 

Генетическая  инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам  генетической энзимологии и химии  нуклеиновых кислот, так как инструментами  молекулярного манипулирования  являются ферменты.  

Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. 

Только ферменты могут найти определенные последовательности нуклеотидов, «разрезать» там молекулу или, наоборот, «заштопать» дырку в цепи ДНК.  

Эти ферменты издавна  находятся в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при  делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки.  

Задача генного  инженера - подобрать фермент, который  выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.  

Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности.  

Это позволяет  генной инженерии преодолевать установленные  природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.  

Ферменты, применяемые  при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько  групп:  

·                   ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);  

·                   ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы); 

·                   ферменты, соединяющие фрагменты  ДНК (лигазы);  

·                   ферменты, позволяющие осуществить  изменение структуры концов фрагментов ДНК. 
 

Достижения генетической инженерии 
 

С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными  для человека признаками.  

Например, микроинъекция  рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией. 

Генная инженерия  открыла путь для производства продуктов  белковой природы путем введения в клетки микроорганизмов, искусственно синтезированных генов, где они могут экспрессироваться (встраиваться) в состав гибридных молекул.  

Первой удачной  попыткой такого рода стала работа К. Итакуры и Г. Бойера с соавторами (1977г.) по экспрессии в Е. coil химически синтезированного гена, кодирующего гормон млекопитающих - соматостатин.  

Ген соматостатина  был получен на основе сведений о  первичном строении этого пептидного гормона, состоящего всего из 14 аминокислот. Использованный в этой работе подход оказался весьма перспективным для получения и многих других пептидных гормонов.  

В различных  лабораториях в СССР и за рубежом  были созданы штаммы Е. coli, синтезирующие  в составе гибридных белков гормон роста человека (соматотропин), пептидные  гормоны — брадикинин и ангиотензин, нейропептид лей-энкефалин и др.  

Ген гормона  роста человека длиной 584 п.н.— наиболее длинный из искусственно синтезированных  в настоящее время. Он был встроен  в плазмиду, реплицирующуюся в  Е. coli под контролем промотора  триптофанового оперона.  

Трансформированные  полученной химерной плазмидой клетки Е. coli продуцировали при индукции промотора около 3 млн. молекул гормона  роста человека в расчете на клетку. Этот полипептид, как было установлено  в экспериментах на крысах с удаленным гипофизом, по функциям оказался полностью идентичен гормону роста человека. 

В 1976г. Гилберт  и Максам в Гарвардском университете, а также Сэнгер разработали быстрый  метод химического анализа ДНК. Появилась реальная возможность  определять последовательность до 1000 нуклеотидов в неделю силами одного исследователя.  

В 1982-1985гг. стало  возможно создать прибор для автоматического  анализа нуклеиновых кислот (а  значит и генов).  

Еще один важнейший  этап - это синтез биополимеров по установленной  структуре. Первые коммерческие приборы, производящие автоматизированный синтез полипептидов, были разработаны на основе исследований Меррифилда в 1963г. Они используются в исследовательских лабораториях и в фармацевтической промышленности. 

Метод химического  синтеза генов обеспечил также возможность получения штаммов бактерий продуцентов инсулина человека, важного лечебного препарата для больных диабетом.  

«Ген инсулина синтезировали в виде более сорока в основном шестичленных олигонуклеотидов, которые затем объединяли в единую структуру с помощью ДНК-лигазы. Полученные двухцепочечные полинуклеотиды длиной 271 и 286 пар оснований были встроены в плазмидные векторы. Туда же были встроены и регуляторные участки ДНК, обеспечивающие экспрессию гибридных молекул. Клонированные гены кодировали синтез проинсулина, который путем несложной химической обработки можно превратить в активный инсулин, включающий две полипептидные цепи А и В из 21 и 30 аминокислотных остатков, соединенных между собой сульфгидрильными связями». 

Таким способом получены и клонированы гены, кодирующие глобины человека, животных и птиц, белок хрусталика глаза быка, яичный белок, фиброин шелка, продуцируемый  тутовым шелкопрядом, и др.  

Этот же принцип  был применен для получения, клонирования и экспрессии генов интерферона человека в бактериях. Интерферон - ценный лекарственный препарат, широко используемый для борьбы с вирусными инфекциями и лечения ряда других заболеваний, включая злокачественные опухоли. Интерферон вырабатывается в клетках животных и человека, но обладает выраженной видовой специфичностью.  

Ю. А. Овчинников и В. Г. Дебабов с сотрудниками получили микроорганизмы, эффективно синтезирующие интерфероны человека. Этим исследователям удалось сконструировать  рекомбинантные плазмиды, обуславливающие синтез интерферона человека в Е. coli.  

Очищенный из клеток бактерий интерферон по своим физико-химическим и биологическим свойствам оказался близок интерферону, находящемуся в  крови доноров.  

За счет введения в векторную плазмиду сигнальных последовательностей, инициирующих синтез и РНК и белка, удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона в расчете на 1л суспензии бактерий. Это в 5000 раз больше, чем содержится в 1л крови доноров. Замена Е. coli на микробы некоторых других видов позволяет еще больше увеличить производительность такой «фабрики интерферона». 

К открытиям  связанным с достижениями генной инженерии нужно прибавить то, что огромный генетический «чертеж» многоклеточного существа просчитан  полностью.  

После восьми лет работы многих исследовательских групп удалось точно определить 97 миллионов пар нуклеотидов и их местонахождение в спирали ДНК, хранящей полную наследственную информацию микроскопического червячка Сaenorhabditis elegans длиной около миллиметра.  

Хотя это очень  маленький червь, скорее червячок, с  него без всякого преувеличения  начинается новая эра в биологии. Геном этой нематоды состоит из 97 миллионов пар нуклеотидов ДНК, округленно 0,1 миллиарда пар. Геном  человека, согласно большинству оценок, - 3 миллиарда нуклеотидных пар. Разница в 30 раз. Однако именно эта работа, о которой идет речь, окончательно убедила даже самых закоренелых скептиков, что расшифровка строения всего генома человека не только возможна, но и достижима в ближайшие годы. 

Естественно, расшифровать геном таких гигантских размеров, как у названной нематоды (97 миллионов пар нуклеотидов ДНК), невозможно без огромной подготовительной работы. Ее в основном завершили к 1989 году. Прежде всего, была построена физическая карта всего генома нематоды. Физическая карта представляет собой небольшие участки ДНК известной структуры (маркеры), расположенные на определенных расстояниях один от другого.  

И вот с 1990 года началось само секвенирование. Его  темп составлял в 1992 году 1 миллион  пар нуклеотидов в год. Если бы такой темп сохранился, на расшифровку всего генома понадобилось бы почти 100 лет! Ускорить работы удалось простейшим способом - число исследователей в каждом центре возросло примерно до 100. По мере того, как раскрывалась нуклеотидная последовательность ДНК C. elegans, пришлось расстаться с двумя заблуждениями: