Методы генной инженерии. 3

Методы генной инженерии

Введение

Современный экспериментатор нередко располагает лишь ничтожными количествами исходных препаратов индивидуального белка или ДНК. Например, в случае биопсии ткани человека или редкого штамма бактерии, плохо поддающейся выращиванию в объеме.

Между тем физические методы исследования требуют, хотя и на порядок величины меньшего количества биологического материала, чем два десятилетия назад, но, все-таки, зачастую во много раз большего, чем имеется в наличии. Кроме того, многие эксперименты имеют поисковый характер, когда необходимо обследовать сотни, если не тысячи, параллельных проб, варьируя условия поиска.

Все это привело к разработке методов многократного и точного воспроизводства структуры индивидуального белка или фрагмента ДНК, например отдельного гена. Ради экономии времени эти методы в значительной степени автоматизированы. Большинство из них используют подходы генной инженерии. Поэтому эта глава будет посвящена знакомству с понятиями и методами этой сравнительно новой области биологической науки.

Рестриктазы

В середине 70-х годов было сделано странное и не сразу понятое во всей своей значительности открытие. Из некоторых бактерий удалось выделить ферменты, обладающие способностью «разрезать» двойную спираль ДНК любого происхождения, т. е. способностью разрывать сахаро-фосфатные цепочки в обеих нитях. Условием такого разрезания оказалось наличие в этой ДНК короткой, но вполне определенной последовательности нуклеотидов (считая по одной из нитей в направлении 51—3'), так называемого «сайта узнавания» рестриктазы. Этот сайт может насчитывать от 4-х до 8 нуклеотидов. Ошибочно думать, что столь короткие последовательности должны встречаться очень часто. Даже серия из 4-х, наперед заданных нуклеотидов имеет реальный шанс появиться лишь один раз на отрезке ДНК длиной в 44 = 256 пар оснований. Для одной из наиболее часто используемых рестриктаз (EcoRl), сайт которой (ГААТТЦ) насчитывает 6 нуклеотидов, такой шанс появляется в среднем один раз на участке ДНК длиной в 46 = 4 096 пар оснований. Для некоторых рестриктаз (тип I и III) место разреза не однозначно связано с положением сайта узнавания. Такие рестриктазы неудобны для исследовательских целей. У типа II разрез локализован в самом сайте узнавания, что делает эту операцию определенной.

Два последних десятилетия поиск новых рестриктаад производился столь интенсивно, что к концу 1999 года их было найдено и очищено более 2 500. Такое изобилие обусловлено множеством видов бактерий, у которых рестриктазы служат средством защиты от вторжения в них вирусов, чью ДНК они и разрушают/ Для исследовательских целей в настоящее время используют около 300 рестриктаз, которые имеются на рынке биохимических препаратов.

Некоторые из рестриктаз разрезают обе нити ДНК в одном месте, точно ножом. У других — места разреза могут быть сдвинуты на одной нити ДНК относительно другой (в пределах сайта узнавания). В первом случае говорят о «тупых» концах разреза, во втором — о «липких» концах обеих нитей в области разреза. Название «липкие» отражает тот факт, что образующиеся в этом случае на каждой из нитей короткие однонитевые последовательности нуклеотидов, очевидно, комплементарны друг другу и могут, вообще говоря, вновь соединиться водородными связями между основаниями. Хотя это, конечно, не восстановит целостности разрезанного участка ДНК. По крайней мере до тех пор, пока уже знакомый нам фермент ДНК-лигаза не «зашьет» сделанные рестриктазой разрезы на каждой из нитей.

Могущество новообретенного инструмента для исследований было вполне оценено, когда примерно в те же годы было сделано второе важнейшее открытие — существование плазмид у бактерий.

Плазмиды

Было обнаружено, что у многих видов бактерий помимо основной массы ДНК, находящейся в «бактериальной хромосоме» (несколько миллионов пар оснований) имеются еще «крошечные» кольцевые, двунитевые и суперскрученные молекулы ДНК. Они были названы плазмидами — по месту расположения их в протоплазме клетки. Количество пар оснований в плазмидах ограничено диапазоном от 2-х до 20-ти тысяч. Некоторые бактерии имеют только по одной плазмиде. В других — их обнаруживается несколько сотен.

В норме плазмиды редуплицируются при делении бактериальной клетки одновременно с основной ДНК хромосомы. Для своего размножения они используют «хозяйские» ДНК-полимеразы I, III и другие ферменты. Плазмиды синтезируют свои специфические белки, для чего используется РНК-полимераза и рибосомы, также принадлежащие бактерии-хозяину. В числе этих «продуктов деятельности» плазмид иногда оказываются вещества, разрушающие антибиотики (ампимицин, тетрациклин, неомицин и другие). Что придает самой бактерии-хозяину устойчивость против воздействия этих антибиотиков, если она сама по себе таковой устойчивостью не обладает. Мало того. «Самостоятельность» некоторых плазмид простирается до того, что они оказываются способными размножаться в клетке бактерии даже тогда, когда синтез белка в ней (а следовательно, и ее деление) блокированы действием специфических ингибиторов. В этом случае в бактерии может накопиться до 2-3 тысяч плазмид.

Очищенные плазмиды способны проникать из питательной среды внутрь клеток чужеродных бактерий, там обосновываться и нормально размножаться. Правда, для этого приходится предварительно увеличивать проницаемость оболочек этих бактерий, обрабатывая их раствором хлористого кальция.

Успешное встраивание чужой плазмиды удается лишь для ничтожного меньшинства клеток обрабатываемой популяции. Однако если бактерия-реципиент не обладала устойчивостью к определенному антибиотику, а «прижившаяся» плазмида эту устойчивость ей сообщает, то даже из единичных успешно «трансформированных» бактерий на питательной среде с добавкой антибиотика можно вырастить вполне полноценные колонии, наследственно обладающие встроенной плазмидой.

Наконец, самое важное. Если в ДНК плазмиды (до начала трансформации) удастся «встроить» фрагмент вовсе чуждой для нее ДНК (например ген животного происхождения), то этот фрагмент вместе с плазмидой войдет внутрь клетки реципиента, вместе с ней будет размножаться и направлять внутри бактерии синтез «псевдоплазмидных» белков, закодированных в этом гене!

Вспомним теперь с какой скоростью размножаются бактерии в жидкой питательной среде, поддерживая и приумножая при этом синтез плазмидных (а также «псевдоплазмидных»!) белков. Очевидно, что здесь просматривается перспектива наработки большого количества индивидуального белка — продукта деятельности вторгнувшегося («тайком») в бактерию гена. Остается решить проблему встраивания именно избранного гена в плазми-ду. А также и получения первоначально необходимого количества этого самого гена, если отправным пунктом является известная (хотя бы частично) структура интересующего нас белка. Вот тут-то и раскроются уникальные возможности использования рестриктаз.

Но сначала несколько слов о выделении самих плазмид из клеток их нормальных бактерий-хозяев. Это — дело не сложное. Из бактерии можно очистить суммарную ДНК, как это было описано раньше. Потом одним из физических методов отделить низкомолекулярную ДНК плазмид от сравнительно высокомолекулярной ДНК бактериальной хромосомы. Надо только позаботиться о том, чтобы при вскрытии клетки не появились малые обломки основной ДНК. В частности, не следует пользоваться для разрушения оболочек бактерий ультразвуком.

Можно поступить проще. Сферопласты бактерий обработать слабой щелочью + DDC-Na или прокипятить в течение 1 минуты. ДНК бактериальной хромосомы, вместе со связанными с ней белками, денатурируется и выпадает хлопьями в осадок. Ее легко удалить центригурированием. ДНК кольцевых плазмид также сначала денатурируется. Но поскольку ее однонитевые кольца топологически связаны, они разойтись не могут. После восстановления нормальных условий среды ренатурируется и нативная структура плазмид. Они остаются в растворе.

За последние годы выделены и очищены сотни плазмид. Их описание, естественно, начинается с представления полной нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК. Современ-ные автоматические «секвенаторы» позволяют расшифровать последовательность 4-х-5-ти тысяч пар нуклеотидов за неделю. В 80-е годы, когда секвенирование ДНК производили вручную, такая работа занимала несколько месяцев.

Подробные данные о каждой новой плазмиде, включая и карту расположения ее собственных генов, заносят в международную «библиотеку плазмид».

Встраивание фрагмента чужеродной ДНК в плазмиду

С помощью библиотеки плазмид можно без труда отыскать такую плазмиду, в ДНК которой имеется (случайно) сайт узнавания для одной из доступных рестриктаз. Для рестриктаз тоже есть своя библиотека и, как уже упоминалось, порядка 300 их видов имеется в продаже. Таким образом у исследователя имеются широкие возможности выбора наиболее удобной комбинации плазмиды и рестриктазы.

Далее разрезают выбранной рестриктазой удобную плазмиду так, чтобы образовалось два «липких» конца. Затем нужно снабдить такими же концами фрагменты встраиваемой ДНК. Хорошо, если по обоим концам этого фрагмента расположатся сайты узнавания выбранной рестриктазы. Но это случай маловероятный. Поступают следующим образом. К собственным окончаниям имеющегося фрагмента ДНК наращивают двунитевые участки искусственных (синтезированных химически) олигонуклеотидов. Заведомо содержащих сайты узнавания выбранной рестриктазы. Затем действием этой самой рестриктазы их превращают в «липкие» концы — в точности соответствующие липким концам плазмиды по обе стороны сделанного в ней разреза. (Рассказать о том как наращивают концы фрагмента ДНК было бы, пожалуй, слишком сложно для нашего курса. Зато я немного позже постараюсь пояснить каким образом синтезируются искусственные олигонук-леотиды с наперед заданной последовательностью пар оснований.)

Итак, далее в буферном растворе смешивают две ДНК, — плазмиды и вставки, — и выдерживают их при оптимальной температуре «гибридизации». Чужеродная ДНК «встраивается» в ДНК плазмиды, хотя и может превышать ее по длине, т. е. достигать размера в несколько тысяч пар оснований. Окончательное слияние, «приживание» новой ДНК, разумеется, обеспечивают ДНК-лигазы.

Я употребил термин «гибридизация». Что он обозначает в данном случае? Условимся называть так образование двухнитевой структуры в результате контакта двух комплементарных однонитевых последовательностей нуклеотидов, типа ДНК-ДНК или ДНК-РНК. Термин «комплементарные» нам уже знаком. Последовательности могут быть одинаковой длины, тогда образуется сплошь двухнитевой «гибрид». А могут быть и существенно различными по длине. В этом случае образуется «участок гибридизации», соответствующий длине более короткого из двух партнеров. Минимальная длина участка гибридизации, при которой он достаточно устойчив, — это 8-10 пар нуклеотидов. Впрочем, для устойчивой гибридизации комплементарных липких концов двух молекул ДНК эту цифру можно уменьшить вдвое, так как двунитевые структуры самих ДНК будут поддерживать новообразованный короткий участок гибридизации.

Может возникнуть вопрос: а почему сама разрезанная плаз-мида не восстанавливает кольцевую структуру путем гибридизации своих собственных липких концов? Ну, во-первых для сравнительно короткой ДНК плазмиды не так-то просто, распрямившись, самопроизвольно снова свернуться в кольцо. Во-вторых, встраиваемый фрагмент ДНК берется в большом избытке с тем, чтобы процесс встраивания в плазмиду имел конкурентное преимущество по отношению к процессу восстановления плазмиды. С этой же целью 5'-фосфатные группы из места разреза плазмиды убирают действием еще одного фермента — «щелочной фосфата-зы». Поначалу достаточно, чтобы соединилась одна пара липких концов, принадлежащих плазмиде и встраиваемой ДНК. Со временем, непременно, благодаря тепловым движениям соединится и вторая пара.

И все-таки поставленный вопрос не напрасен. Полностью избежать «реставрации» пустых плазмид, действительно, не удается. К счастью найден способ различать среди колоний бактерий, выросших на среде с антибиотиком, те, которые приютили « пустую « плазмиду от тех, что получили плазмиды со встроенным фрагментом чужой ДНК. Способ этот очень красив. Идея его такова. Некоторая модификация самой плазмиды позволяет ей в «сотрудничестве» с основным геномом бактерии E.coli в присутствии некоего хромогенного субстрата (похожего на лактозу) синтезировать продукт голубого цвета. В результате на чашке с агаром вырастают голубые колонии бактерий. Вставку же чужеродного фрагмента ДНК производят б таком месте, что плазмида утрачивает способность к «сотрудничеству». В результате чего вырастают колонии белого цвета. Их-то и отбирают, чтобы уже в большом объеме жидкой питательной среды наращивать бактериальную массу с плазмидами и чужеродной ДНК. Таким образом решается задача умножения количества («клонирования») интересующей нас ДНК.

Замечу попутно, что описанным выше способом в плазмиду можно вставить так называемый «поликлоновый сайт». Это — синтезированная химически последовательность в несколько десятков пар нуклеотидов, подобранная таким образом, что в ней содержатся сайты узнавания доброй дюжины различных рестрик-таз. Это существенно расширяет возможности эксперимента.

Некоторые приемы экспериментальной микробиологии

Мне только что пришлось использовать термины: «чашка с агаром», «колонии бактерий». Поскольку специализация в области молекулярной биологии требует понимания методов и хорошего владения приемами микробиологии, следует пояснить о чем идет речь.

Когда для лабораторных нужд наращивают значительное количество бактерий, это делают в больших колбах, наполненных жидкой питательной средой. Такие среды готовят и продают в сухом виде специализирующиеся на этом фирмы. Для сохранения доступа воздуха колбы закрывают ватными тампонами (обернутыми в марлю) и стерилизуют в автоклаве. После «инокуляции» — внесения в них малой порции бактерий колбы выдерживают в «теплой комнате», где поддерживается температура 37°С, в течение ночи. При этом их устанавливают на механической качалке ради улучшения аэрации. За ночь среда становится мутной — такое в ней нарастает количество бактерий. Их нетрудно собрать центрифугированием. В микробиологической промышленности в огромных стальных ферментерах с принудительной аэрацией наращивают тонны (1) бактерий. Затем из них выделяют вещества, используемые в качестве пищевых добавок к корму скота или в фармакологии.

Если же стоит задача отобрать в лаборатории бактерии, отличающиеся определенными свойствами (например, устойчивостью к действию антибиотиков) поступают прямо противоположным образом. Следят за нарастанием потомства единичных бактерий. Для этого используют особое вещество — агар. Его выделяют из определенного вида морских водорослей. Уже смешанный с питательной средой «бакто-агар» поставляется в высушенном виде. Его растворяют в горячей воде, стерилизуют в автоклаве и разливают в стерильные «чашки Петри». Это — круглые, плоскодонные пластмассовые чашки диаметром в 9 и высотой в 1 сантиметр с крышками. Бактоагар застывает в виде очень пористой твердой массы, поры которой заполнены питательным бульоном.

Исследуемую популяцию бактерий многократно разбавляют с таким расчетом, чтобы в 2-3-х миллилитрах суспензии, которые выливают на поверхность агара, содержалось лишь порядка сотни бактерий. Они случайным образом распределяются по поверхности агара. Далее закрытые чашки на 12—14 часов оставляют в теплой комнате. (Перевернув, для того чтобы питательный бульон притекал к поверхности агара.) Каждая бактерия дает многочисленное потомство, которое хорошо видно глазом. Это и есть «колонии» бактерий. Начальное разбавление и время инкубации выбирают так, чтобы колонии не сливались друг с другом.

Остается добавить, что при всех описанных операциях выполняются требования строгой стерильности. Инокуляцию колб с питательной средой, разлив бакто-агара в чашки, разбавление суспензий бактерий и нанесение пробных аликвотов на агар производятся в специальном, так называемом «ламинарном» застекленном шкафу. Через который непрерывно, в направлении из шкафа в комнату прокачивается стерилизованный прохождением через фильтр воздух.

Литература

1 Довгяло О.П., Федоренко Н.М. Ишемическая болезнь сердца. - М.: Медицина, -1986.

2 Долгов В.В. Морфо-функциональная характеристика эндотелия сосудистой стенки в норме и при атеросклерозе. Автореф. Док. дис. - М. -1985.

3 Долгушин И.И., Зурочка А.В., Чукичев А.В., Колесников А.Л. Роль нейтрофилов в регуляции иммунной реактивности и репаративных реакций повреждения ткани. // Вестник Росс. Акад. мед.наук.-2000. N 2. -C.-14-19.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение.        2

ГЛАВА 1. Теоретические предпосылки формирования генной инженерии как науки.        3

1.1. Открытие двойной структуры  ДНК и матричного синтеза.        3

1.2.РЕСТРИКТАЦИОННЫЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ.        5

1.3.ПРИНЦИПЫ ТЕХНОЛОГИЙ  РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК.        5

1.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ  ГЕНОВ.        8

1.5. ГИБРИДИЗАЦИЯ  НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.        9

1.6. СОРТИРОВКА ХРОМОСОМ.        10

1.7. СЕКВЕНИРОВАНИЕ  ДНК.        11

1.8.ДИНАМИЧНОСТЬ  ГЕНОМА.        12

ГЛАВА 2. ВОЗМОЖНОСТИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.        14

2.1. ЧТО  БУДЕТ  СДЕЛАННО  ПОСЛЕ  ЗАВЕРШЕНИЯ  АНАЛИЗА ГЕНОМА  ЧЕЛОВЕКА.        18

Глава 3. Области практического применения генной инженерии.        20

3.1. Создание трансгенных  растений.        20

3.2. ГЕННЫЕ ВАКЦИНЫ        22

3.2.1. Актуальность разработки  новых вакцин        22

3.2.2.Разработка ДНК-вакцин         24

3.2.3. Повышение эффективности  и безопасности иммунизации        26

3.2.4. Упрощение разработки  и производства новых вакцин        27

3.2.5. Упрощение требований  к условиям хранения        29

3.2.6. Вопросы безопасности  применения        29

3.2.7. Участие фармацевтических  компаний в разработке ДНК-вакцин         30

3.3. Генотерапия        31

Глава 4. Перспективы клонирования животных        34

Введение.

Генная инженерия -  направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК ; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.

ГЛАВА 1. Теоретические предпосылки формирования генной инженерии как науки.

1.1. Открытие двойной  структуры ДНК и матричного  синтеза.

Начальные работы американских учёных Уотсона и Крика были произведены в 1953 году. Они дали возможность развиваться генной инженерии в качестве самостоятельного раздела науки. Эти открытия заключены в следующем:

Была открыта двойная структура ДНК и постулирован её матричный синтез. Двойная спираль ДНК при репликации разделится и вдоль нити ДНК, специальные ферменты-полимеры, собирают точные копии материнской ДНК, таким образом в клетке перед делением две совершенно одинаковые молекулы ДНК, одна из которых после деления клетки попадает в дочернюю клетку. Таким образом дочерняя клетка несет ту же самую информацию, что и материнская, следовательно выполняет те же самые функции. Итак, в клетках живого организма возможен особый тип реакции – матричный синтез. Одна молекула – матрица, а вторая строится по её программе. репликация ДНК синтез всех видов РНК и сборка молекул белка, в соответствии со структурой и-РНК – это все варианты матричного синтеза, который происходит всегда при участии нуклеиновых кислот.

По тому же самому механизму осуществляется сборка РНК, только не двух спиралей, а одной. Этот процесс получил название – транскрипция. Поток информации в клетке обеспечивает реакции матричного синтеза: репликация ДНК(необходима для передачи наследственной информации дочерним клеткам), транскрипция(синтез и-РНК в ядре клетки) и трансляция(сборка белковой цепи на и-РНК при помощи рибосомы).

  Казалось бы, что на  рубеже 70-х годов молекулярная  биология достигла определённой  степени завершенности: были установлены  структура и механизм репликации  ДНК, провозглашена «центральная  догма» экспрессии гена (транскрипция  и трансляция), выявлены основные  аспекты регуляции активности  гена. В этот период главным  объектом молекулярно-генетических  исследований были микроорганизмы. Переход к эукариотам(включая  человека) встретился с дополнительными  проблемами и трудностями, и кроме  того, существовавшие в то время  методы не позволяли рассчитывать  на получение принципиально новых  результатов. Стремительный порыв  в развитии молекулярной генетики  в начале 70-х годов стал благодаря  появлению нового экспериментального  инструмента – рестриктационных  эндонуклеаз. Был открыт путь  для широкомасштабного получения  генных продуктов(физически значимых  белков) и для генетического манипулирования  с различными организмами. Наши  знания о структуре генетического  материала и эукариот, в разных  областях таких: как действие  гена, популяционная генетика, эволюция  и генетическая консультация, включая  пренатальную диагностику. Достигнутые  успехи заставили ученых задуматься  об этической стороне манипулирования  с человеческим зародышем, об  возникновения возбудителей различных  болезней в процессе генно-инженерных  исследований. Многие из этих  вопросов были подняты самими  учеными активно работающих в  данной области. В настоящее время  большинство исследователей считали, что опасения касающиеся, генной  инженерии, не имеют достаточно оснований, но многие этические проблемы остаются нерешенными и продолжают возникать новые.

В прошлом генетика и медицинская генетика развивалась как относительно независимые отрасли науки, теперь многие из их разделов оказались вовлечённые в общее русло молекулярно-генетических исследований, и провести между ними грань – трудно.

Сейчас, множество ученых заняты различными работами связанные с проблемами генной инженерии – это и методы, основанные на использовании рестриктационных ферментов, анализ гена человека, методы гибридизации нуклеиновых кислот, секвенирование ДНК, сортировки хромосом при помощи цитофиурометрииии и многое, многое другое. Попытаюсь дать необходимые разъяснения по важнейшим работам из этого ряда.а

Начнём с условий, которым должен соответствовать ген человека, что бы получить полную характеристику его структуры:

1) соответствующие фрагменты  ДНК должны быть идентифицированы  однозначно.

2) они должны быть выделены  и накоплены в количестве, должностном  для биохимического анализа.

3)  должна быть определена вся нуклеотидная последовательность.

Принципы, на которых основаны эти три метода, кратко будут описаны ниже. Мы начнем с описания второго, поскольку прогресс в выделении и клонировании генов был решающим для развития новой генетики.  

1.2.РЕСТРИКТАЦИОННЫЕ  ЭНДОНУКЛЕАЗЫ.

              _ґ_ьї0’чїяяяяёПb_\Jчї_____

различные штаммы E-coli, Арбер обнаружил, что ДНК этого фага при переходе через бактерию разрезается и теряет свою инфекционность. Оказалось, что ни классические рекомбинационные процессы, ни мутации в этом не участвуют. Более того, такая судьба постигала не только фаговую, но и любую чужеродную ДНК, попадающую в бактерию. Такое разрезание(рестрикцию) следует рассматривать как защитный механизм клетки. Как было показано в дальнейшем, рестриктация чужеродной ДНК осуществляется ферментами, называемыми рестриктационными эндонуклеазами(рестриктазами). Встаёт вопрос, почему рестриктазы не разрезают ДНК собственной клетки? Ответ был найден Арбером и состоял в следующем: эти ферменты вступают в реакцию с определенными участками в ДНК, так называемыми сайтами узнавания, которые в клетке защищены метильными группами(метилированы). Правда, первые из открытых эндонуклеаз не были специфическими, а действовали случайным образом. Первой рестриктазой, которая расщепляла ДНК, в стого определенном месте, была Hind, открытая Смитом в конце 60-х годов. Этот фермент впервые использован Натсоном и соавторами для создания рестриктационнй карты генома вируса  SO40. Берг уловил особое свойство двухцепочной ДНК формировать при обработке рестриктазами так называемые «липкие концы».После разрезания одна из цепей оказывается длиннее, чем другая, на несколько нуклеотидов.Эти нуклеотиды могут свободно спариваться с другими, например с комплиментарными нуклеотидами другого фрагмента ДНК с «липкими концами». Благодаря этому, ДНК из различных источников может объединяться, образуя рекомбинантные молекулы.

1.3.ПРИНЦИПЫ ТЕХНОЛОГИЙ  РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК.

Было выделено много рестриктаз(более 150),расщепляющих ДНК в специфических сайтах. Например эндонуклеаза R1 регистрирует двухцепочную ДНК по двум сайтам таким образом, что образуются два липких конца:

         ↓

      G-A-A-T-T-C

      |||  ||  ||  ||  ||   |||

      C-T-T-A-A-G

                         ↑  

Липкие концы различных молекул ДНК, расщеплённых этим ферментом, могут вступать по четырём –A-T-парам. Рестриктационные эндонуклеазы различаются по тем сайтам   ДНК, которые они распознают и разрезают. Их можно использовать для различных целей. Однако наиболее распространенным этапом является их применение для амплификации специфической определения нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, необходимо для ДНК или  для изучения механизмов экспрессии генов. Последняя проблема наиболее важна в практическом аспекте: гены контролирующие образование функционально активных белков, теперьможно вводить в бактерии и размножать(амплифицировать).эта процедура называется клонированием генов. Благодаря ей, появилась возможность вырабатывать в больших количествах белки, которые раньше удавалось получить ничтожно мало. Эта технология основана на следующем принцепе: помимо своей собственной кольцевой хромосомы, бактерии часто содержат дополнительные маленькие кольцевидные молекулы двух цепочной ДНК,называемые плазмидами.

Плазмиды реплицируются автономо и сами могут содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез веществ, например: колицинов, убивающих другие бактерии(см. рис.1).

Плазмидную ДНК можно выделить и ращепить подходящей рестриктазой только в одном сайте, превратив кольцевую молекулу в линейную с липкими концами.

Фрагменты любой чужеродной ДНК с такими же липкими концами(полученными

после разрезания аналогичной рестриктазой) можно сшить с плазмидой ДНК с помощью лигазы.

Рис. 1.

Клетка E-coli с хромосомой и плазмидой.

Рекомбинантную конструкцию вводят затем в бактерию, где она реплицируется (см. рис.2 )

Рис. 2. Принцип введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с использованием эндонуклеазы.

Источник экзогенной ДНК не имеет значения. ДНК может быть получена, например, из клеток человека, но можно сшивать и искуственно синтизированные гены. Кроме бактериальных плазмид в качестве векторов (носителей) ДНК используют фаги λ (объект исследования Альберта). Часть генома этого фага не обязательна для его размножения в бактерии. Вместо него можно ввести чужеродную ДНК, которая будет размножаться вместе с фаговой, после инфицирования бактерий.

Добиться  репликации и амплификации в составе плазмидной (или фаговой) ДНК после трансформации бактериальной клетки ещё не значит решить все её проблемы. Прежде всего возникают два вопроса:

1. Как распознавать клоны, содержащие гибридную ДНК, среди потомства трансформированных клеток или живых бактериофагов ?

2. как идентифицировать необходимые фрагменты ДНК среди многих клонированных неизвестных фрагментов?

Например можно отбирать бактериальные клетки, если они несут плазмиду с фактором устойчивости к антибиотику, выращивая их на среде, на среде, содержащей антибиотик. Нетрансформированные клетки без плазмид(и, следовательно, без гена устойчивости к антибиотику) просто не будут расти на такой среде. В последнее время разработано много специальных методов вакцинации, которые позволяют отбирать только рекомбинантные клетки.

Для генной инженерии белков недостаточно отобрать и размножить определённые фрагменты ДНК, необходимо ещё индуцировать их экспрессию в клетке. Для этого необходимо «подключить» рекомбинантную молекулу ДНК , последующую трансляцию матричной РНК и процессинг как на транскрипционном , так и на трансляционных уровнях.    

1.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ  И АНАЛИЗ ГЕНОВ.

Ещё одна область применения рестриктаз – идентификация и определение числа генов. Эти задачи решаются с помощью метода разработанного Саузерном.