Микробиология. 3

Қазақстан Республикасының Денсаулық сақтау министрлігі 
Семей Мемлекеттік Медицина Университеті 
Микробиология кафедрасы 

Тақырыбы: Молекулярлы биологиялық әдістер: НҚ гибридизациясы, ТПР тізбекті полимеразды реакция, ДНК зондтары. Қолданбалы иммунология. 
 

                                           Орындаған: Қонжанова А.А.

                                                               220-топ, ЖМФ

                                           Тексерген: Абишова М.Т. 

Семей, 2011 жыл 

СӨЖ

Жоспар 

   1. Кіріспе

   2. Негізгі бөлім

        2.1 Тізбекті полимеразды реакция

        2.2 НҚ гибридизациясы, ДНҚ зондтары

        2.3 Қолданбалы иммунология

  3. Қорытынды

  4. Пайдаланылған әдебиеттер тізімі

                       Кіріспе 

• Қазіргі таңда  медицинада әр-түрлі патогенді  микроорганизмдер тудырушы аурулар  кеңінен тараған.Мұндай вирустық  инфекциялардың алдын алу және  емдеу үшін ең алдымен анықтау  қажет.Міне, осы мақсатта бірнеше  әдістер қолданылады.Молекулярлы  биологиядағы мұндай әдістер  қатарына тізбекті полимеразды  реакция және НҚ гибридизациясы  сияқты әдістер жатады.

   
Негізгі бөлім 
Тізбекті полимеразды реакция (ТПР) 

• Тізбекті полимеразды реакция – молекулярлы биологиядағы экспериментальды әдістердің бірі.ТПР әдісінің негізінде бірнеше сағат ішінде бір ДНК немесе РНК молекуласының фрагментінен 100 млрд-тай ұқсас молекулалар алу мүмкіндігі жатыр.Осылайша өте кіші көлемде болатын генетикалық материалды зерттеу мүмкіндігі туады.

• ТПР зерттеу затынан (су, азық-түлік, науқастан алынған зерттеу заты) таза дақыл бөліп алмай, ондағы микроб ДНК-сын табу арқылы микробты анықтауға мүмкіндік береді. Көбейтілетін ДНК препараты таза күйінде немесе  әр-түрлі биологиялық заттардың қосындысы күйінде болуы мүмкін. Зерттеу материалы ретінде  адам шашы, адам қанының жұғындысы және басқа да заттар қолданылады.

                       Ашылу тарихы 

•  ТПР 1983 жылы америкалық биохимик Кэри Муллис анықтады.Ол бұл жаңалықты ерекше жағдайда Калифорния таулары арқылы автомобиль саяхатында анықтаған екен.Оның негізгі мақсаты ДНК-полимераза ферментінің көмегімен ДНК-ны амплифицирлеуші әдісті табу болды.Ең алғаш ТПР әдісі жөнінде 1985 жылы қараша айында Science журналында жарияланды. 8 жыл өткен соң атаулы еңбегі үшін Кэри Муллисқа Нобель сыйлығы берілген еді.

            Кэри Муллис

         ТПР жүргізу кезеңдері 

• Бұл рекцияны  жүргізу үшін зерттеу затынан  берілген микроб геніне спецификалы  болып келетін ДНК-сын бөліп  алады.Генді табу жинақтау арқылы  іске асырылады.Ол үшін бастапқы  геннің ДНК-сының 3-ұшына комплементарлы  праймерлер болуы қажет.Геннің  жинақталуы яғни амплификациясы  келесі кезеңдерді қамтиды:

• Денатурация сатысы.

    Бұл кезеңде зерттеу затынан бөлініп алынған ДНК-ны 94-96С-та 0.5-2 мин жылытады. Жылыту барысында ДНК жіпшелерінің арасындағы сутектік байланыстың үзілуіне байланысты ДНК 2 жіпшеге ажырайды.

    Отжиг сатысы.

     Праймерлерді қосады.ДНК мен праймер қоспасын суытады.Бұл кезеңнің ұзақтығы 0.5-2 минут. Осы кезде іздеп отырған ген ДНК-лы қоспада бар болса праймерлер оның комплементарлы бөлімдерімен байланысады.

Амплификатор 

      Элонгация сатысы.

      Бұл сатыда ДНК мен праймер қоспасына ДНК-полимераза мен нуклеотидтерді қосады. ДНК-полимеразаның іске қосылуына оптимальды температура қажет. Міне осындай жағдайларда ДНК генімен праймерлер комплементарлы болса, нуклетидтер праймердің 3-ұшына қосылып, нәтижесінде геннің көшірмесі синтезделеді. Бұл саты 7-10 мин созылады.Бұдан кейін цикл қайталанады, осы кезде геннің ДНК-ның саны әр жолы екі есеге көбейіп отырады.Реакция арнайы құрал – амплификаторларда жүргізіледі. 
 

Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94—96 °C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C

ТПР әдісінің  артықшылықтары: 

• Жоғары сезімталдығы мен спецификалығы
• Әр-түрлі клиникалық материалдарды қолдана алу мүмкіндігі.
• Біруақытта бір биологиялық сынамада бірнеше микроорганизмдерді бөліп алу мүмкіндігі.Бұл бактериологиялық әдістен бір артықшылығы болып табылады, себебі бактериологиялық әдісте әр қоздырғышқа әр-түрлі дақылдандыру әдісі қолданылады.

• Науқастан алынған зерттеу материалын лабораторияға жеткізуде сақтау және жеткізу тәсілдерінің қарапайымдылығы. Бактериологиялық және вирусологиялық әдістермен салыстырғанда қоздырғышты тірі күйінде сақтауды, жеткізуді талап етпейді.

• Зерттеу жүргізу  және зерттеу нәтижелерін алу  уақытының аздығы: нәтиже алу  уақыты кейбір микроорганизмдер  үшін 24 сағаттан да аз болып  келеді.
• Кейбір микроорганизмдер үшін мысалы Mycoplasma genitalium анықтаудың жалғыз әдісі.

• Бірақ осындай артықшылықтарына қарамастан ТПР  инфекциялық қоздырғыштарды бөліп алуда барлық микроорганизмдерге қолданыла бермейді. Мысалы стафилококк, стрептококк сияқты қоздырғыштарды анықтау үшін  микробиолгиялық әдісті қолданған ыңғайлы,ал бруцеллез, бореллиоз, токсоплазмоз, қызылша ауруларының қоздырғыштарын диагностикалауда иммунологиялық әдісті қолданған дұрыс.

ТПР-ның қолданылу салалары 

• Криминалистикада – қылмыс болған жерден генетикалық материал алынады, яғни қан, сілекей, шаш және тағы басқа заттар. Содан кейін оны күдікті адамның генетикалық материалымен салыстырады.Өте кіші көлемде ДНК материалы болса да жетеді.ДНК-ны фрагменттерге бөледі, ТПР көмегімен амплификациялайды.Фрагменттерге ДНК электрофорез көмегімен бөледі.

• Әкелікті анықтауда –ТПР көмегімен туыстық байланысты анықтайды. Яғни бала анасы мен әкесінен кейбір белгілерді ала отырып, жаңа белгілер пайда болады.

Рис. 3: Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. (1) Отец. (2) Ребенок. (3) Мать. Ребенок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.

    Медициналық диагностикалау 

• ТПР көптеген тұқымқуалаушы және вирустық ауруларды анықтау мен емдеу және алдын-алу мақсатында медицинада қолданылады. Вирусты инфекцияларды ауру белгілері байқалмай тұрып, зақымдала салысымен анықтауға болады.
• Сондай-ақ кейбір дәрілік заттар науқастарда аллергиялық немесе токсикалық әсер көрсетуі мүмкін. Мұндай жағдайда дәрі қабылдамай тұрып ТПР- анализ көмегімен дәрілердің әсерін анықтауға болады.Сонымен қатар мысалы цитохромдар емдеу кезінде кейбір науқастарға беслсенді түрде әсер етеді де, басқа науқастарға әсер етпейді.Бұл жағдайда да ТПР-анализ арқылы әсерді анықтайды.

Әр-түрлі ауру туғызушы микроорганизмдерді   
анықтау 

• Бактериялар

       Сифилис қоздырғышы (Treponema pallidum) 
Гонорея қоздырғышы (Neisseria gоnorrhoeae) 
Хламидия (Chlamydia trachomatis) 
Микоплазмалар (Mycoplasma genitallium, Mycoplasma hominis) 
Уреаплазма (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum)

•  Вирустар

      ВИЧ (HIV) 
Герпес (HSV2) 
Папилломавирус (HPV)  

• Қарапайымдылар

     Трихомонада (Trichomonas vaginalis)  

•  Саңырауқұлақтар

     Кандидоз қоздырғышы (Candida spp.)  
 

              Генды клондау. 

• Генді клондау  – генинженерияда геннің көшірмелерін  алуда қолданылады.Ең алдымен  ДНК материалы алынады да ТПР  жүргізіледі.Көп мөлшерде геннің  көшірмелері алынады.Одан кейін  генді плазмидаға енгізеді. Гені  бар плазмиданы ағзаға енгізеді.Геннің  көптеген көшірмелері алынады.

                           Генді клондау 

Рис. 4: Клонирование гена с использованием плазмиды. 
(1) Хромосомная ДНК организма A. (2) ПЦР. (3) Множество копий гена организма А. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида с геном организма А. (6) Введение плазмиды в организм В. (7) Умножение количества копий гена организма А в организме В.