Микробиология. 4

       Введение

       Из  всех продуктов, получаемых с помощью  микробных процессов, наибольшее значение имеют вторичные метаболиты. Если вопрос о физиологической роли вторичных  метаболитов в клетках-продуцентах  был предметом серьезных дискуссий, то их промышленное получение представляет несомненный интерес, так как  эти метаболиты являются биологически активными веществами: одни из них  обладают антимикробной активностью, другие являются специфическими ингибиторами ферментов, третьи– ростовыми факторами, многие обладают фармакологической активностью. К вторичным метаболитам относятся антибиотики, алкалоиды и токсины. Фармацевтическая промышленность разработала сверхсложные методы скрининга (массовой проверки) микроорганизмов на способность продуцировать ценные вторичные метаболиты.

       Термины "вторичные метаболиты" и "вторичный  метаболизм" вошли в лексику  биологов в конце XIX века с легкой руки профессора Косселя. В 1891 году в  Берлине он прочитал не собрании Физиологического общества лекцию, которая называлась «О химическом составе клеток»; происхождение названия «вторичные метаболиты» – значит второстепенные, «случайные».

       Целью данной работы является изучение способов синтеза, химической структуры, свойств и роли вторичных метаболитов в жизни человека.

       Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучение процессов, происходящих при синтезе вторичных метаболитов.
2. Анализ химической структуры вторичных метаболитов.
3. Оценка роли вторичных метаболитов в жизни их продуцентов, человека и высших животных.

     1.Вторичные метаболиты микроорганизмов. Общие сведения.

       Вторичные метаболиты (идиолиты) – это вещества микробного (или растительного) происхождения, не существенные для роста и репродукции  образующего их организма. Каждый вторичный  метаболит производится относительно ограниченным числом видов. Эти соединения синтезируются в конце экспоненциальной или в течение стационарной фаз  роста, и их формирование в значительной степени зависит от условий роста, особенно состава питательной среды[8].

       Многие  вторичные метаболиты имеют химическую структуру, необычную для биологической  материи. Эти соединения относятся  к разнообразным классам органических веществ, – аминоциклитолы, кумарины, эпоксиды, пирролы, нерибосомальные пептиды, полиены, терпеноиды, тетрациклины, поликетиды, изопреноиды, стероиды, гиббереллины, фитоалексины и т.д. В отличие от синтеза первичного метаболита, который происходит одновременно с ростом и размножением культуры, для продуцента вторичных метаболитов принято говорить о трофофазе (когда культура растет и размножается) и идиофазе (когда рост замедляется или останавливается и начинается синтез продукта). О механизмах переключения путей метаболизма с первичного на вторичный и о физиологической роли вторичных метаболитов в жизни собственного продуцента достоверно известно очень мало. Известны четыре класса биосинтетических реакций, «уводящих» интермедиат (от латинского intermedius – средний – промежуточное вещество с коротким временем жизни, образующееся в ходе химической реакции и затем реагирующие далее до продуктов реакции) на путь вторичного метаболизма:

1. преобразование первичного метаболита в специфический предшественник для вторичного метаболизма;
2. реакции модификации или активации, уводящие предшественник на путь вторичного метаболизма;
3. полимеризация и конденсация;
4. поздние реакции модификации.

Рис.1.Связь  вторичного и первичного метаболизма (ВМ - вторичный метаболит) 

       К вторичным метаболитам причисляют антибиотики, токсины, иммунодепрессанты  и стимуляторы, а также некоторые  запасные вещества (поли-β-алканоаты). Неизвестно, насколько распространен вторичный метаболизм в природе. Само понятие «вторичный метаболит» достаточно расплывчатое и многие исследователи его не признают[3]. 

       2.Образование вторичных метаболитов

       С биотехнологической точки зрения важными  являются понятия о вторичных  метаболитах или о реакциях вторичного обмена, которые сходны у всех живых организмов. К  реакциям вторичного обмена относятся те, которые сопровождаются образованием алкалоидов, антибиотиков, триспоровых кислот  гиббереллинов и некоторых других веществ, расцениваемых несущественными для продуцента. Вторичные метаболиты представляют собой продукты реакций, катализируемых ферментами.

       Рисунок 2. Схема образования вторичных  метаболитов.

       Преметаболиты в схеме представляют собой простые  питательные вещества, поступающие  извне (аммоний, ионы металлов, углекислота, сульфаты, фосфаты, нитраты для гетеротрофов — моносахариды и некоторые другие).

       К интермедиатам или прометаболитам относятся простые сахара, аминокислоты, нуклеиновые основания.  Информационные молекулы ДНК и РНК вычленены  из состава других реакций, хотя синтез и распад (прерывистые стрелки)  также катализируются ферментами. В  отличие от первичных метаболитов  образование вторичных метаболитов  непосредственно не кодируется ядерной  или цитоплазматической ДНК.  Согласно такому представлению все живые  организмы синтезируют присущие им вторичные метаболиты[10,1].

       На  основании положений, сформулированных В.Н. Шапошниковым(1939), каждый продуцент  в своем развитие проходит две фазы, названные Ж.Д. Бу’Локком трофофазой и идиофазой (от греч. trofe-питание, idios-свой, специфический). В период трофофазы активно протекают конструктивный и энергетический обмен — в клетках преобладают синтетические процессы, нарастает количество первичных метаболитов-липидов, гликонов, гликоконъюгатов; скорость роста и размножения организма при этом высокая, а продуктивность экзогенных вторичных метаболитов низкая, и , напротив, в идиофазу скорость роста и размножения низкая, а продукция экзогенных и эндогенных вторичных метаболитов высокая. Продуктивность культуры может быть повышена за счет внесения предшественников метаболитов (преимущественно в период времени, приходящийся на конец идиофазы).

       Рис. 3.Соотношение биомассы  клеток (а), первичных метаболитов(б) и вторичных  метаболитов (в)  в культурах Saccharomyces cerevisiae(Пекарские дрожжи )(1), Penicillium chrysogenum(2), Nicotiana tabacum(3), кератоцитов(клетки соединительной ткани роговой оболочки глаза.)(4); М-масса высушенных клеток, М*-число животных клеток, t-время в сутках, I-трофофаза (заштрихованная часть), II-идиофаза.

       Из  рисунка 3 видно, что продолжительность  трофофазы более короткая у дрожжей, чем у пеницилла и клеток табака. Накопление этанола S.cerevisiae сопровождается возрастанием ингибирующей активности его на продуцент и поэтому кривые, приходящиеся на идиофазу, идут почти параллельно, повторяя характер кривой для первичных метаболитов, биосинтез которых начался в период трофофазы.

       Пенициллин, синтезируемый P. chrysogenum, и не подавляющий продуцент, выражено накапливается в идиофазу.

       Алкалоид  никотин синтезируется клетками табака замедленно и при переходе культуры в стационарную фазу выход  его заметно уменьшается.

       В каждом из приведенных примеров можно  отметить свои особенности биосинтеза вторичных метаболитов. В любом  случае они образуются клетками как  естественные продукты в процессе культивирования  в соответствующих  средах и под  каталитическим действием ферментов[1]. 

       3.Отдельные представители вторичных метаболитов

       3.1.Антибиотики

       Антибиотики  — это вещества биологического происхождения, способные даже в низких концентрациях  подавлять рост микроорганизмов. Термин «вторичные метаболиты» эквивалентен термину «антибиотики», используемому в широком смысле слова. Способность образовывать антибиотики широко распространена в природе, однако она неравномерно распределена между различными таксономическими группами микроорганизмов. Наибольшее количество антибиотиков получено из актиномицетов (лучистых грибков)(по разным оценкам от 6000 до 10000, на первом месте по химическому многообразию синтезируемых веществ стоят стрептомицеты). Из несовершенных грибов выделено около 1500 антибиотиков, причем около трети образуется представителями родов Penicillium и Aspergillus, однако немногие из них имеют практическое значение. Они играют важную роль как лечебные средства, стимулирующие препараты, добавки к кормам и т.п. В качестве продуцентов вторичных метаболитов микроорганизмы приобрели огромное экономическое значение. Открытие и исследование антибиотиков, а также получение новых полусинтетических оказало неоценимые услуги медицине[5,9]. 

       3.2.Образование антибиотиков

       Уже в прошлом веке было известно, что между различными микроорганизмами могут существовать как симбиотические, так и антагонистические взаимоотношения.  Толчком к выяснению материальной основы  антибиоза послужило наблюдение Флеминга, обнаружившего(1928), что колония грибов Penicillium notatum подавляла рост стафилококков. Выделяемое этим грибом вещество, которое проникло в агар посредством диффузии, получило название пенициллина. С тех пор было выделено множество веществ с антибиотической активностью. Различают вещества, подавляющие рост микробов (бактериостатические, фунгистатические) и убивающие их (бактерицидные, фунгицидные)[1,5].

       3.3.Методы выявления антибиотиков

       Первые  антибиотики были обнаружены случайно, по образованию зон подавления роста. В чашках с питательным агаром, густо засеянным тест-организмом(индикаторными  бактериями), вокруг колоний гриба  или стрептомицета рост отсутствовал: антибиотик , диффундирующий из колонии  в агар, вызывал образование прозрачных участков в сплошном бактериальном  газоне(Рисунок 4).

Рис.4.Выделение  антибиотиков можно обнаружить по образованию  зон подавления роста индикаторных бактерий(Staphylococcus aureus), равномерно рассеянных на агаре.

       Видами - индикаторами в таких опытах служат типичные представители групп микроорганизмов. Для качественного испытания  продуцента антибиотика достаточно посеять его в середину чашки  с питательным агаром, а индикаторные бактерии в виде радиальных штрихов(Рисунок 5). После инкубации по степени  торможения роста различных индикаторных организмов судят о спектре действия антибиотика. Антибиотики различаются по действию на грам–положительные и грам – отрицательные бактерии, на дрожжи, дерматофиты и другие микроорганизмы.

Рис.5. Определение  спектра действия трех антибиотиков с помощью штрихового теста:1- Staphylococcus aureus,2- Streptococcus, 3- Escherichia coli,4- Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка),5- Candida albicans, 6- Trichophyton rubrum

Большинство антибиотиков было открыто в процессе предварительного отбора(скрининга)[1]. 
 

     3.4.Важнейшие антибиотики, применяемые в медицине

       Первое  место среди них все еще  принадлежит пенициллину, который  синтезируют Penicillium notatum, P. chrysogenum и некоторые  другие грибы; удалось также получить полусинтетические пенициллины (путем  расщепления природных пенициллинов до 6-аминопенициллановой кислоты, к  которой затем химическим путем  присоединяют различные боковые  группы)[8].

       Для человека пенициллин почти не токсичен и лишь в редких случаях вызывает побочные аллергические реакции.

       Многие  бактерии образуют пенциллиназу, которая расщепляет β-лактамовое кольцо и инактивирует пенициллин. Воздействуя на 6-аминопени-циллановую кислоту хлорангидридами кислот, можно получать сотни пенициллинов (Рисунок 6). Многие полусинтетические пенициллины не расщепляются пенициллиназой (фермент, обладающий способностью расщеплять (инактивировать) пенициллины и цефалоспорины) и ввиду их устойчивости к действию кислот могут вводиться перорально.

       Рисунок 6. Получение полусинтетических пенициллинов действием бактериальных ферментов  на пенициллин.

       Рисунок 7. Структурные формулы цефалоспорина  С, стрептомицина А, хлормицетина, тетрациклина и актиномицина D(актиномицина С₁) 

       Цефалоспорины- продукты одного из видов гриба Cephalosporium. Цефалоспорин С имеет β-лактамовое кольцо и по своей структуре близок к пенициллину (рисунок 7). Отщепляя боковую цепь и затем присоединяя к образовавшейся 7-аминоцефалоспорановой кислоте другие боковые группы, можно получать полусинтетические цефалоспорины (цефалотин, цефалоридин), которые по своему действию сходны с производными пенициллина.

       Стрептомицин  был впервые выделен из культуры Streptomyces griseus, однако его синтезируют и некоторые другие виды Streptomyces. Молекула стрептомицина состоит из трех частей: N-метил-L-2-глюкозамина, метилпентозы и дигуанидинзамещенного инозитола (рисунок 7). Успех применения стрептомицина объясняется его действием на ряд кислотоустойчивых и грам-отрицательных бактерий, нечувствительных к пенициллину. Однако стрептомицин вызывает у больных резко выраженные аллергические реакции. Этот антибиотик применяется также в ветеринарии и для борьбы с болезнями растений[1,7].

       Хлоромицетин (хлорамфеникол) был впервые обнаружен  в культурах Streptomyces venezuelae, но его можно получить и синтетическим путем (Рисунок 7). Он отличается исключительной стабильностью и действует на многие грам-отрицательные бактерии, включая спирохеты, риккетсии и актиномицеты, а также на крупные вирусы.

       Тетрациклины  тоже представляют собой метаболиты различных стрептомицетов (в том  числе Streptomyces aureofaciens). Химически они очень близки между собой и имеют в основе структуры нафтацен (Рисунок 7). Наиболее известны хлортетрациклин (ауреомицин), оксите-трациклин (террамицин) и тетрациклин. Тетрациклины отличаются широким спектром действия и хорошей переносимостью.

       К макролидам относятся антибиотики  разного происхождения с относительно большой молекулярной массой, для  которых характерно макроциклическое лактоновое кольцо. Антимикробный эффект обусловлен нарушением синтеза белка на рибосомах микробной клетки. Как правило, макролиды оказывают бактериостатическое действие, но в высоких концентрациях способны действовать бактерицидно на БГСА(пиогенный стрептококк), пневмококк, возбудителей коклюша и дифтерии. Кроме антибактериального действия макролиды обладают иммуномодулирующей и умеренной противовоспалительной активностью. Макролиды активны в отношении грамположительных кокков, таких как S.pyogenes, S.pneumoniae, S.aureus .В последние годы отмечено нарастание резистентности, но при этом 16-членные макролиды в некоторых случаях могут сохранять активность в отношении пневмококков и пиогенных стрептококков, устойчивых к 14- и 15-членным препаратам. Макролиды действуют на возбудителей коклюша и дифтерии, моракселлы, легионеллы, кампилобактеры, листерии, спирохеты, хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, анаэробы (исключая B.fragilis). Азитромицин превосходит другие макролиды по активности в отношении H.influenzae(возбудитель гемофильной инфекции) , а кларитромицин - против H.pylori (возбудитель язв желудка и двенадцатиперстной кишки, гастритов, дуоденитов, и, возможно, некоторые случаи лимфом желудка и рака желудка) и атипичных микобактерий (M.avium и др.). Действие кларитромицина на H.influenzae и ряд других возбудителей усиливает его активный метаболит - 14-гидроксикларитромицин[1,7]. Спирамицин, азитромицин и рокситромицин активны в отношении некоторых простейших (T.gondii, Cryptosporidium spp.)[1,4].

       Актиномицин был выделен в 1940 г. (первым среди  антибиотиков, образуемых стрептомицетами). Это смесь нескольких веществ; объединяет их только феноксазоновый хромофор. Роль заместителей играют различные полипептидные  цепочки (Рисунок 7).

       Наконец, следует упомянуть еще группу полипептидных антибиотиков (грамицидин S, полимиксины, бацитрацин, ристоцетин и др.). В молекуле полимиксина В к кольцу из семи аминокислот присоединена с помощью пептидной связи боковая цепь (Рисунок 8). Полипептидные антибиотики обладают высоким сродством к плазматической мембране, поэтому они одинаково токсичны как для бактерий, так и для эукариот и не применяются в клинике. Благодаря своей способности избирательно транспортировать ионы через мембрану полипептидные антибиотики могут применяться в исследовательских целях в качестве ионофоров (органические вещества, осуществляющие перенос ионов щелочных и щелочноземельных металлов или аммония через биологические мембраны.). Валиномицин, например, облегчает транспорт ионов калия через мембрану. В состав молекулы этого антибиотика входит кольцо из 12 звеньев (среди них валин, 2-гидроксиизовалерат и лактат). Структура этого кольца такова, что ион калия как раз помещается во внутреннем пространстве молекулы. Комплекс валиномицина с К⁺   благодаря присутствию валина и валерата липофилен и легко транспортируется через липидный слой мембраны. Поэтому добавление валиномицина к клеточной суспензии ведет к потере клетками ионов калия[1,4].

       В фармацевтической промышленности для  производства антибиотиков используются сейчас не исходные штаммы микроорганизмов, а более продуктивные мутанты. Штамм  гриба, открытый Флемингом, синтезировал лишь около 3 мкг пенициллина на 1 мл среды. Современные штаммы-продуценты дают минимум в 2000 раз больше. Такое  повышение выхода антибиотиков - результат  мутаций и отбора более активных штаммов, улучшения состава питательных  сред и оптимизации условий производства. Пути биосинтеза многих антибиотиков уже выяснены, и задача состоит  сейчас в том, чтобы еще больше повысить продуктивность микроорганизмов  путем получения и более целенаправленного  отбора мутантов. 

       Рисунок 8.Полимиксин В. L-Dab-2,4-диаминомасляная кислота; L-leu-L-лейцин;D-Phe- фенилаланин  ;  L-Thr –треонин; алифатическая боковая цепь-6 метилоктановая кислота.

       Стоимость годовой продукции антибиотиков – 19 миллиардов долларов. Выпускаются  антибиотики на рынок ежегодно сотнями  тысяч тонн. Они изменили микрофлору человека. Антибиотики являются «средством преодоления стрессовых ситуаций» для микроорганизмов. Для почвенных микроорганизмов они являются не только средствами борьбы, они также являются низкомолекулярными «эффекторами» микроорганизмов; с их помощью микроорганизм меняет свой метаболизм при неблагоприятных условиях (например, спорообразование). 
 

              3.5. Микотоксины

       Микотоксинами называют вторичные метаболиты определенных видов грибов[7,8]. В широком понимании к ним можно отнести также и образуемые грибами антибиотики. В узком смысле под микотоксинами понимают только такие продукты жизнедеятельности грибов , которые токсичны для высших животных и человека. Продуцентом микотоксина является, например, возбудитель спорыньи Claviceps purpurea. Афлатоксины (производные кумарина) синтезируется отдельными штаммами Asergillus flavus, A. parasiticus, A.oryzae и некоторыми другими видами грибов. Они могут присутствовать в различных заплесневелых продуктах( в арахисе, зерне, плодах маслиничных растений, в корме животных). Афлатоксины обладают канцерогенными свойствами.

       Рисунок 8 
 

        3.6.Другие вторичные метаболиты

       Среди витаминов, образуемых микроорганизмами, заслуживают упоминания рибофлавин и витамин В₁₂. Рибофлавин выделяют главным образом аксомицеты (Ashbya gossypii и Eremothecium ashbyii); однако дрожжи (Candida) и бактерии (Clostridium) тоже синтезируют в больших количествах флавины. Способность к образованию витамина В₁₂ присуща бактериям, в метаболизме которых важную роль играют корриноиды (Propionibacterium Clostridium). Этот же витамин образуют стрептомицеты. Из мицелия зигомицетов(Blakesleea trisporaи и Choanephora circinans) получают каротиноиды, используемые как добавки к комам животных[1,7].

       Что касается алколоидов, то одни только алколоиды  спорыньи добывают из микроорганизма. Хотя в настоящее время склероции  спорыньи получают главным образом  путем искусственного заражения  ржи возбудителем спорыньи(Claviceps purpurea). Алколоиды спорыньи, производные лизергиновой кислоты (эрготамин, эрготоксин), применяются при лечении сосудистых заболеваний мигрени, а также известны как галлюциногены[1,6]. 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Выводы

       Вторичный обмен веществ охватывает превращения, отражающие "индивидуальные" особенности микроорганизма. Если первичный метаболизм у всех микроорганизмов  протекает примерно одинаково, а его основные продукты, как правило, неядовиты для других организмов и за отдельными исключениями не находят применения в медицине, ветеринарии и фитопатологии, вторичные метаболиты, специфичные для продуцирующих их штамма, могут подавлять его развитие (вплоть до гибели) или же влиять в основном не на него, а на другие организмы, как, например, антибиотики и микотоксины.

       Биохимический арсенал вторичного метаболизма, как  будто не приносящего непосредственной пользы микроорганизмам, многими из них тем не менее используется самыми разнообразными путями. Во всех случаях прослеживается его связь  с первичным обменом веществ, хотя всю цепочку реакций, ведущих  к конечному продукту (например, антибиотику сложного строения), удается  установить лишь изредка.

       С открытием пенициллина и других антибиотиков возникла новая обширная область промышленной микробиологии. Бактерии и грибы синтезируют  множество веществ, которые по аналогии с подобного рода веществами растительного  происхождения принято называть вторичными метаболитами. Многие из этих веществ играют важную роль как лечебные средства, стимулирующие препараты, добавки к кормам и т. п. В качестве продуцентов вторичных метаболитов  микроорганизмы приобрели огромное экономическое значение. Открытие и  исследование антибиотиков, а также  получение новых полусинтетических  антибиотиков оказало неоценимые услуги медицине. Мы еще не в состоянии  предвидеть все возможности, которые  откроются перед нами в будущем  в связи с новыми исследованиями в этой области, и с новыми применениями вторичных метаболитов, синтезируемых  микроорганизмами. Получение и отбор  мутантов (с учетом регуляторных механизмов) позволят значительно расширить использование микробных синтезов.