Ирина Эланс

Автор который поможет с любыми образовательными и учебными заданиями

Микробиология. 5

Введение

Можно утверждать, что не только микробиологические аспекты пивоварения, но и микробиология как наука ведет свое начало с получения пива. Большой вклад в развитие современной микробиологии внесли исследования проблем порчи пива, проведенные Луи Пастером. Пивоварение — это, по существу, слияние усилий инженеров со знаниями из области ботаники, общей химии, биохимии и микробиологии. Археологические данные свидетельствуют о том, что пиво варили еще 4000 лет до н.э., однако о микробиологическом характере этого процесса узнали лишь 150 лет назад.

В большинстве стран основным сырьем для производства пива является ячменный солод, который служит благоприятной средой для развития микрофлоры. Основная часть этих микроорганизмов в нормальных условиях не способна развиваться в пиве. Развитие большинства грибов и бактерий подавляется одним или несколькими из ниже перечисленных факторов: антимикробными свойствами хмеля; снижением pH во время брожения с 5,0-5,2 в сусле до 3,8-4,0 в пиве; образованием CO₂и анаэробными условиями; увеличением содержания этилового спирта. Отсутствие этих защитных факторов приводит к предрасположенности сусла к порче. Пиво с присущими ему антимикробными свойствами и низким уровнем несбраживаемых сахаров является относительно стабильной средой, однако в анаэробных условиях определенные виды бактерий и дрожжей способны развиваться на полисахаридах или других органических соединениях, оставшихся после брожения. Источником инфицирования сусла и пива может являться солод, в котором содержится небольшое количество молочнокислых, уксуснокислых микроорганизмов и энтеробактерий, способных размножаться в благоприятных условиях. Сильное инфицирование возможно в неохмеленном или слабоалкогольном пиве, где отсутствует один из защитных факторов.

Микробиологические аспекты пивоварения

Солодоращение

Пиво готовится из злаков, а углеводом злаковых культур является крахмал. Дрожжи не способны его переработать, в связи с чем зерна предварительно проходят стадию солодоращения, в ходе которой происходит модификация крахмала, а затем, при затирании, крахмал гидролизуется с образованием сбраживаемых сахаров. Так как солодоращение – это контролируемый процесс, подобный натуральному проращиванию, соложению может быть подвергнута любая злаковая культура, а ячмень широко применяется для производства пива благодаря особым свойствам его оболочек, которые ограничивают развитие инфицирующих грибов и образуют натуральный фильтрующий слой при фильтровании сусла.

Для солодоращення подходят не все сорта ячменя. Помимо необходимых ботанических характеристик (отсутствие периода покоя или эффективность модификации сорта), важным свойством является содержание азота. Слишком низкий уровень аминного азота в сусле ограничивает рост дрожжей, однако чаще встречаются с проблемой слишком высокого содержания в ячмене азота (превышающего необходимый для развития дрожжей уровень). Избыток азота, особенно аминного, приводит к микробной порче готового пива.

Поскольку ячмень созревает только осенью, а солодоращение проводят на протяжении всего года, зерно с влажностью 20-25% должно быть высушено до содержания влаги 11%, подходящей для хранения перед солодоращением. Такая влажность предотвращает инфицирование микроорганизмами (особенно грибами), и, кроме того, при такой влажности зерно еще не теряет своей жизнеспособности.

Процесс солодоращения происходит в три этапа – замачивание, проращивание и сушка, причем каждый из этих этапов может быть подвержен микробиологическому загрязнению. Замачивание в воде происходит в течение 48 ч при температуре 15-18 °С обычно в две или более стадии с воздушными паузами, стимулирующими рост зародыша, подобно тому, как это происходит в природе. Влага, тепло и аэрация при замачивании и проращивании вызывают рост микрофлоры, неизбежно присутствующей на поверхности зерна. Проросший и модифицированный зеленый солод для лучшего хранения подвергают сушке, в ходе которой формируется характерный «солодовый» привкус.

Пивоварение. Затирание

При затирании на пивоваренном предприятии из зерна извлекаются необходимые для дрожжей питательные вещества. В варочном отделении солод (возможно, с другими несоложеными злаками) размалывают, затирают и сусло фильтруют. Затем сусло кипятят с хмелем, осветляют и охлаждают до температуры начала брожения. Наибольший интерес с микробиологической точки зрения вызывают начало и конец операций, осуществляемых в варочном отделении. Дробилки солода проектируют таким образом, чтобы зерна размалывались до мелких частиц, что приводит к лучшей экстракции сахаров и других потребляемых дрожжами питательных веществ но помол должен осуществляться при возможно наименьшем повреждения оболочек зерна. Образующаяся при дроблении пыль не должна попадать в бродильное отделение, так как микрофлора зерна содержит микроорганизмы-контаминанты. На некоторых предприятиях солод увлажняют либо подвергают кратковременной обработке паром при низком давлении, благодаря чему уменьшайся возможность повреждения в дробилке умягченных оболочек, и эффективность фильтрования в фильтр-чане повышается. Помимо прочего при этом уменьшается и возможность инфицирования, взрывоопасность и риск для здоровья, связанный с образованием мелких сухих частиц пыли, однако источником порчи может стать рост микроорганизмов на скоплениях влажных зерен или пыли в дробилках. Хотя бактерии родов Bacillus и Clostridium в таких условиях способны расти, порчу пива вызовут не они, а продукты их метаболизма – например, масляная кислота, которая остается в готовом пиве.

Бродильные емкости

Для варочных емкостей достаточно лишь мойки, тогда как для бродильных аппаратов, трубопроводов и соединительной арматуры необходимы и мойка, и стерилизация. Достижение стандартов микробиологической чистоты зависят не только от надлежащей стерилизации. Не менее важно проектировать емкости и трубопроводы таким образом, чтобы максимально уменьшить риск их инфицирования.

Воздух

Воздух несет в себе риск микробиологического загрязнения по двум причинам. Первая причина касается предприятий с традиционными открытыми емкостями. В атмосфере бродильного отделения могут присутствовать вредные микроорганизмы из брызг, образующихся при мойке соседнего танка; пыли, содержащей остатки злаков, которые переносятся по воздуху из дробильного отделения; бактерии и дрожжи (в основном с окружающих здание растений и цветов), привнесенные вентиляцией.

Второй причиной является аэрация сусла. Несмотря на ее необходимость с биохимической точки зрения, при этом возможно микробиологическое загрязнение. Адиабатическое нагревание воздуха в компрессоре не достаточно для его стерилизации, в связи с чем воздух должен проходить через обеспложивающие фильтры. В настоящее время на многих предприятиях для обеспечения высокого уровня растворения кислорода, необходимого при ферментации высокоплотного сусла, используются баллоны со сжатым кислородом, а поскольку чистый кислород стерилен, его фильтровать не нужно.

Осветление

Обычно пиво фильтруют до «бриллиантовой» чистоты (за исключением бочкового, которое осветляют оклеивающими веществами). В настоящее время использование асбеста запрещено, и вместо него в качестве фильтрующей среды применяют волокна целлюлозы или частицы диатомита или перлита с точно заданными размерами частиц.

Вместе с тем все популярнее становятся мембранные обеспложивающие фильтры. Для пива, отфильтрованного через такие фильтры, не нужна пастеризация, и таким образом экономится энергия, и устраняются возможные негативные изменения вкуса и аромата пива, возникающие при его нагреве. Мембранные фильтры – это полностью механические устройства с размером пор около 0,45 мкм, в которых задерживаются бактерии, дрожжи и мутеобразующие вещества.

Розлив пива

Бутылки и банки часто используют для розлива небольших объемов пива. Если алюминиевые или стальные банки не несут в себе риска микробиологического загрязнения, то для розлива в возвратную или одноразовую стеклянную или пластмассовую тару (обычно ПЭТ-бутылки) требуются особые системы обеспечения стерильности.

Во многих странах по экономическим причинам и в связи с проблемами охраны окружающей среды применяется система возврата бутылок. Так как после использования бутылки могут быть сильно загрязнены, перед повторным их использованием необходима тщательная мойка и стерилизация. После этого бутылки сразу же поступают на розлив. Микробиологическая чистота и корректная работа оборудования постоянно контролируются путем случайного отбора бутылок с участка между мойкой и розливом. Одноразовые бутылки не требуют тщательной мойки – для удаления загрязнений, образующихся во время хранения, достаточно их промыть струей горячей чистой воды непосредственно перед розливом, но и в этом случае необходим выборочный контроль чистоты. Возвратные и одноразовые бутылки не рекомендуется путать, так как они выпускаются в соответствии с различными ТУ, хотя за исключением мойки процесс розлива в них одинаков.

Грамположительные бактерии в пивоварении

Бактерии были признаны важнейшим агентом порчи пива в конце XIX в. Сравнение описанных тогда бактерий, преобладавших на пивоваренных предприятиях и в пиве в те времена с бактериями, обнаруживаемыми в настоящее время, свидетельствует, что некоторые из них одни и те же, хотя с годами названии их зачастую меняются. Относительно недавно с внедрением новых технологий (особенно укупорки пива с очень малым содержанием кислорода) методы микробиологического анализа настолько усовершенствовались, что стало возможным выявление в пиве «новых» возбудителей его порчи. К ним можно отнести строго анаэробные штаммы Pectinatus иMegasphaera, но в основном пивовары сталкиваются по-прежнему с теми же бактериальными контаминантами, что и в прошлом веке.

Бактерии традиционно в зависимости от их реакции на различные процедуры окрашивания, в частности, на окраску по Граму делят на грамположительные и грамотрицательные. Первое сообщение о значении окраски по Граму для микробиологии пивоварения появилось в 1945 г. – было привлечено внимание к тому, что рост большинства грамположительных бактерий в отличие от грамотрицательных тормозится горькими веществами хмеля. Такое антисептическое действие хмеля наряду с обедненностью пива питательными веществами, его низким pH и присутствием этанола сокращает круг бактерий, способных размножаться в готовом пиве. Что касается грамположительных микроорганизмов, наиболее часто встречаются молочнокислые бактерии родовLactobacillus и Pediococcus, и у некоторых штаммов развита толерантность к хмелю. В пиве могут выживать и некоторые представители родов Micrococcus и Staphyloccus, а при определенных условиях Micrococcus kristinae размножается и вызывает порчу продукта. В редких случаях проблемы создаются аэробными спорообразующими бактериями, относящимися к роду Bacillus, особенно в неохмеленном сусле, но подобно микрококкам под воздействием тормозящего эффекта коипонентов хмеля они ни обнаруживают способности к размножению, и поэтому обычно не представляют большой угрозы.

Молочнокислые бактерии

Типичные молочнокислые бактерии – это грамположительные не образующие споры палочки или кокки. Они не имеют каталазной активности, характеризуются бродильным типом метаболизма с образованием в качестве конечного метаболита расщепления сахаров либо смеси молочной кислоты с СО₂, уксусной кислотой и/или спиртом (гетероферментация), либо почти исключительно молочной кислоты (гомоферментация). Эти бактерии толерантны к кислоте и требовательны к составу питательной среды. Молочнокислые бактерии обычно развиваются на средах, богатых питательными веществами, – например, на молоке и молочных продуктах, овощах и фруктах, причем многие такие бактерии присутствуют в естественной микрофлоре млекопитающих (ротовой полости, кишечнике и влагалище).

Лактобактерии в пиве

Наиболее типичным контаминантом при порче пива является Lactobacillus brevis. Эти облигатно гетероферментативные бактерии обычно толерантны к хмелю; оптимальные условия для их размножения — 30 °С и рН 4-5. Другие виды лактобактерий, в частности, Lb. diastaticus(амилолитическая бактерия, ответственная за гидролиз декстринов в пиве) и Lb. pastorianus(продуцирующая внеклеточный полисахарид или слизь) относятся к Lb. brevis. Lb. brevisфизиологически многообразны и могут вызывать в пиве проблемы разного рода.

Лактобактерии наиболее опасны в период кондиционирования пива и после укупорки. Порча характеризуется «шелковистым помутнением», иногда перед этим появляется маслянистый привкус диацетила. Хотя основным продуктом метаболизма этих бактерий является молочная кислота, ее высокий вкусо-ароматический порог по сравнению с низким пороговым значением для диацетила обусловливает важность последнего как соединения, изменяющим вкус и аромат пива.

Лактобактерии также участвуют в синтезе 3-гидроксииропиональдегида, предшественника горького соединения акролеина. Фермент глицерингидратаза присутствует в различных видах лактобактерий, включай Lb. collinoides и Lb. Hilgardii, и могут преобразовывать глицерин в 3-гидроксипропиональдегид.

Многие лактобактерии, включая выделяемые обычно из продуктов брожения солодового виски, могут декарбоксилировать замещенные коричные кислоты. Эти соединения (например, р-кумариновая и феруловая кислоты) входят в состав клеточной стенки ячменя. Декарбоксилирование приводит к продуцированию производных 4-винила, придающих пиву заметный фенольный привкус.

И, наконец, некоторые лактобактерии участвуют в образовании внеклеточных полисахаридов или «слизи» (тягучих, липких нитей), но в случае лактобактерий это серьезной проблемы не представляет – чаще это явление приписывают действию педиококков или уксуснокислых бактерий.

Педиококки

Педиококки — это гомоферментативные кокки, которые из-за деления в двух плоскостях встречаются в виде дипло- и тетракокков.

Из выявленных в пиве педиококков, несомненно, наиболее широко распространен и опасен P. damnosus. Особый интерес представляет то, что этот микроорганизм явным образом обнаруживается лишь в пиве, пивных дрожжах и винах, в то время как в пивоваренном сырье и растительных материалах он не встречается. P. inopinatus был выделен из вина, пива и пивных дрожжей, но присутствует также в сброженных овощах и молоке. P. dextrinicus и Р. pentosaceus пыделиюг выделяются из пива и с пивоваренного оборудования, но гораздо реже, чем Р. damnosus.

Для педиококков, традиционно ассоциируемых с «сарциновой болезнью», характерно образование кислоты и маслянистого аромата диацетила.

Вязкость пива может быть обусловлена наличием педиококков, причем она зависит от присутствия некоторых сбраживаемых сахаров. Образование слизи чаще приписывают действию P. acidilactici, чем P. damnosus. Внеклеточная слизь, образуемая этими бактериями, является тиксотропной и представляет собой сложный гетерополимер глюкозы, маннозы и нуклеиновой кислоты.

Педиококки принимают участие также в образовании тирамина из тирозина.

Лейконостоки

Гетероферментативные кокки, иногда овальной формы, а чаще в форме коротких палочек, встречающиеся парами или короткими цепочками, относят к роду Leuconostoc. Эти микроорганизмы обнаруживаются в основном на овощах, фруктах и в бродящих овощных материалах (на пивоваренных предприятиях они встречаются редко).

Лейконостоки встречаются на ранних стадиях брожения шотландского виски, и современные количественные таксономические анализы относят большинство изолятов этих организмов к двум группам: Leuc. mesenteroides и к каким-то новым видам. Данных о том, что Leuc. oenos (бактерия, вызывающая молочное брожение вина) может встречаться на спиртовых заводах, нет. Единственным выявленным на пивоваренных предприятиях видом оказался Leuc. mesenteroides, но он не связан с порчей пива. Из фруктовых смесей были выделены лишь кислототолерантные штаммы Leuc. mesenteroides; их иногда ассоциируют с некоторыми традиционными африканскими напитками.

Гомоферментативные кокки

Грамположительные гомоферментативные кокки, встречающиеся парами или в виде цепей, относят к родам Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus и Vagococcus. Эти бактерии часто встречаются в сыром молоке и молочных продуктах, на растительных материалах, в ротовой полости и кишечнике человека и животных. Единственный представитель этой группы, иногда встречающийся на пивоваренных предприятиях, – Lactococcus lactis, который обычно загрязняет оборудование, но более известен продуцированием диацетила из цитрата и своей ролью в производстве сливочного масла.

Кокурии, микрококки и стафилококки

К родам Micrococcus и Staphylococcus относят грамположительные кокки, образующие каталазу и не характеризующиеся метаболизмом типа молочного брожения. Эти бактерии формируют скопления клеток, которые не всегда заметны, в связи с чем эти микроорганизмы фактически неотличимы от молочных кокков. Вместе с тем их легко различить по способности к размножению на питательном агаре при рН 7,0 и по каталазному тесту.

В пивоваренной промышленности эти бактерии обычно важными не считают, но недавние исследования показали, что в пиве и на пивоваренных предприятиях они широко распространены и в некоторых случаях могут приводить к порче пива.

Бактерии, образующие эндоспоры

Известны случаи, когда проблемы в производстве пива были вызваны аэробными бактериями, образующими эндоспоры и относящимися к роду Bacillus. Споры этих бактерий присутствуют в солоде и в зерновых добавках; они выживают при кипячении сусла, но после этого не способны к росту из-за низких значений рН бродящего сусла и пива. Более того, все виды Bacillus чувствительны к хмелю, так что в пиве с ними проблем не бывает. Тем не менее существует серьезная опасность, что в современной пивоваренной промышленности серьезные проблемы могут возникнуть со сповообразующим вариантом Lb. brevis.

Из пивоваренного оборудования, солода и сусла после кипячения были выделены термофильные бациллы, образующие эндоспоры. Идентифицированные как В. coagulans и промежуточный вид B. coagulans – B. stearothermophilus, эти бактерии в сусле, выдерживающемся при 55-70 °С более 2 ч, продуцируют большое количество молочной кислоты. Хотя обычно подкисление считается вредным, контролируемое подкисление сусла может оказаться полезным, так как улучшает вкусо-ароматический баланс и микробиологическую стабильность пива.

Грамотрицательные бактерии в пивоварении

Присутствие в ходе пивоварения грамотрицательных бактерий считается нежелательным. Основные грамотрицательные бактерии порчи – уксуснокислые бактерии и микроорганизмы родовEnterobacteriaceae, Zymomonas, Pectinatus cerevisiiphilus, Pectinatus frisingensis, Selenomonas lacticifex, Zymophilus raffinosivorans, Zymophilus paucivorans, а также Megasphaera.

Уксуснокислые бактерии

Уксуснокислые бактерии образуют важную группу грамотрицательных палочкообразных бактерий, способных превращать спирт в уксусную кислоту. Они используются для промышленного производства уксуса и могут приводить к порче пищевых продуктов, безалкогольных и алкогольных напитков (пива, вина, сидра).

Уксуснокислые бактерии были выделены из окружающей среды пивоваренных предприятий, а поскольку они характеризуются стойкостью к бактериостатическим свойствам хмеля, к кислотам и к этиловому спирту, то способны размножаться в пиве и его портить.

Уксуснокислые бактерии чаще всего присутствуют в пиве, разливаемом из бочек, – оно быстро окисляется под влиянием проникающего в бочки воздуха. Эти бактерии портят пиво, придавая ему кислый вкус, посторонние привкусы и ароматы, вызывают появление мути и образование слизи. Возникновение посторонних привкусов и ароматов без подкисления возможно в случае окисления полиспиртов (например, глицерина) до дигидроксиацетона. Образование слизи часто наблюдается в виде покрытия поверхности пива маслянистой пленкой. Степень порчи пива уксуснокислыми бактериями зависит от штамма и содержания спирта. Было обнаружено, что при концентрации спирта выше 6% размножение этих бактерии полностью подавляется. Тем не менее, некоторые штаммы способны к росту в средах с 10%-ным содержанием этилового спирта.

В ячмене и хмеле обнаружить уксуснокислые бактерии не удалось, однако некоторые образцы солода, сусла, дрожжей и воздуха оказались ими контаминированы, причем наиболее сильно контаминированными оказались емкости для хранения и клапаны регулирования давления. Тем не менее, редкое обнаружение уксуснокислых бактерий в пробах воздуха весьма неожиданно, так как в пивоваренном производстве они встречаются повсеместно, а пиво, подвергающееся воздействию воздуха, быстро окисляется. Уксуснокислые бактерии встречаются на многих видах растений, и, следовательно, нельзя не учитывать возможность их попадания в пиво с растительных материалов и из воздуха. Уксуснокислые бактерии характеризуются стойкостью к антисептическому действию хмеля и кислых сред, а также толерантны к этиловому спирту, в связи с чем в присутствии кислорода они могут размножаться и портить пиво.