Пренатальная диагностика хромосомных заболеваний

Министерство здравоохранения и социального развития.

ГОУ ВПО Кировская государственная медицинская академия.

Кафедра медицинской биологии и генетики.

Зав. Кафедрой: д.м.н. профессор Косых А.А.

Преподаватель: к.м.н. ст. преподаватель Козвонин В.А.

РЕФЕРАТ

На тему: «Пренатальная диагностика хромосомных заболеваний»

Выполнил: ст. гр.Л-416

Князев М.Г.

Киров 2010.

Оглавление:

1) вступление

2)методы диагностики хромосомных заболеваний.

3)заключение

4)список использованной литературы

Вступление.

Установлено, что более 40% спонтанных абортов и около 7% мертворождений обусловлено хромосомными аберрациями (ХА). Патология, сопровождающая дисбаланс хромосомного материала, вызывает различные аномалии развития у носителей и может быть связана не только с множественными врожденными пороками развития (МВПР), но и с умственной и физической отсталостью, нарушениями полового развития, бесплодием и невынашиванием беременности. Популяционная частота ХА у новорожденных составляет 0,6–0,8%, а у новорожденных с МВПР она возрастает до 40% /Лечение большинства таких пациентов пока малоэффективно, а прогноз неблагоприятен. Поэтому в современных условиях интенсивно развиваются методы дородовой диагностики ХА, а их использование в практическом здравоохранении позволяет предупредить рождение детей с тяжелой патологией. В настоящее время из-за экономических трудностей в России частично сокращается финансирование государственных программ дородового мониторинга состояния здоровья беременных женщин. Параллельно с этим процессом изменяется отношение врачей к скринингу анеуплоидий. В частности, предпринимаются попытки полностью отказаться от биохимического тестирования беременных женщин и заменить его более углубленным и расширенным ультразвуковым исследованием (УЗИ).


 

Методы диагностики хромосомных заболеваний.

Целью настоящего обзора явился анализ как существующих методических подходов в пренатальной диагностике (ПД) хромосомопатий, так и ее принципиально новых направлений.
Базовыми методами ПД хромосомных заболеваний во многих развитых странах являются:
скрининговое определение уровня альфа-1-фетопротеина (АФП), хорионического гонадотропина (ХГ), неконъюгированного эстриола (НЭ) и других маркеров в сыворотке крови матери; динамическая (начиная с I триместра) эхография;инвазивная ПД, включающая проведение таких манипуляций как биопсия хориона, амниоцентез, кордоцентез.Обязательным условием успешного проведения ПД является предварительное выяснение семейного и акушерско-гинекологического анамнеза. Женщины 35 лет и старше составляют самую многочисленную группу среди беременных, которым проводится инвазивная ПД, хотя удельный вес этих рожениц составляет 5% от общего числа в популяции. Более чем у 4% из них выявляются те или иные ХА плода. Подсчитано, что у женщины 40 лет индивидуальный риск синдрома Дауна (СД) у плода на 16-й неделе беременности равняется 1:67, тогда как у 20-летней беременной он равен 1:1053. Пороговый уровень риска, превышение которого делает целесообразным выполнение инвазивных манипуляций, в отсеивающих компьютерных программах приближается по абсолютной величине к частоте рождения детей с СД у женщин 35–37 лет (1:200–1:400). В связи с этим во многих странах женщины с “возрастной” беременностью направляются на инвазивную диагностику без предварительного определения в сыворотке крови концентрации биохимических маркеров. Общеизвестно, что частота хромосомной патологии несколько выше у матерей, имеющих в анамнезе детей (плодов) с ХА или пороками развития, а также у женщин с привычным невынашиванием в ранних сроках беременности. Индивидуальный риск ХА плода наиболее высок у родителей-носителей хромосомных нарушений. Прогностическая значимость данных анамнеза анализируется во многих работах и неодинаково оценивается разными авторами .

Пренатальная диагностика направлена на следующие заболевания:

        Пренатальная ДНК-диагностика гемофилии А

        Пренатальная ДНК-диагностика муковисцидоза

        Пренатальная ДНК-диагностика мышечной дистрофии

        Пренатальная ДНК-диагностика пола плода при Х сцепленных заболеваниях

        Пренатальная ДНК-диагностика спинальной мышечной атрофии

        Пренатальная ДНК-диагностика фенилкетонурии

Первый скрининг (скрининг первого триместра) проводится на сроке 11-14 недель, причем идеальным сроком является 12-13 неделя.

Скрининг первого триместра включает в себя:
1. Исследование УЗИ (причем, многие лаборатории запрашивают результаты УЗИ в обязательном порядке, без них расчеты не проводятся)
2. Биохимическое исследование (анализ крови). Исследуются два гормона: свободная b-субъединица хорионического гонадотропина человека (свободный b-ХГЧ) и РАРР-А (белок А плазмы ассоциированный с беременностью)

Первый скрининг: результаты, или на что смотрим

УЗИ

Помимо стандартного исследования УЗИ с наблюдением ручек-ножек, позвоночника, формирования мозга, измеряют так называемую воротничковую зону. Воротничковая (воротниковая) зона – это зона в области шеи между кожей и мягкими тканями, в которой скапливается жидкость. Сильное превышение показателей над нормой может говорить об отклонениях в развитии плода.

Нормы воротничковой зоны определяются в зависимости от возраста эмбриона, так как она сильно меняется. Средняя толщина воротничковой зоны — 0,12 см в 11 недель (нормой принято считать толщину до 2 мм) и 0,15 см в 14 недель (к норме относят толщину до 2,6 мм).

ВНИМАНИЕ! Измерение воротничковой зоны требует очень квалифицированных операторов со специальной подготовкой. Без дополнительных исследований постановка диагноза только по результатам УЗИ невозможна!

БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Нормы содержания свободного b-ХГЧ, нг/мл:

Повышение значений в среднем в 2 раза может говорить о увеличении риска наличия у плода трисомии 21 (синдром Дауна). Снижение значений - о риске наличия у плода трисомии 18 (синдром Эдвардса).

Обычно результаты скрининга представляют собой отчет. В нем указываются данные, использовавшиеся при расчётах, приводятся результаты проведённых исследований, скорректированные значения МоМ (отношение полученного при исследовании результата к индивидуально скорректированной медиане референсных значений). В заключении указываются количественные показатели степени риска по трисомии 21 (синдром Дауна), трисомии 18 (синдром Эдвардса) и дефекту нервной трубки (ДНТ).

Результаты расчёта риска хромосомных аномалий плода на основании скрининговых биохимических исследований - это статистические вероятностные показатели, которые не являются основанием для постановки диагноза, а служат показанием для дальнейших специальных методов исследования.

На основе результатов скрининга Ваш врач может посоветовать Вам консультацию у специалиста-генетика, а он – дополнительные исследования.

Второй скрининг: описание

Второй скрининг (скрининг второго триместра) проводится на сроке 16-20 недель, оптимальным сроком является 16-17 неделя.

Скрининг второго триместра включает в себя:
1. Расширенное исследование УЗИ
2. Биохимическое исследование (анализ крови), исследуются три гормона

Второй скрининг: результаты или на что смотрим

УЗИ

Во втором триместре проводится расширенное исследование УЗИ: специалист внимательно осматривает плод, его ручки-ножки, внутренние органы (сердце, мозг, позвоночник), оценивает состояние плаценты, околоплодных вод. Делается предположение о дате родов.

БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Биохимический анализ крови исследует три гормона:
1. Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ)

Повышенный уровень ХГЧ может говорить о хромосомных патологиях. Также увеличение уровня может быть вызвано многоплодной беременностью, несоответствием реального и установленного сроков беременности, гестоза, сахарного диабета у матери

2. Альфа-фетопротеин (АФП)

3. Свободный эстриол (неконъюгированный эстриол)

Обычно результаты скрининга представляют собой отчет. В нем указываются данные, использовавшиеся при расчётах, приводятся результаты проведённых исследований, скорректированные значения МоМ (отношение полученного при исследовании результата к индивидуально скорректированной медиане референсных значений). В заключении указываются количественные показатели степени риска по трисомии 21 (синдром Дауна), трисомии 18 (синдром Эдвардса) и дефекту нервной трубки (ДНТ).

Результаты расчёта риска хромосомных аномалий плода на основании скрининговых биохимических исследований - это статистические вероятностные показатели, которые не являются основанием для постановки диагноза, а служат показанием для дальнейших специальных методов исследования.

На основе результатов скрининга Ваш врач может посоветовать Вам консультацию у специалиста-генетика, а он – дополнительные исследования.

Биохимический скрининг.
Наиболее распространенный вариант биохимического скрининга хромосомных нарушений включает оценку в сыворотке крови матери уровня АФП, ХГ и НЭ на 15–20-й неделе беременности. Эффективность этого "тройного теста" составляет 60–70%. Использование АФП в качестве единственного белкового маркера снижает эффективность биохимического скрининга более чем в 3 раза. Замена в “тройном тесте” НЭ димерным ингибином А позволяет обнаружить 97% случаев СД плода без значительного изменения уровня ложноположительных результатов. Финские исследователи пришли к заключению, что определение концентрации НЭ увеличивает стоимость данной отсеивающей программы без существенного улучшения выявляемости хромосомной патологии .Однако, по данным других авторов, измерение сывороточного содержания НЭ достоверно повышает информативность иммунохимического тестирования.
В последние годы отмечается значительное усиление интереса клиницистов к ассоциированному с беременностью протеина А (pregnancy-associated plasma protein-A, PAPP, А), что обусловлено, главным образом, его высокой информативностью при диагностике ХА плода в конце I триместра беременности .Пренатальный биохимический скрининг, который проводили в Англии, Швейцарии, США и многих других странах, показал, что выявляемость СД в I триместре беременности при одновременном определении концентраций РАРР-А и свободной цепи ХГ, а также с учетом возраста матери достигает 70% при уровне ложноположительных результатов, приближающемся к 5%. Эффективность изолированной оценки сывороточного содержания свободной субъединицы ХГ была примерно вдвое ниже. По данным E.Casals и соавт., она равнялась только 9%, тогда как комбинированное исследование РАРР-А и АФП в I триместре позволяло обнаружить более 80% плодов с СД Диагностическая ценность определения свободной ?-цепи ХГ в моче приближалась к таковой в сыворотке крови. Более подробная информация о свойствах и динамике сывороточной концентрации РАРР-А и других маркеров хромосомной патологии плода представлена в недавно опубликованном обзоре.

Эхографический скрининг.
Несмотря на бесспорную информативность биохимических тестов, во многих центрах отдается предпочтение ультразвуковому скринированию фетальных хромосомопатий. С помощью тщательно проведенного рутинного УЗИ в 20 нед беременности можно выявить до 20% хромосомных нарушений и около 40% трисомий по хромосоме 21 (при 8% уровне ложноположительных результатов). При СД плода часто обнаруживаются утолщенная (более 5 мм) шейная складка, внутриутробная задержка развития плода, умеренный гидронефроз, укорочение бедренной кости, гиперэхогенный кишечник и пороки сердца. Описаны также разнообразные пренатальные маркеры и других анеуплоидий. В некоторых случаях для их детекции показано проведение компьютерной томографии. Комбинация эхографических отклонений с задержкой внутриутробного развития плода и аномальным количеством околоплодных вод повышает выявляемость хромосомной патологии до 82,4%. Обнаружено, что наибольшее количество грубых(т.е. приводящих к летальности диагностируется при наличии эхографических маркеров, а не в группе пороков развития плода (соответственно 21,6 и 14,9%) .

Увеличение воротникового пространства (3 мм и более) в сроке от 10 до 14 нед беременности является общим фенотипическим проявлением трисомий, синдрома Шерешевского–Тернера и триплоидии; оно наблюдается только у 5% плодов с нормальным кариотипом. Определение его толщины в одном из английских перинатальных центров привело к обнаружению 77% плодов с СД и 78% плодов с другими ХА. В дальнейшем было показано, что выявляемость трисомий по хромосомам 21, 13 и 18 с помощью эхографического исследования составляет 73%, а в комбинации с иммунохимической оценкой сывороточной концентрации свободной цепи и РАРР-А она возрастает до 87%.
Развитие неинвазивных методов ПД привело к возникновению концепции о значительной эффективности последовательного и комбинированного пренатального скрининга хромосомных заболеваний, который состоит из следующих этапов:сканирование воротникового пространства в 10–13 нед беременности с одновременным измерением уровня свободной цепи ХГ и РАРР-А в сыворотке крови матери; традиционное биохимическое тестирование (АФП, ХГ, НЭ и другие маркеры) в 15–18 нед беременности;ультразвуковое исследование в 20 нед беременности.

Помимо роста экономических затрат, одним из негативных последствий повсеместного внедрения широкого комплекса скрининговых исследований будет увеличение частоты инвазивных вмешательств, которое, несомненно, приведет к возрастанию количества ятрогенных фетальных потерь. Уже в настоящее время в Дании 10–12% беременных женщин подвергаются инвазивным диагностическим процедурам, что позволяет выявить пренатально 40% плодов с СД. Между тем ПД обоснована и целесообразна только тогда, когда риск рождения больного ребенка выше риска осложнений после применения хирургических манипуляций, предназначенных для получения плодового материала, – хорионбиопсии, амниоцентеза и кордоцентеза. Наиболее низкий уровень перинатальных потерь отмечается после амниоцентеза, который выполняется обычно на 16–20-й неделе беременности, поскольку до этого срока в околоплодных водах присутствуют лишь единичные фибробласты плода, способные in vitro прикрепляться к пластику и размножаться. Результаты единственного сравнительного рандомизированного исследования, проведенного в Дании, показали, что частота спонтанных абортов после амниоцентеза составляет 1,7%, причем она достоверно выше, чем в контрольной группе (1%, р меньше 0,01). Датские ученые выявили также связь между амниоцентезом и возрастающим риском развития респираторного дистресс-синдрома и пневмонии у новорожденных: в основной группе наблюдалось 1,8% детей с этими постнатальными осложнениями, а в контрольной группе их было около 1%.
В Израиле, Канаде, Франции, Англии и во многих других странах амниоцентез в течение последних десятилетий остается основным методом получения клеток плода для последующего кариотипирования. Наш собственный опыт и данные зарубежных цитогенетиков свидетельствуют о том, что при использовании стандартного трипсин-метода можно получать высококачественные хромосомные препараты фибробластов тяжелой инвалидности) ХА

плода из амниотической жидкости уже после 10–14-суточного культивирования их в плоскодонных флаконах в CO2-инкубаторе. С помощью "пипеточного" метода У.Клауссена, суть которого заключается в индивидуальном сборе митотических клеток микропипеткой, удается приготовить любое необходимое количество G-дифференциально окрашенных метафазных пластинок уже к концу 1-й недели культивирования. Высокую эффективность имеет и метод in situ анализа метафаз в колониях фетальных клеток.
Анализ результатов раннего амниоцентеза и хорионбиопсии при сроке беременности 10–13 нед у женщин с развивающейся одноплодной беременностью показал, что обе методики имеют одинаковую эффективность при получении цитогенетического материала, однако увеличение риска перинатальных потерь на 2–3% при раннем амниоцентезе по сравнению с таковым при хорионбиопсии делает последнюю более перспективным методом ПД хромосомных болезней у плода в I триместре. Основным диагностическим материалом, используемым для цитогенетических исследований в I триместре

беременности, являются ворсины хориона. После трансабдоминальной хорионбиопсии средняя частота потерь плодов составляет 1–3%, а после трансцервикальной хорионбиопсии она равняется 6,3–14% .Доказано, что ее выполнение при сроке беременности менее 10 нед может привести к оромандибулярной гипоплазии (микрогнатии и микроглоссии) и более чем на порядок повышает частоту врожденных поперечных редукций конечностей, которая в общей популяции составляет 1,8 на 10 000 живорожденных. К несомненным достоинствам этой методики относятся возможность быстрого (через 1–2 сут) получения результата, ее относительная простота и экономичность, а также высокая эффективность, практически не зависящая от срока беременности. Наиболее часто при кариотипировании цитотрофобласта выявляются аутосомные анеуплоидии и структурные аберрации, несколько реже встречаются анеуплоидии по гоносомам, сверхкомплектные маркеры и триплоидии. Примерно у 1–2% женщин при кариотипировании ворсин хориона на 9–11-й неделе беременности обнаруживается анеуплоидия, чаще всего полная или мозаичная трисомия, при нормальном кариотипе плода. Такой ограниченный плацентарный мозаицизм обычно ассоциирован с внутриутробной задержкой развития плода. С помощью современных молекулярно-генетических методов установлено, что в большинстве случаев он сочетается с унипарентной дисомией, при которой у плода обе гомологичные хромосомы наследуются от одного родителя. Клиническими проявлениями последней могут быть синдромы Прадера–Вилли и Ангельмана (хромосома 15) и синдром Беквита–Видемана (хромосома 11), витальный прогноз которых неблагоприятен, а также различные аутосомно-рецессивные заболевания, возникающие вследствие гомозиготизации хромосомного материала.
При обследовании женщин с высоким риском хромосомной патологии не рекомендуется полностью полагаться только на результаты кариотипирования цитотрофобласта и клеток ворсин хориона, имеющих экстраэмбриональное происхождение. Более надежными являются результаты цитогенетического анализа клеток амниотической жидкости и лимфоцитов. Взятие крови плода при пункции сосудов пуповины под контролем ультразвука, кордоцентез, который обычно проводят не ранее 20-й недели беременности, вызывает осложнения в среднем в 3,2–6,5% случаев. Частота фетальных потерь в течение 2 нед от момента его выполнения зависит от того, по каким показаниям он проводился, и составляет 1, 7 и 14% соответственно, при нормальном развитии плода, структурных аномалиях и задержке развития плода. Кроме того, риск перинатальной смертности после кордоцентеза во многом определяется квалификацией и опытом хирурга. Во Франции доля кордоцентезов среди всех инвазивных вмешательств составляет 23%, а в США в ряде центров его назначают большинству женщин с УЗИ-маркерами хромосомных заболеваний .Современные методы ДНК-анализа.
В последние годы для ПД все чаще применяются молекулярно-генетические методы, наиболее важным из которых является FISH (fluorescence in situ hybridization). Он основан на использовании в реакции гибридизации in situ различных ДНК-проб (клонированных фрагментов ДНК человека), которые в фиксированных препаратах связываются со строго определенными (комплементарными им) районами хромосом. FISH превосходит классические методы кариотипирования по разрешающей способности и экономичности и в меньшей степени зависит от уровня подготовки цитогенетика. С его помощью возможно определение числа хромосом в ядрах амниоцитов, цитотрофобласта, лимфоцитов и любых других клеток в течение 24–48 ч. Обследование десятков тысяч пациенток показало, что эффективность интерфазного FISH-анализа некультивируемых амниоцитов превышает 80%. При одновременном применении центромероспецифичных зондов, взаимодействующих с хромосомами 13, 18, 21, X и Y, выявляется 90–95% всех фетальных ХА. Поэтому данный вариант FISH имеет гораздо более высокую информативность, чем другие скрининговые методы. Особую ценность он приобретает при проведении пренатальной экспресс-диагностики с целью уточнения степени мозаицизма неделящихся клетках ворсин хориона и амниотической жидкости. Некоторые авторы при постановке FISH-мeтoдa для выявления трисомий в амниоцитах отдают предпочтение теломерным ДНК-пробам космидных клонов.
Центромероспецифичные зонды не всегда пригодны для обнаружения несбалансированных робертсоновских транслокаций, доля которых среди всех трисомий составляет около 5%, и многих других структурных ХА. Поэтому в ПД для FISH-вepификaции транслокаций часто используются коммерческие хромосомоспецифичные ДНК-библиотеки (т.е. смесь уникальных последовательностей ДНК, покрывающих всю длину хромосомы – painting probes). Этот вариант позволяет также устанавливать семейный характер сверхкомплектных маркерных хромосом, который наблюдается в 40% случаев, что нередко играет решающую роль в выборе тактики ведения беременности. Показано, в частности, что обнаружение у плода дополнительной хромосомы, идентичной по молекулярному составу маркерной хромосоме одного из фенотипически здоровых родителей, свидетельствует о незначительном риске рождения ребенка с аномалиями развития.Частота последних при наличии несателлитных фетальных хромосом, возникших de novo, может достигать 27%, а для маркеров, содержащих короткие плечи акроцентрических хромосом, она составляет около 8%. Для успешного анализа многих ХА плода, например, микроделеций, инсерций или инверсий, часто необходим микро-FISH-метод (reverse chromosome painting). Суть его состоит в том, что с помощью микроманипулятора или проточной сортировки изолируют аберрантные хромосомы, их ДНК амплифицирует, продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) метят и исподьзуют в гибридизации с нормальными метафазными хромосомами. Таким образом удается идентифицировать участки, присутствующие на аномальной хромосоме, и выявить ее делетированные районы. С помощью “обратного” окрашивания можно определить, является ли данная фетальная транслокация, наследуемая от одного из родителей, сбалансированной, что чрезвычайно важно для решения вопроса о прерывании беременности. Микро-FISH-анализ (в комбинации с микродиссекцией хромосом и ПЦР) культивируемых клеток амниотической жидкости был успешно использован для идентификации возникших de novo маркерных ХА: небольшой сверхкомплектной сателлитной хромосомы, изохромосомы i(9p) и кольцевой мини-хромосомы r(1). Первая из них образовалась в результате слияния центромерных гетерохроматических районов хромосом 14 и 22, поэтому какие-либо ее фенотипические проявления до и после рождения ребенка обнаружить не удалось. В двух других случаях наблюдались множественные аномалии и пороки развития плодов и ранняя постнатальная гибель новорожденных, вследствие присутствия в маркерных хромосомах эухроматических участков, содержащих структурные гены.
Таким образом, FISH-анализ в комплексе с методами классической цитогенетики резко повышает эффективность ПД практически всех видов хромосомопатий.
Быстрым и экономичным скрининговым методом определения анеуплоидии и триплоидии плода является тест, основанный на количественной флюоресцентной мультиплексной ПЦР. При его постановке амплифицируются небольшие повторяющиеся последовательности ДНК, маркирующие хромосомы 21, 18, 13, X и др., а последующий количественный флюоресцентный анализ ПЦР-продуктов позволяет дифференцировать образцы с нормальным и патологическим кариотипом. Продолжительность ПЦР-анализа обычно составляет несколько часов. В.Perti и соавт. при исследовании 85 образцов ДНК, выделенной из клеток амниотической жидкости плодов, в 82 удалось достичь значительного совпадения с результатами стандартного цитогенетического анализа. Они обнаружили 20 плодов с СД, а также плоды с триплоидией (2 случая), синдромом Эдвардса (2 случая) и синдромом Патау (1 случай). Лишь в 3 наблюдениях при амплификации единственного маркерного повтора хромосомы 13 имела место гипердиагностика синдрома Патау, причем у льзуют затем как зонды сплошной ок одного из плодов она объяснялась дупликацией хромосомного материала.
С помощью количественного ПЦР-метода возможно обнаружение нуклеотидной последовательности, соответствующей SRY-гену хромосомы Y, в крови женщин, беременных мужским плодом, после 7-й недели гестационного периода. Положительный результат удается получить при наличии 1 мужской фетальной клетки среди 12 800 клеток матери.
ПЦР-тест весьма эффективен при анализе малого количества генетического материала, полученного, например, при раннем амниоцентезе, выделении фетальных клеток, циркулирующих в материнском кровотоке, или трансцервикальном лаваже. Последний обычно проводится на 7–9-й неделе беременности, и трофобластические клетки, находящиеся в смывах слизи из цервикального канала или нижнего отдела полости матки, используют для диагностики трисомий плода и для определения его пола. Сообщается также об успешном выявлении СД плода с помощью FISH-анализа лаважных клеток.
Показана принципиальная возможность определения кариотипа по клеткам плода, циркулирующим в материнском кровотоке. Несмотря на то, что даже в конце беременности на 1 эритробласт плода приходится 10 000 материнских ядросодержащих клеток, с помощью современных иммунофлюоресцентных или магнитных модулей для проточной сортировки клеток (FACS, MACS и др.) удается получить обогащенную фракцию фетальных клеток, в которой их содержание может достигать 10%. Для выделения эритробластов используются меченные флюорохромами или железными частицами моноклональные антитела к белкам, присутствующим на их мембранах – рецептору трансферрина (CD71), гликофорину А и рецептору тромбоспондина. Предварительно клетки крови центрифугируют в тройном градиенте плотности, и в ряде случаев, проводят с помощью ядерных красителей селекцию клеток, содержащих ядра. Рекомендуется также негативная сортировка СD45-позитивных лимфоцитов. Помимо клеток эритроидного ряда в крови матери находятся фетальные раски для лимфоциты и гранулоциты, а также трофобластические клетки, но они оказались менее удобными объектами для цитогенетических исследований.

С помощью интерфазного FISH-анализа флотирующих в крови матери клеток были идентифицированы фетальные трисомии по хромосомам 21, 18, X, а также синдром Клайнфельтера (47,XXY). Так, исследование 42 312 ядер клеток, изолированных из кровотока 40 женщин, направленных для проведения ПД в различные сроки беременности (10–27 нед), позволил в 2 наблюдениях обнаружить СД плода, который в дальнейшем был подтвержден с помощью амниоцентеза. Пол был правильно определен у всех плодов с кариотипом 46,ХХ и у 5 из 16 плодов с мужским кариотипом. В 1 случае у плода с синдромом Эдвардса аберрантные клетки среди 640 отсортированных клеток выявить не удалось. В остальных наблюдениях, по данным FISH и последующего кариотипирования амниоцитов, хромосомная патология плода отсутствовала. В большинстве публикаций сообщается лишь об единичных случаях ПД анеуплоидий. Их анализ свидетельствует о том, что данный тест имеет пока более низкую чувствительность и специфичность по сравнению с аналогичными показателями инвазивных методик. Главной проблемой остается низкая концентрация фетальных клеток в обогащенной фракции, причем значительная их часть не вступает в реакцию гибридизации с ДНК-зондами.

Поэтому приходится проводить анализ ограниченного количества клеток, что увеличивает вероятность ошибки. Определенные трудности возникали даже при определении пола плода, тогда как при исследовании ДНК отсортированных клеток с помощью ПЦР-амплификации Y-специфических последовательностей пол плодов на 8–19-й неделе беременности был идентифицирован в 94–100%. Таким образом, этот подход остается пока экспериментальным и по информативности не превосходит существующие скрининговые тесты. Его использованию в клинической практике в качестве скрининга анеуплоидий препятствуют значительная трудоемкость и высокая стоимость сортировки фетальных клеток.
 

В настоящее время в связи с развитием методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) широкое распространение получает преимплантационная диагностика хромосомных заболеваний. Преимущество данного подхода составляет снижение терапевтических абортов, поскольку хромосомные и генные нарушения определяются на уровне ооцитов-эмбрионов и возможно перенести в полость матки неповрежденные эмбрионы. Полярное тельце ооцита или бластомер эмбриона (4–8-клеточная стадия) предварительно изолируется с помощью микроманипулятора, а затем ДНК плода исследуется с помощью FISH или ПЦР. Преимплантационная диагностика особенно показана женщинам старше 35 лет, треть ооцитов которых имеет хромосомную патологию [52]. Наиболее надежным является анализ полярных телец методом FISH, в котором используются ДНК-зонды для одновременного определения хромосом X, Y, 18, 13 и 21. Для 440 ооцитов без признаков моносомии и трисомии, отобранных с помощью FISH из 648 ооцитов, было достигнуто нормальное оплодотворение, дробление и перенос в 122 циклах ЭКО, причем беременность наступила в 18 случаях, из которых 6 завершилось нормальными родами [52]. Частота ложноотрицательных результатов вследствие недостаточной эффективности FISH paвнялacь 18,1%. Значительную часть пациентов среди тех, которые нуждаются во вспомогательных репродуктивных технологиях, составляют индивидуумы со сбалансированными транслокациями. При проведении в этой группе риска FISH-анализа 625 бластомеров, изолированных на 3-й день развития, в 33 случаях были обнаружены различные ХА.
Мозаицизм эмбрионов и контаминация ДНК спермы могут вызывать ряд проблем при определении пола и выявлении анеуплоидий с помощью ПЦР-анализа. Так, эмбрионы, ДНК которых по данным ПЦР не содержала специфичных для хромосомы Y последовательностей нуклеотидов, по данным FISH-анализа имели следующие кариотипы: 45,Х, 46,XX / 46,XY или 46,XY / 47,XYY. Показано, что в нормально развивающихся эмбрионах мозаицизм и полиплоидии наблюдаются соответственно в 3 и 3,6%, тогда как у отстающих и блокированных эмбрионов эти ХА встречаются во много раз чаще. Совершенно ясно, что у некоторых пациентов цитогенетический анализ одного бластомера не дает полную характеристику всего эмбриона, поэтому во всех случаях наступления беременности после проведения преимплантационной диагностики следует выполнять инвазивную ПД с амниоцентезом или хорионбиопсией.
Таким образом, отмечается дальнейшее интенсивное развитие базовых методов дородовой диагностики ХА: биохимического и ультразвукового оит в том, что он исключает прове скрининга, инвазивных методик для получения плодового материала, цитогенетического исследования метафазных препаратов хромосом. Активное применение методов ДНК-анализа, ПЦР и FISH обеспечивает прогресс традиционных направлений ПД и способствует практическому внедрению принципиально новых подходов – определения кариотипа по клеткам плода, циркулирующим в кровотоке матери, преимплантационной диагностики и других.



 

Заключение:

Развитие пренатальной диагностики способствует снижению рождаемости детей с хромосомными аномалиями развития, снижению инвализации населения, а значит и снижению уровня сирот, имеющих хромосомные аномалии.

Также, благодаря этим методам, появилась возможность прогнозировать состояние здоровья эмбриона. Несомненно, это большой шаг в современной медицине, который надо развивать.

Список используемой литературы:
 

1. Залетаев Д.В. Хромосомная патология у детей с олигофренией и множественными признаками дизморфогенеза. Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. М 1985; 24.
2. Кулешов Н.П. Частота возникновения и судьба хромосомных аномалий в популяции человека. Автореф. дис. ... д-ра. мед. наук. М 1979; 45.
3. Гинзбург Б.Г. О частоте синдрома Дауна. Росс вестник перин пед 1998; 6: 13–14.
4. Hiкiтчина Т.В., Бариляк I.P., Гордiенко И.Ю. Пренатальна цитогенетична дiагностика хромосомноi патологиi плоду у жiнок групи високого ризику. Цитология и генетика 1996; 30: 5: 22–26.
5. Кузнецова Т.В., Баранов А.Н., Киселева Н.В. и др. Пренатальная диагностика хромосомных болезней: десятилетний опыт. Вестник Российской Ассоциации акушеров-гинекологов 1997; 3: 95–99.
6. Снайдерс Р.Дж.М., Николаидес К.Х. Ультразвуковые маркеры хромосомных дефектов плода. Пер с англ. Медведева М.В., Михайлова А.В. М: Видар 1997; 192.
7. Salonen R., Turpeinen U., Kurki L. et al. Maternal serum screening for Down's syndrome on population basis. Acta Obstet Gynecol Scand 1997; 76: 817–821.