Ирина Эланс

Автор который поможет с любыми образовательными и учебными заданиями

Спектрофотометрический метод анализа

Содержание

Введение …………………………………………………………...... 3

1 Законы поглощения света ……………………………………….. 4

1.1 Спектрофотометрия в фарм. анализе …………………………. .. 5

1.2 Анализ по поглощению растворов стандартных образцов ……7

1.2.1 Анализ по параметрам спектров поглощения ………………. 8

1.3 Испытание на чистоту ………….…………………………….. 10

2 Анализ однокомпонентных лекарственных средств ………….. 12

2.1 Способы измерения концентрации……………………………. 14

3 Дифференциальная спектрофотометрия …………………........ 17

3.1 Анализ лекарственных смесей ……………………………….. 19

3.2 Лекарственные смеси с витаминами ………………………… 25

4 Спектрофотометры …………………………………………….... 27

Заключение ……………………………………………………........ 31

Список используемых источников ………………………………. 32

Введение

Спектрофотометрический метод анализа в ряде случаев имеет существенное преимущество перед другими методами. В частности, Спектрофотометрический метод обеспечивает высокую чувствительность измерений концентрации инертных газов, в то время как для анализа смеси инертных газов химический метод вообще неприменим, а другие физические методы либо также неприменимы, либо имеют ограниченную чувствительность.

Спектрофотометрический метод анализа основан на спектрально-избирательном поглощении монохроматического потока световой энергии при прохождении его через исследуемый раствор. Метод позволяет определять концентрации отдельных компонентов смесей окрашенных веществ, имеющих максимум поглощения при различных длинах волн, он более чувствителен и точен, чем фотоэлектроколориметрический метод. Известно, что фотоколориметрический метод анализа применим только для анализа окрашенных растворов, бесцветные растворы в видимой области спектра обладают незначительным коэффициентом поглощения. Однако многие бесцветные и слабо окрашенные соединения ( особенно органические) обладают Характерными полосами поглощения в ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра, что используют для их количественного определения. Спектрофотометрический метод анализа применим для измерения светопоглощения в различных областях видимого спектра, в ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра, что значительно расширяет аналитические возможности метода.

1 Законы поглощения света

Применение оптических методов основано на свойствах веществ поглощать световую энергию. Определения, связанные с измерением поглощения света, основаны на двух физических законах.

Закон Бугера-Ламберта связывает поглощение с толщиной слоя поглощающего вещества и выражается соотношением:

lgj°/j = kxl

где j° - интенсивность излучения, падающего на вещество

j - интенсивность излучения, прошедшего через вещество

1 - толщина слоя вещества в сантиметрах

к - показатель поглощения, величина, обратная той толщине слоя, проходя через который поток излучения ослабевает в 10 раз.

Второй закон поглощения Бера выражает связь между интенсивностью поглощения и концентрацией поглощающего вещества в растворе:

lgj°/j = μxC, где μ- константа, зависящая от способа выражения концентрации раствора с - концентрация раствора

Объединенный закон Бугера - Ламберта – Бера : lgj°/j = μxCxl

Соотношение lg j°/j известно как поглощение /А/, оптическая плотность /Д/ или как экстинкция /Е/. Соотношение j°/jx 100 называют пропусканием /Т/.

Значение μ зависит от единиц, в которых выражают концентрацию вещества и толщину слоя. Концентрацию выразить в грамм-молях на 1 л раствора, а толщину в сантиметрах, то коэффициент поглощения будет равен молярному коэффициенту поглощения. Последний выражается греческой буквой эпсилон - ε.

Если концентрация выражается в граммах вещества на 100 мл раствора, то эта величина называется удельным показателем поглощения и обозначается символом Е1см1% .

Зависимость между удельным показателем поглощения и молярным показателем поглощения определяют по формулам:

Е1см1% = εх10 М

Е = Е1см1% х М 10

где М - молекулярная масса.

1.1 Спектрофотометрия в фарм. анализе

Метод спектрофотометрии основан на способности многих органических веществ к избирательному поглощению электромагнитного излучения и широко используется для установления структуры вещества, а так же качественного и количественного анализа, испытания на чистоту.

Спектрофотометрический анализ предусматривает определение содержание вещества по поглощению им монохроматического излучения в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной области спектра. В отличие от фотометрии метод позволяет более точно измерять светопоглощение анализируемых веществ при строго определенной длине волны.

Единицей измерения длин волн в ультрафиолетовой и видимой областях спектра обычно служит нанометр (1 нм =10"7 см ). В зависимости от природы светопоглощения и разрешающей способности оптических приборов поглощения света измеряют в интервалах длин волн 185-400 нм (ультрафиолетовые спектры), 400-760 нм (видимая область спектра), 760-20000 (инфракрасные спектры). Часто инфракрасные излучения характеризуются волновым числом γ (нью) (γ =1/λ), где λ выражена в см); размерность - соответственно в см-1.

Инфракрасная спектрофотометрия, впервые введенная в ГФ10, является одним из основных современных физико-химических методов идентификации соединении, изучения строения молекул и др. Этот метод характеризуется высокой чувствительностью, полнотой информации о строении вещества.

Использование метода для идентификации сводится главным образом к визуальному сравнению ИК-спектров анализируемых веществ со спектрами стандартов, снятыми в аналогичных условиях и на тех же марках спектрофотометров. Успешному использованию ИК-спектроскопии для идентификации веществ способствует изучение атласов ИК-спектров поглощения веществ.

ГФ10 использует ИК-спектрофотометрию для идентификации фторотана, натриевых солей, метициллина и оксациллина путем сравнения со спектрами стандартных образцов. В МФ11 метод ИК-спектроскопии для идентификации кортикостероидов, сердечных гликозидов.

Светопоглощение в УФ и видимой областях спектра обладают вещества с определенной химической структурой. Основными факторами, обуславливающими поглощение света, являются наличие так называемых хромофоров, т.е. ненасыщенность (двойные, тройные связи), наличие карбонильной, карбоксильной, амидной, азо-, нитрозо-, нитро и др. функциональных групп. Известно также, что некоторые группы, не являясь хромофорными, увеличивают интенсивность окраски веществ - такие группы называют ауксохромными или ауксохромами. Типичные ауксохромы - гидроксильная и аминогруппы.

Каждая функциональная группа характеризуется поглощением в определенных областях спектра. Однако имеется ряд факторов (присутствие нескольких хромофорных групп, влияние растворителя и др.), приводящих к смещению полос поглощения в сторону больших длин волн (гипсохромное смещение). Кроме смещения может наблюдаться эффект увеличения (гиперхромный) или уменьшения (гипохромный) интенсивности поглощения.

Метод спектрофотометрии в УФ и видимой области включен в ГФ10 и МФ11 для определения подлинности, чистоты и количественного содержания лекарственных препаратов.

Качественным анализ лекарственных веществ с помощью спектрофотометрии называют установление их структуры на основании спектров поглощения.

Кроме того, под качественным анализом подразумевается так же установление подлинности лекарственных веществ.

Спектры поглощения представляют собой графическое изображение количества света, поглощаемого веществом при определенных значениях длин волн.

Для построения кривой спектра поглощения, величины длин волн наносят на ось абсцисс, а величины оптических плотностей (Д) - на ось ординат.

Характеристикой спектра поглощения вещества является поглощение максимумов (минимумов) поглощения, а так же интенсивность поглощения, что характеризуется величиной оптической плотности (Д) или удельным показателем поглощения при данной длине волны Е1см1% .

Наряду с величинами Д в УФ- и видимой областях для построения кривых спектров поглощения можно использовать такие величины удельных ( Е1см1% ) или молярных (ε) показателей поглощения.

Согласно ГФ10 и ГФ11 лекарственные вещества идентифицируют как по поглощению стандартных образцов, так и по известным параметрам спектров поглощения.

1.2 Анализ по поглощению растворов стандартных образцов

Этот метод наиболее достоверный. Он сводится к сравнению двух спектров поглощения, полученных в одних и тех же условиях. В качестве стандартного образца, если нет специальных указаний, принимается вещество, отвечающее требованиям фармакопеи.

Так, ультрафиолетовый спектр 0,0005% раствора этинилэстрадиола в спирте имеет максимумы и минимумы поглощения при тех же длинах волн, что и раствор стандартного образца одинаковой концентрации и одновременно измеренный, соответствующие величины поглощения при максимуме поглощения около 281 нм.

Этим методом по ГФ10 устанавливают подлинность натрия

о-йодгинкурата, меченного йодом 131 и натрия хромата, меченного хромом 51, в растворах для инъекций. В настоящее время идентификацию лекарственных средств по поглощению растворов стандартных образцов почти не проводят, однако именно этот метод следует рекомендовать для фармакопейных испытаний на подлинность.

1.3 Анализ по параметрам спектров поглощения

Наиболее простой способ тот, при котором указывается только положение максимумов поглощения лекарственного вещества.

В ГФ10 по положению максимумов идентифицируются ретинола ацетат в масляном растворе, рутин, цианкоболамин, хингамин и др. Указание положение максимумов является лишь ориентировочной характеристикой, так как не позволяет судить об общем виде спектра.

Значительно чаще в фармакопейных статьях приводят положение максимумов или минимумов и соответствующие им величины оптических плотностей.

Такой способ идентификации надежнее предыдущего, он встречается преимущественно в статьях ГФ11 .

Качественная характеристика лекарственных средств по длинам волн и оптической плотности:

Окситетрациклина г/х | 353 | 0,54-0,53 | 0,01н HCI | 0,002 |

Окситетрациклина дигидрат | 353 | 0,54-0,53 | 0,01н HCI | 0.002 |

Резерпин | 268 (max) 288-295 | 0,55 0,34 | Этанол 95 % | 0,002 |

В ГФ10 интенсивность поглощения чаще выражают через величину удельного показателя поглощения. По величине удельного показателя поглощения идентифицируют целый ряд лекарственного средства.

Качественная характеристика лек. средств по длинам волн и удельному показателю поглощения:

Дезоксикор-тикостерона ацетат | 240 | 430-450 | Этанол 95%| 0,001 |

Левомицетин | 278 | 290-305 | вода | 0,002 |

Норадреналина гидротартрат | 279 | 78-84 | Этанол 95% | 0,001 |

Токоферола ацетат | 285 | 42-47 | Безводный этанол | 0,001 |

Трифтазин | 258 | 610-650 | 0,01н HCI | 0,001 |

Трихомонацид | 357 | 520-560 | вода | 0,001 |

Иногда для идентификации лекарственных средств применяют отношение оптических плотностей при двух длинах волн, которые чаще всего соответствуют двум максимумам или максимуму и минимуму спектра поглощения.

Качественная характеристика лекарственных средств по длинам волн и отношению оптических плотностей:

Метициллина натриевая соль | 280 (max)264 | 1,30-1,45 | вода | 0,01 |

Натрия п-аминосалицилат | 265299 | 1,50-1,56 | | 0,001 |

Феноксиметил-пенициллин | 268274 | 1,21-1,24 | вода + NаНСОз | 0,02 |

Цианокобаламин в растворе для инъекций | 361548361278 | 3,0-3,41,7-1,83 | вода вода | 0,0020,002 |

В отдельных случаях лекарственные средства идентифицируют по разности оптических плотностей (Д1-Д2).

Бензилпенициллина калиевая соль Д26З-Д28О Д.б. не менее 0,72 .

Для идентификации лек. средств пригодны также наборы (атласы) спектров поглощения известных веществ. Чтобы быстрее отыскать необходимые данные, спектры поглощения шифруют.

Существует ещё один способ идентификации, который заключается в. сопоставление спектров поглощения растворов соединении, полученных в результате химического превращения исследуемого и известного вещества. Совпадение формы спектра поглощения смеси по спектрам поглощения каждого из веществ подтверждает их идентичность.

Качественный анализ лекарственных средств на основании одних спектров поглощения в УФ области может привести к ошибкам. Поэтому параметры спектров поглощения приводят в качестве дополнительных критериев установления подлинности. Однако часто их рассматривают как основные критерии наряду с другими показателями. Поэтому необходимо всегда стремиться к увеличению объема информации в результатах спектрофотомегрических исследовании.

Идентификация будет более надежной, если установить одинаковое влияние на спектры поглощения различных факторов (растворителя, концентрации ионов водорода, температура и др.)

1.3 Испытание на чистоту

Применение спектрофотометрии в УФ области для проверки доброкачественности фарм. препаратов является ценным в случаях, когда примеси или продукты разложения поглощают в области, отличной от исследуемого вещества.

Указываемые в фармакопейных статьях величины поглощения, определяющие предельное содержание примеси как «не более», устанавливается эмпирическим путем.

Таким путем определяют примесь адреналона, имеющего максимум при длине волны 310 нм в адреналине гидрохлориде, максимум поглощения которого при длине волны 278 нм.

ГФ10 ст. 25: оптическая плотность 0,05 % раствора препарата адреналина гидрохлорида в 0,01н растворе соляной кислоты при 310 нм не должна превышать 0,1.

Предел содержания поглощающих примесей может быть установлен по величине отношения поглощения при различных длинах волн.

Примеры: ГФ10 ст.192. Поглощение примеси цианакобаламина определяют по величине отношения оптических плотностей 0,003% раствора препарата при длинах волн 361 нм, 548 нм ,278 нм.

Д361/Д548=3,0-3,4 ; Д361/Д278=1,7-1,88

ГФ10 ст.587. Примесь кверцетина в рутине определяют по величине отношений оптических плотностей при длинах волн 375 нм, 362 нм.

Д375/Д362,5= Д.б. не более 0,879.

Количественный анализ

Метод спектрофотометрии в УФ-области широко используется для количественного определения лекарственных препаратов и их лекарственных форм.

Идеальное вещество для таких измерении должно иметь четко выраженную полосу поглощения с широким максимумом и со значительной величиной поглощения при максимум.

Основным условием для количественного анализа является соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера в пределах указанных концентраций.

2. Анализ однокомпонентных лекарственных средств.

Приступая к методике спектрофотометрического определения лекарственного вещества, следует изучить его спектр поглощения в избранном растворителе.

Для этого определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре в интервале длин волн от 220 нм до 400 нм через каждые 5 нм. Для уточнения максимума и минимума поглощения, измерение следует проводить через 1 нм. По данным измерения строят график зависимости оптической плотности от длин волны.

λ (нм)| Д | λ (max) | λ (нм) | Д | λ (max) |

220 | 0,478 | | 270 | 0,544 | |

225 | 0,316 | | 275 | 0,573 | λ (max) |

230 | 0,218 | | 280 | 0,562 | |

235 | 0,188 | | 285 | 0,530 | |

240 | 0,192 | | 290 | 0,474 | |

245 | 0,219 | | 300 | 0,335 | |

250 | 0,267 | | 310 | 0,207 | |

255 | 0,334 | | 320 | 0,107 | |

260 | 0,415 | | 330 | 0,057 | |

265 | 0,490 | | | | |

λ (нм) | Д | λ (max) | λ (нм) | Д | λ (max) |

270 | 0,544 | | 275 | 0,570 | |

271 | 0,550 | | 276 | 0,571 | λ (max) |

272 | 0,558 | | 277 | 0,570 | |

273 | 0,561 | | 278 | 0,569 | |

274 | 0,565 | | 279 | 0,563 | |

0 | 220 | 240 | 260 | 280 | 300 | 320 | 340 |

Изучив спектр исследуемого вещества, приступают к выбору волны для проведения анализа.

Концентрацию вещества можно определить при любой длине волны и результаты д. б. одинаковыми, однако точную установку одной и той же длины волны производят с таким расчетом, чтобы при незначительных отклонениях изменение интенсивности поглощения было небольшим. В этом случае погрешность в отсчете длины волны не будет иметь существенного значения. Максимальная воспроизводимость рассчитывается обычно при измерениях поглощения в максимуме или минимуме широкой полосы. Здесь ошибка при установке длины волны на 1 -2 см почти не влияет на результат определения.

Проверка подчинения поглощения исследуемым раствором закону Бугера-Ламберта-Бера может быть осуществлена двумя способами - расчетным и графическим.

Готовят серию стандартных растворов с такой концентрацией. чтобы оптические плотности лежали в пределах 0,2-0,8 . При одной и той же длине волны, соответствующей максимуму поглощения данного вещества, определяют зависимость между концентрацией и оптической плотностью .

Для определения вещества, определяют зависимость между концентрацией и оптической плотностью.

№ раствора | Концентрация, % | Оптическая плотность, Д | Е1см1% |

1 | 0.0005 | 0,122 | 244 |

2 | 0.001 | 0,280 | 280 |

3 | 0.0015 | 0,403 | 272 |

4 | 0,002 | 0,542 | 271 |

5 | 0,0025 | 0,680 | 272 |

Е1см1% = Е1+Е2+Е3+Е4+Е56 = 275

А) расчетный метод сводится к установлению показателя поглощения. Его вычисляют по формуле:

Е1см1% = ДС

Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, показатель поглощения данного вещества является величиной постоянной и не зависит от концентрации. Поглощения растворов подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера только в границах концентраций, при которых числовые значения показателей поглощения являются постоянными или находятся в пределах допустимых отклонений.

Б) калибровочная кривая в границах этих концентраций представляет собой прямую линию. Точность метода зависит от наклона прямой: чем больше наклон, тем выше точность

2.1 Способы измерения концентрации

Наиболее точное измерение интенсивности поглощения достигается при пропускании /Т/ 36,8 %, что соответствует оптической плотности 0,484. Оптимальную концентрацию для анализа вычисляют по формуле:

С = ДЕ1см1% ×l /Т/ = 0,434Е1см1% ×l

Наиболее точно измерения при Т = 36,8 % Д = 0,434

Иначе говоря, чтобы вычислить концентрацию вещества для анализа, следует 0.434 разделить на значение удельного показателя поглощения данного раствора вещества при избранной длине волны.

Концентрацию растворов можно измерять несколькими методами:

* по удельному показателю поглощения;

* по стандартному образцу;

* по калибровочной кривой;

* методом дифференциальной спектрофотометрии и др.

Для количественного определения с использованием удельного показателя поглощения готовят раствор определяемого вещества с концентрацией, которая находится в пределах подчинения законам светопоглощения. Оптическую плотность приготовленного раствора измеряют в максимуме поглощения.

Содержание препарата в процентах (X1) или в граммах (Х2) вычисляют по формулам:

С = ДЕ1см1% ×l (1) Х1 = Д×УЕ1см1% ×a (2) Х2 = Д×У×РЕ1см1% ×a×100

где Д - оптическая плотность приготовленного раствора;

Е1см1% - удельный показатель поглощения;

У - разведение;

а - навеска, или объем (г или мл);

Р - общая масса или объем лекарственной формы.

Основным недостатком этого метода является общеизвестный факт, что различные спектрофотометры, даже одной и той же модели и одного производства дают значительные отклонения по величине поглощения одного и того же стандартного раствора.

По ГФ X этим методом определяются: цианокобаламин: ст. 192. раствор ционокобаламина для инъекций: ст. 193.

2) Более достоверные и воспроизводимые результаты обеспечивают сравнение испытуемого вещества с поглощением стандартного образца, определенного в тех же условиях.

Согласно положений ГФX, спектрофотометрическое количественное определение содержания лекарственного вещества при анализе индивидуальных веществ должно быть связано с применением специально приготовленного стандартного образца этого вещества. Примерами являются стероидные вещества, включенные в ГФX (кортизона ацетат, тестостерона пропионат, преднизолон, прегнин). При количественном анализе лекарственных форм, если нет специальных указаний, допускается использовать в качестве стандартного образца вещество, отвечающее всем требованиям фармакопеи. При расчетах такой стандартный образец принимается за 100 %, если нет других указаний (адреналина гидротартрат в растворе для инъекций, аминазин, пропазин в драже, левомицетина стеарат, дипрофиллин, синэстрол, хингамин в таблетках).

Расчет количественного содержания индивидуального вещества в процентах (X) использовании стандартного образца производится по формуле:

Х1 = Д1×С0×У×100Д0×a (4)

где До - оптическая плотность раствора стандартного образца;

Д1 - оптическая плотность испытуемого раствора;

Со - концентрация раствора стандартного образца;

У - разведение;

а - навеска, г.

Содержание вещества в единой таблетке в граммах (Х2) считают на среднюю массу таблетки. Рассчитывают по формуле:

Х2 = Д1×С0×У×РД0×a (5)

где Р - средняя масса таблетки.

Значение остальных символов см. формулу 4.

Недостаток этого метода - мало стандартов.

Метод калибровочной кривой

Если количественное измерение выполняется достаточно часто можно вместо стандартного раствора образца использовать калибровочный график, полученный для соответствующего стандартного образца. Таким графиком можно пользоваться, когда для испытуемого вещества поглощение пропорционально концентрации в пределах 75-125 % от окончательной концентрации, используемой в количественном определении. Такие калибровочные графики надо часто проверять и каждый раз готовить заново для нового прибора и новой серии реактивов.

3 Дифференциальная спектрофотометрия

В последние годы для расширения интервала определяемых концентраций и для повышения точности анализа применяется так называемая дифференциальная спектрофотометрия.

Ошибки при обычной спектрофотометрии составляют примерно 2%. При дифференциальной спектрофотометрии величина относительной ошибки снижается до десятых долей процента.

Сущность метода состоит в том, что оптические плотности исследуемых растворов измеряют не по отношению к чистому растворителю с нулевым поглощением, а по отношению к раствору определяемого вещества с концентрацией Со, близкой к концентрации Сх исследуемого раствора.

Дифференциальная спектрофотометрия позволяет определять более высокие концентрации.

Раствор цианокобаламина для инъенкций.

Состав: Цианокобаламина 30, 100, 200 или 500 мг

Раствор натрия хлорида изотонического 0,9 % до 1 л

Раствор фильтруют, разливают в ампулы нейтрального стекла по 1 мл и стерилизуют текучим паром при 1000в течение 30 минут.

Описание. Прозрачная жидкость от слабо розового до ярко-красного цвета.

Подлинность. 0,002 % раствор препарата имеет максимум поглощения при 278 + 1 нм; и 548 + 2 нм.

Отношение Д при 361 нмД при 548 нм должно быть от 3,0 до 3,4

Отношение Д при 361 нмД при 278 нм должно быть от 1,7 до 1,88

Количественное определение. Препарат разводят водой до содержания около 0,02 мг цианокобаламина в 1 мл, измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 361 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве контрольного раствора применяют воду.

Содержание цианокобаламина в мг (X) препарата вычисляют по формуле:

Х = Д×10×У207×У1

где Д - оптическая плотность испытуемого раствора;

207 - удельный показатель поглощения Е чистого цианокобаламина безводного при длине волны 361 нм;

У - объем препарата, взятый для разведения, в мл;

У1 - конечный объем раствора в мл.

Содержание цианокобаламина в 1 мл препарата соответственно должно быть 0,027-0,033 мг; 0,09-0,11 мг; 0,18-0,22 мг или 0,45-0,55 мг.

Хранение. В защищенном от света месте.

УФ-спектрофотометрия с успехом используется не только для количественного определения фармацевтических препаратов, но и для анализа сложных лекарственных смесей.

Анализ лекарственных смесей методом УФ-спектрофотометрии имеет ряд преимуществ перед объемно-аналитическими определениями, из которых основные- быстрота выполнения анализа, малый расход лекарственной смеси на анализ, высокая чувствительность, точность и специфичность метода, что часто дает возможность определения без разделения двух ингредиентов смеси и т.д.

Спектрофотометрический метод анализа 📙 Реферат → 🆔 260741